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蒸汽爆破預處理對粉葛總黃酮及抗氧化性的影響

2016-11-14 02:56:08易軍鵬王新勝朱文學
食品科學 2016年9期
關鍵詞:黃酮

張 棋,易軍鵬,*,李 欣,王新勝,李 冰,朱文學

(1.河南科技大學食品與生物工程學院,河南 洛陽 471023;2.河南科技大學化工與制藥學院,河南 洛陽 471023)

蒸汽爆破預處理對粉葛總黃酮及抗氧化性的影響

張 棋1,易軍鵬1,*,李 欣2,王新勝2,李 冰1,朱文學1

(1.河南科技大學食品與生物工程學院,河南 洛陽 471023;2.河南科技大學化工與制藥學院,河南 洛陽 471023)

實驗選取爆破壓力1.0、2.0 MPa,維持壓力時間30、40、60、80 s,對粉葛進行預處理。利用紫外分光光度法表征爆破前后總黃酮的變化,旨在探討蒸汽爆破預處理對粉葛總黃酮及抗氧化性的影響。抗氧化活性利用1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl,DPPH)清除率進行評價。結果表明:經過蒸汽爆破預處理后,粉葛的總黃酮提取量、甲醇提取物得率和抗氧化性得到顯著提高。在最優處理條件下,總黃酮(以葛根素計)提取量達到5.43 mg/g,是未經預處理粉葛提取量的2.32 倍;甲醇提取物得率為16.92%;抗氧化活性得到顯著增加,DPPH清除活性的半數抑制濃度(50% inhibitory concentration,IC50)由30.65 g/L降低至10.10 g/L。將蒸汽爆破預處理應用于粉葛活性物質的提取,可實現提取量和抗氧化能力的有效提高。

蒸汽爆破;粉葛;總黃酮;抗氧化性

粉葛(Puerariae thomsonii Radix)為豆科葛屬藤本植物甘葛藤(Pueraria thomsonii Benth.)的干燥根,始載于《神農本草經》,是我國常用中藥。粉葛自古與野葛同做葛根使用,現代研究發現粉葛與葛根(野葛)高效液相色譜(high performance liquid chromatography,HPLC)指紋圖譜存在較大差別[1],2005版《中國藥典》將粉葛與葛根分列記載。研究表明粉葛中的化學成分含有異黃酮、三萜類、淀粉及礦物元素等[2]。現代藥理研究確認粉葛總黃酮為其主要藥效成分,具有降低血壓、抗氧化、抗癌等作用。葛根素則可以清除自由基、抗脂質過氧化[3-4]。因此,粉葛受到了制藥行業、食品行業,尤其是保健品行業的關注。

粉葛總黃酮的提取有傳統提取方法如醇回流提取法,提取新技術如超聲提取[5]、微波輔助提取[6]等。本課題組前期研究表明[7],總黃酮提取量達到相近水平時,熱回流提取所需的時間遠遠長于超聲或微波輔助提取所需的時間。但這些提取新技術因為操作復雜、高成本等原因限制了其工業化的應用。

蒸汽爆破技術是將樣品在高溫、高壓條件下處理,使高溫飽和蒸汽快速滲透到植物細胞中,并通過瞬間泄壓,將熱能轉化為機械能,同時發生類酸性水解,使植物組織的細胞破裂、結構破壞,以便于后續的加工、處理,是一種物理化學預處理手段[8-9]。

蒸汽爆破技術,起初應用于人造纖維板的生產,后來多用于秸稈等木質纖維素原料的預處理、動物飼料加工[10-11],進而推廣到煙草加工、中草藥提取、油脂提取、羽毛角蛋白提取等行業領域[12-15]。付小果等[16]在研究直接固態同步糖化發酵乙醇,提取發酵剩余物中葛根黃酮時,將蒸汽爆破技術應用于葛根處理。但仍未見有對粉葛蒸汽爆破處理后,研究其活性成分及抗氧化活性變化的報道。本實驗探討了蒸汽爆破預處理對粉葛總黃酮以及抗氧化活性的影響,對蒸汽爆破技術在促進藥食兩用資源的高值化利用,具有重要的理論和現實意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

粉葛購自鄭州瑞龍制藥股份有限公司,經新鄉醫學院藥學院藥用與生藥學教研室吳艷芳副教授鑒定為甘葛藤(Pueraria thomsonii Benth.)的干燥根。

1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl,DPPH) 美國Sigma公司;葛根素(批號110752-201313,純度95.5%) 中國食品藥品檢定研究院;5-羥甲基糠醛(批號S27M6G2,純度98%)上海源葉生物生物科技有限公司;糠醛(純度99.5%)天津光復精細化工研究所;甲醇、無水乙醇(分析純)天津德恩化學試劑廠;乙腈(色譜級) 西隴化工股份有限公司。

1.2 儀器與設備

QBS-80型蒸汽爆破機 鶴壁正道生物能源有限公司;SHZ-D(III)循環水真空泵 鄭州長城科工貿有限公司;RE-52A旋轉蒸發儀 上海亞榮生化儀器廠;UV-2400紫外-可見分光光度計 上海舜宇恒平科學儀器有限公司;FA1004型分析天平 上海上平儀器有限公司;JSM-5610LV 掃描電子顯微鏡 日本電子株式會社;1260高效液相色譜儀 美國安捷倫公司。

