PCR-DGGE分析東北傳統發酵酸菜中乳酸菌多樣性

叢 敏，李欣蔚，武俊瑞，岳喜慶

（沈陽農業大學食品學院，遼寧 沈陽 110161）

PCR-DGGE分析東北傳統發酵酸菜中乳酸菌多樣性

叢 敏，李欣蔚，武俊瑞，岳喜慶*

（沈陽農業大學食品學院，遼寧 沈陽 110161）

以傳統自然發酵的酸菜為研究對象，采用聚合酶鏈式反應-變性梯度凝膠電泳（polymerase chain reactiondenatured gradient gel electrophoresis，PCR-DGGE）技術監測酸菜發酵過程中細菌的動態變化，計算不同發酵時間細菌的多樣性指數，并對圖譜特異性條帶進行克隆、測序、構建系統發育樹。結果表明：酸菜發酵第40天多樣性指數達最高值，說明此時細菌種群多樣性最高；發酵過程中含豐富的乳酸菌，主要的優勢菌群為乳桿菌屬，包括植物乳桿菌、鼠李糖乳桿菌、短乳桿菌、干酪乳桿菌、棒狀乳桿菌、戊糖乳桿菌、唾液乳桿菌以及Iwatensis乳桿菌。其中發酵前期的優勢菌群為乳酸乳球菌和戊糖乳桿菌，而植物乳桿菌為發酵中后期的優勢菌種。

酸菜；變性梯度凝膠電泳；多樣性指數；乳酸菌；系統發育樹

酸菜作為我國東北地區一種獨特的傳統乳酸蔬菜發酵制品，具有悠久的歷史，其以營養豐富、酸鮮脆嫩、解膩開胃等特點深受廣大群眾的喜愛。酸菜自然發酵汁液中富含乳酸菌活菌，近年來由于乳酸菌特殊的生理活性和營養功能，日益受到人們的重視[1-2]。很多研究學者對乳酸菌進行分離鑒定，但研究方法現在仍多沿用形態特征、生理生化反應等傳統方法，該方法不僅實驗周期長，而且不能對分離物種精確的鑒定、不能反映分離物間的系統發育關系、更不能獲得微生物多樣性的真正概貌，缺乏全面性、準確性及可靠性[3-5]。自1993年Muyzer等[6]首次將聚合酶鏈式反應-變性梯度凝膠電泳（polymerase chain reaction-denatured gradient gel electrophoresis，PCR-DGGE）引入微生物生態學領域以來，該技術已成為研究微生物遺傳多樣性和種群結構及其菌群差異的一種先進手段。現已廣泛應用于食品領域，如監測食品微生物在時間及空間上的動態變化[7-9]、鑒定功能微生物和病原菌[10-12]、評價和控制食品質量[13-14]等。本實驗采用PCR-DGGE分子生物學技術，結合16S rDNA同源性分析及生物信息學手段，對傳統自然發酵酸菜中乳酸菌進行全面系統研究，揭示不同時期的乳酸菌菌落結構的真實狀態，挖掘豐富的微生物資源并確定不同發酵階段的優勢菌群，旨在為進一步深入研究和開發分離自然發酵酸菜中有益乳酸菌提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大白菜、食鹽 沈陽農業大學農貿市場。

Marker 寶生物工程（大連）有限公司；DNA提取試劑盒 美國Mo-Bio公司；PCR引物以及所用酶試劑北京寶杰羅生物科技有限公司；PMD19-T載體 日本TaKaRa公司。

1.2 儀器與設備

5804R高速冷凍離心機 德國Eppendorf公司；DYY-8C型穩流穩壓電泳儀 上海越磁電子科技有限公司；PCR擴增儀、變性梯度凝膠電泳儀、凝膠成像分析系統、DcodeTM的基因突變檢測系統 美國Bio-Rad公司。

1.3 方法

1.3.1 實驗前處理

酸菜腌制過程：大白菜（去除黃葉、腐爛葉）→晾曬→開水漂燙（3～5 min）→入缸、壓實→加入質量分數3%的淡鹽水在室溫條件下進行自然發酵，發酵時間為60 d。根據酸菜的傳統發酵工藝進行自然發酵，分別采集酸菜第3、6、9、12、15、18、21、25、30、35、40、50、60天的發酵液（每組取3 個平行）作為研究對象，將采集的樣品用無菌紗布過濾以去除發酵液中的雜質，并保存于－20 ℃，備用。