1.3 方法

1.3.1 粉葛蒸汽爆破預處理

將干燥的粉葛用蒸餾水預浸泡5 h,一部分放入蒸汽爆破機物料倉中,通入飽和蒸汽,壓力選取1.0、2.0 MPa,維壓時間選取30、40、60、80 s,在極短的時間內(0.087 5 s)[10]完成泄壓,實現蒸汽爆破;另一部分為空白對照。將處理后的樣品收集,40 ℃真空干燥,粉碎過60 目篩,置于避光通風處,待分析。

1.3.2 粉葛微觀結構觀察

將干燥的粉葛樣品用導電膠帶黏到樣品臺上,使用離子濺射技術對表面進行噴金處理,用掃描電子顯微鏡觀察蒸汽爆破預處理對粉葛微觀結構的影響。

1.3.3 總黃酮物質的提取

1.3.3.1 最大吸收波長的選擇

取葛根素、糠醛、5-羥甲基糠醛標準溶液和適宜質量濃度樣品提取液,于220~450 nm波長范圍內掃描,波長間隔為1 nm。

1.3.3.2 葛根素標準曲線的繪制

精密稱取葛根素標準品4.3 mg,甲醇溶解并定容至100 mL,得到質量濃度為43 μg/mL的葛根素標準液。吸取葛根素標準溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL分別置于10 mL比色管中,各加甲醇溶液1.0 mL,加去離子水稀釋至刻度,搖勻,測定250 nm波長處吸光度。以吸光度值為縱坐標,葛根素質量濃度為橫坐標,繪制標準曲線,得回歸方程:y=0.014 5x+0.003 7(R2=0.999 7)。

1.3.3.3 總黃酮的提取

準確稱取爆破粉葛與對照組粉葛各2.0 g,分別置于100 mL錐形瓶中,加入70%甲醇40 mL,65 ℃回流提取1 h,抽濾得提取液。殘渣按上述方法重復提取1 次,合并2 次濾液,減壓濃縮至浸膏,甲醇定容至50 mL,作為提取液。取40 mL提取液,減壓濃縮,真空冷凍干燥,計算甲醇提取物的得率,計算公式如下。

式中:m為40 mL提取液凍干后的質量/g;m0為提取時所用粉葛的質量/g。

剩余提取液用于測定DPPH自由基清除能力和總黃酮提取量。取0.2 mL樣品液于10 mL比色管中,加甲醇1.0 mL,去離子水稀釋至刻度,搖勻,在250 nm波長處測定吸光度,根據葛根素標準曲線計算總黃酮提取量,結果以葛根素當量表示(mg葛根素/g)。

1.3.4 粉葛甲醇提取液中糠醛、5-羥甲基糠醛含量的測定

采用HPLC外標法定量測定待測樣品液中糠醛與5-羥甲基糠醛含量。

HPLC色譜條件:ZORBAX SB-C18色譜柱(250 mm×4.6 mm,5 μm);柱溫:30 ℃;流速:1.0 mL/min;進樣量:10 μL;流動相:乙腈-0.1%乙酸水溶液(15∶85,V/V);檢測波長:278、284 nm。

1.3.5 粉葛提取液對DPPH自由基清除作用

按照Ye Chunli等[17]的方法做適當修改:分別吸取2 mL 質量濃度分別為8、16、24、32、40 g/L的提取液,2 mL,70%甲醇與1 mL,0.5 mmol/L新鮮配制的DPPH無水乙醇溶液于比色管中,混勻,暗處放置30 min,于517 nm波長處測定吸光度A。樣品對照組(Ab)用無水乙醇代替DPPH無水乙醇溶液,用70%甲醇代替樣品提取液作為模型對照組(A0)。并按下式計算DPPH自由基清除率。

1.4 數據統計分析

所有實驗重復3 次,用DPS 9.50數據處理軟件,對實驗結果進行單因素試驗統計分析。

2 結果與分析

2.1 蒸汽爆破預處理對粉葛微觀結構的影響

對未爆破粉葛進行噴金處理時,由于粉葛富含淀粉且粒徑較大,易灑落,導致粉葛導電性不均勻,但整體不影響微觀結構的觀察。由圖1a可知,粉葛表面被淀粉顆粒覆蓋,細胞排列整齊,無纖維外露現象,不見裂縫與細胞間隙的存在。蒸汽爆破處理后粉葛(圖1b、1c)質地緊實,淀粉顆粒減少,這一現象可能是由于淀粉在高溫、高壓條件下發生分解,淀粉分子聚合度減小,大分子的晶格被破壞。同時,粉葛表面出現裂縫,細胞間產生間隙,致密的纖維結構被打亂而變得蓬松、卷曲,出現裸露的纖維束。這一現象可能是由于蒸汽爆破在泄壓過程,滲透到細胞內及組織間的水蒸氣膨脹,并且高速瞬間釋放出來,巨大剪切力的存在使纖維發生機械斷裂,細胞結構發生破壞。Chen Guozhong等[14,18]在研究蒸汽爆破對漆樹果的影響時,發現蒸汽爆破處理后漆樹果內、外果皮結構發生改變,出現裂縫、斷裂與空洞,與本實驗得到的結論一致。