1.3.2 樣品中總DNA的提取

將酸菜發酵液在－4 ℃，12 000 r/min條件下離心5 min，棄上清取沉淀，用DNA提取試劑盒提取樣品中總DNA。

1.3.3 PCR擴增

以提取的總DNA為模板，采用16S rDNA V3區通用引物：338F：5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′；GC-534R：5′-CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGG GGCGGGGGCACGGGGGG（ATTACCGCG GCT GCTGG）-3′，進行16S rDNA的PCR擴增，擴增產物片段長約250 bp。采用50 μL擴增體系，包括：10hPCR Buffer 5 μL、dNTP Mixture（各2.5 mmol/L）4 μL、引物338F（20 μmol/L）1 μL、引物534R（20 μmol/L）1 μL、模板DNA2.5 ng、TaKaRa rTaq酶（5 U/μL）0.25 μL、ddH2O補至50 μL。反應參數：94 ℃預變性10 min，94 ℃變性1 min，55 ℃退火1 min（每個循環降低0.1 ℃），72 ℃延伸90 s，最終72 ℃延伸10 min，共30 個循環。PCR反應的產物用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測[15]。

1.3.4 DGGE與條帶測序

采用Bio-Rad公司DcodeTM的基因突變檢測系統對樣品DNA的PCR反應產物進行變性梯度凝膠電泳。采用的凝膠質量分數為8%，變性范圍為30%～60%，電泳條件為150 V，420 min[16]。電泳結束后采用銀染進行染色，將銀染好的凝膠用掃描儀成像，得到PCR-DGGE圖譜，并對特征性條帶進行切膠，條帶回收，回收的條帶進行一次無GC-夾板的PCR擴增，擴增子與PMD19-T載體連接進行克隆，每個條帶隨機挑取3 個陽性克隆進行測序分析，將其菌液送北京寶杰羅生物科技有限公司測序。

1.4 數據分析與處理

將酸菜發酵液微生物群落DNA的PCR-DGGE圖譜用Gel-Pro Analyzer 4.5軟件進行處理，通過分析樣品電泳條帶的數目和亮度，來計算樣品中微生物多樣性指數和菌種相對數量的多少。根據各樣品在DGGE圖譜中的信息對其相似性進行聚類分析。其公式如下[17]。

式中：H為香農指數；D為豐富度指數；Ni為樣品DGGE圖譜中第i條條帶強度；N為該樣品條帶總強度；EH為均勻度指數；S為某個樣品中所有條帶數目的總和。

測得的序列登錄美國國立生物技術信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）數據庫進行BLAST同源性對比分析（http://www.ncbi.nlm. nih.gov/BLAST/）。采用Mega 4.1軟件進行分析，構建系統進化樹，分析親緣關系及相似性。

2 結果與分析

2.1 細菌16S rDNA 的V3區PCR擴增

細菌16S rDNA 的V3區的PCR擴增產物經1.0%瓊脂糖凝膠電泳后得到的電泳圖見圖1。以338F和534R為引物的擴增產物大小在250 bp左右位置，判斷其為目的片段。

圖1 酸菜樣品16S rDNA的V3區的PCR擴增結果Fig.1 PCR amplification results of 16S rDNA from sauerkraut samples

2.2 PCR擴增產物DGGE圖譜分析

圖2 酸菜樣品細菌總DNA的DGGE圖譜Fig.2 DGGE profile of PCR-amplified 16S rDNA （V3） fragments from bacteria in sauerkraut samples

DGGE電泳條帶的多少可以直觀地反映樣品中細菌菌落的遺傳多樣性，而條帶的亮度則在一定程度上反映該種細菌數量的多少[18]。從整個圖譜（圖2）結果來看，不同時期的發酵液具有較豐富的細菌多樣性。發酵前期條帶數量較少，而發酵中后期條帶數量有所增加，說明隨著發酵時間的延長，微生物數量與種類也發生了一定的變化。如泳道1在所有泳道中條帶數量最少，且條帶亮度較弱，表明酸菜在發酵第3天時細菌種類較少。隨著發酵時間變化，圖譜條帶數目、各條帶的強度和遷移率均存在一定程度的差異，表明不同發酵時期的優勢菌群各不相同。如條帶1強度最高，且在泳道3至泳道14中均發現條帶1，表明該條帶所對應的菌為酸菜發酵中后期的優勢菌群，在發酵過程中起主導作用。

2.3 細菌種群多樣性指數分析

根據電泳圖譜中每條條帶的信息，對各樣品中的細菌多樣性指數、豐富度指數和均勻度指數指標進行了綜合分析。由表1可知，不同時期樣品中細菌種群的香農多樣性指數、豐富度指數都有較大的差異。第3、6天樣品的多樣性指數和豐富度指數較高可能是由于發酵前期原料引入的雜菌較多所致，之后隨著乳酸菌數量的增加抑制了某些雜菌的生長，使其數值保持相對穩定，而第40天時達到最高值，分別為3.457和6.077，表明此時細菌種群多樣性最高。這個結果與DGGE圖譜的直觀觀測結果相符。

表1 不同樣品細菌種群的多樣性指數、均勻度指數及豐度指數Table 1 Bacterial diversity indexes of sauerkraut samples

2.4 DGGE指紋圖譜聚類分析

圖3 酸菜發酵液中細菌的DGGE指紋圖譜聚類分析Fig.3 Cluster analysis of DGGE profiles for bacteria communities of sauerkraut

在DGGE指紋圖譜中，不同樣品共有條帶數目的多少可以反映不同樣品之間細菌群落相似性，通過計算群落相似性系數得到細菌群落之間差異的信息。聚類分析類群的劃分顯示出不同酸菜樣品中細菌組成之間的相似性和親緣關系。由圖3可知，圖中橫軸代表差異率，該值越小表明細菌種群結構的相似性越高。總體上看，所有樣品之間的差異率較低，表明各樣品細菌的種群結構均有較高的相似性。酸菜發酵前9 d（編號1～3）的差異率約為0.023，即其同源性為97.7%；發酵第12～35天（編號4～11）的同源性約為98.1%；而發酵第40～60天（編號12～14）的同源性約為96.6%。由此可以看出酸菜在每個發酵階段具有極為相似細菌種群結構。

2.5 酸菜樣品中乳酸菌PCR-DGGE條帶測序結果分析

切取酸菜樣品細菌16S rDNA的PCR-DGGE圖譜中18 個優勢條帶，對其編號、切割、回收重新擴增、克隆后測序。并登錄NCBI數據庫進行BLAST同源性對比分析，比對結果如表2。采用鄰接法（Neighbor-Joining）構建系統進化樹，自展數（Boot Strap）為1 000（圖4）。

表2 酸菜樣品中乳酸菌PCR-DGGE條帶測序結果Table 2 Sequencing results for lactic acid bacterial PCR-DGGE bands

所有序列與數據庫中16S rDNA序列的相似性在99%～100%之間，根據NCBI比對結果，從自然發酵酸菜液中分離的乳酸菌屬于乳桿菌屬、乳球菌屬，其中乳桿菌屬為主要優勢菌屬，包括植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）、鼠李糖乳桿菌（Lactobacillus rhamnosus）、乳酸乳球菌（Lactococcus lactis）、短乳桿菌（Lactobacillus brevis）、干酪乳桿菌（Lactobacillus casei）、棒狀乳桿菌（Lactobacillus coryniformis）、戊糖乳桿菌（Lactobacillus pentosus）、唾液乳桿菌（Lactobacillus salivarius）以及Iwatensis乳桿菌。發酵前期的優勢菌群為L. lactis和L. pentosus，而L. plantarum為發酵中后期的優勢菌種。自20世紀90年代開始，許多研究學者們開始對酸菜發酵過程中微生物進行研究[19]。通過傳統分離培養與形態學鑒定相結合方法已從發酵體系中檢出分離到的常見乳酸菌包括L. plantarum、L. brevis、稍小乳桿菌（Lactobacillus minor）、發酵乳桿菌（Lactobacillus fermentum）、L. rhamnosus、耐酸乳桿菌（Lactobacillus acetotolerans）、L. casei和L. harbinensis等[20-22]。通過傳統分離與分子生態學技術鑒定相結合的方法研究發現，所分離的乳酸菌由乳桿菌屬、片球菌屬、明串珠菌屬和魏斯氏菌屬構成[23]。所鑒定的乳桿菌屬包括L. plantarum、L. brevis、羅伊氏乳桿菌（Lactobacillus reuteri）和清酒乳桿菌（Lactobacillus sakei）、彎曲乳桿菌（Lactobacillus curvatus）、腸膜明串珠菌屬（Leuconostoc mesenteroides）、L. fermentum等[24-25]。本研究中發現的L. coryniformis、L. salivarius、L. pentosus、L. iwatensis在自然發酵酸菜中利用傳統方法和分子生態學方法均并未分離到。

圖4 酸菜中乳酸菌的系統發育樹Fig.4 Phylogenetic tree of lactic acid bacteria in sauerkraut

由圖4可知，條帶2-2與L. brevis具有較高的親緣關系，序列相似性達98%；條帶15-2與L. casei有較高的親緣關系，序列相似性為100%；條帶10-3、8-1與L. lactis有較高的親緣關系，序列相似性為100%；條帶1-2、17-2、3-2、12-1與L. plantarum和L. pentosus屬于一類群，3-1、2-1、15-1、7-1與L. iwatensis、L. rhamnosus、L. coryniformis、L. salivarius屬于一類群。

3 結 論

本實驗采用16S rDNA結合PCR-DGGE技術對自然發酵酸菜發酵液中乳酸菌進行了多樣性研究，結果表明，在酸菜發酵第40天時細菌多樣性指數以及豐富度指數達最大值，分別為3.457和6.077，表明此時細菌種群多樣性最高；所測序列與乳酸菌已知16S rDNA V3區序列的相似性高達99%～100%；同時酸菜發酵過程中含有豐富乳酸菌，主要的優勢菌群為乳桿菌屬，其中發酵前期的優勢菌群為L. lactis和L. pentosus，L. plantarum為發酵中后期的優勢菌種。本研究中發現的L. coryniformis、L. salivarius、L. pentosus、L. iwatensis在自然發酵酸菜中利用傳統方法和分子生態學方法均并未分離到。這些結果直觀展現出傳統自然發酵酸菜中乳酸菌的多樣性，為發掘優良乳酸菌發酵劑以及實現發酵酸菜產業的規模化、標準化提供了理論支持。

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PCR-DGGE Analysis of Lactic Acid Bacteria Diversity of Chinese Traditional Sauerkraut in Northeast China

CONG Min, LI Xinwei, WU Junrui, YUE Xiqing*
(College of Food Science, Shenyang Agricultural University, Shenyang 110161, China)

The traditional Chinese sauerkraut obtained by natural fermentation was analyzed by polymerase chain reactiondenatured gradient gel electrophoresis (PCR-DGGE) to monitor the dynamic change of lactic acid bacteria during the fermentation process. Meanwhile, the bacterial diversity index was calculated, and the representative bands were cloned and selected to be sequenced for the construction of a phylogenetic tree based on their sequences. The results indicated that the highest bacterial species diversity was found on the 40thday of fermentation. Lactic acid bacteria was abundant during the fermentation process, and lactobacillus was the dominant population, including Lactobacillus plantarum, Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus brevis, Lactobacillus casei, Lactobacillus coryniformis, Lactobacillus pentosus, Lactobacillus salivarius, and Lactobacillus iwatensis. Lactococcus lactis and Lactobacillus pentosus were the predominant lactic acid bacteria in the early stage of fermentation, while Lactobacillus plantarum was the predominant strain in the middle and late stages.

Chinese sauerkraut; denatured gradient gel electrophoresis (DGGE); diversity index; lactic acid bacteria; phylogenetic tree

10.7506/spkx1002-6630-201607015

TS201.3

A

1002-6630（2016）07-0078-05

叢敏, 李欣蔚, 武俊瑞, 等. PCR-DGGE分析東北傳統發酵酸菜中乳酸菌多樣性[J]. 食品科學, 2016, 37(7): 78-82. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201607015. http://www.spkx.net.cn

CONG Min, LI Xinwei, WU Junrui, et al. PCR-DGGE analysis of lactic acid bacteria diversity of Chinese traditional sauerkraut in northeast China[J]. Food Science, 2016, 37(7): 78-82. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/ spkx1002-6630-201607015. http://www.spkx.net.cn

2015-07-01

國家自然科學基金面上項目（31370502）；國家高技術研究發展計劃（863計劃）項目（2011AA100902）

叢敏（1991—），女，碩士研究生，研究方向為動物性食品加工。E-mail：731716246@qq.com

*通信作者：岳喜慶（1966—），男，教授，博士，研究方向為動物性食品加工。E-mail：yxqsyau@126.com