2.2 最大吸收波長的確定

由圖2可知,葛根素、糠醛、5-羥甲基糠醛的最大吸收波長分別為250、278、284 nm,未經過蒸汽爆破處理的粉葛提取液在250 nm處有一個明顯的吸收峰, 經蒸汽爆破處理的粉葛提取液同樣在250 nm處出現最大吸收峰。由于糠醛和5-羥甲基糠醛在250 nm有微弱的吸收,因此對葛根異黃酮提取液進行HPLC分析,檢測是否有糠醛和5-羥甲基糠醛,以及對兩者的含量進行測定。

經HPLC分析,粉葛原樣以及蒸汽爆破樣品的提取液中均未檢測到糠醛,同時粉葛原樣提取液中未檢測到5-羥甲基糠醛,蒸汽爆破樣品提取液中檢測到5-羥甲基糠醛的存在。繪制峰面積與樣品質量濃度標準曲線,經過定量計算發現蒸汽爆破樣品提取液中5-羥甲基糠醛含量隨蒸汽爆破強度的增加而提高,且含量范圍為0.055~0.129 mg/g。按照粉葛醇提液中總異黃酮吸光度的測定方法,在250 nm波長處測定5-羥甲基糠醛的吸光度值,并繪制樣品質量濃度與吸光度的標準曲線,得到粉葛醇提液中5-羥甲基糠醛所產生的吸光度值在0.003 5~0.007 7,而蒸汽爆破粉葛醇提液的吸光度范圍在0.4~0.7之間,誤差小于5%,故糠醛、5-羥甲基糠醛在250 nm波長處對吸光度所產生的影響可以忽略。根據以上分析,說明選擇波長250 nm作為檢測葛根素和葛根異黃酮總量具有一定的專屬性和適用性。

2.3 蒸汽爆破預處理對總黃酮提取量以及甲醇提取物得率的影響

由圖3a可知,與未處理的粉葛相比,蒸汽爆破預處理之后總黃酮提取量顯著增加。黃酮成分大部分被包裹在細胞壁中[19],預處理之后,粉葛內部結構斷裂,結構變得疏松,比表面積增大,抗提取屏障被打破,有利于活性物質的溶出和分離提取。而且在較低壓力條件下(1.0 MPa),隨著維壓時間的延長,總黃酮提取量增加。滲透到細胞間的蒸汽越多,作用時間越長,對粉葛完整結構的破壞作用越大,結構越疏松,細胞內部結合的黃酮釋放的越完全。在2.0 MPa處理條件下,維壓時間的持續增加,并沒有使黃酮提取量逐漸增加,反而出現先增加后降低,這一結果與張兵兵等[20]對蒸汽爆破提取銀杏葉黃酮的工藝優化研究得到的結果一致。這表明在較高壓力條件下,短時間內細胞內的不溶性的黃酮轉化的不夠完全,提取量逐漸升高,且增加的速率較大。維壓時間過長則出現下降,這一現象可能是在高壓高溫條件下過長的維壓時間導致黃酮發生降解,且細胞內部溶出的黃酮又重新聚合形成不溶性物質所引起的[21]。周麗等[22]在對葛根中總異黃酮進行亞臨界提取時,同樣發現高溫使葛根的部分成分降解,使多糖、蛋白質等非提取成分浸出,包裹在原料表面,導致黃酮不能充分提取。

未經過蒸汽爆破處理過的粉葛總黃酮提取量為2.34 mg葛根素/g,在1.0 MPa、80 s處理下,總黃酮提取量達到4.87 mg葛根素/g,在2.0 MPa、60 s條件下,總黃酮提取量達到達到5.43 mg葛根素/g,分別是未處理粉葛總黃酮提取量的2.08 倍和2.32 倍。但是當爆破條件達到2.0 MPa、80 s時,總黃酮提取量出現下降趨勢,盡管如此,仍是未經過處理粉葛總黃酮提取量的2.21 倍。在相同的維壓時間下,在2.0 MPa條件下總黃酮提取量高于1.0 MPa,推測這是由于飽和蒸汽壓力越高,產生的機械作用越大,粉葛的完整結構受到更嚴重的破壞,傳質阻力減小,更有利于物質的提取,這與Chen Guozhong等[18]在研究漆樹果蒸汽爆破預處理后,提取黃酮時得到的研究結論相符。

由圖3b可知,隨著壓強的增大、維壓時間的延長,甲醇提取物的得率逐漸增加,在1.0 MPa、80 s,2.0 MPa、80 s處理條件下,甲醇提取物得率分別達到15.12%、16.92%,而未經過蒸汽爆破處理樣品的提取物得率僅為10.94%。甲醇提取物得率顯著增加,這可能是由于粉葛中大量纖維素、半纖維素的存在,蒸汽爆破引起纖維素的不定型區發生水解,木糖降解成糠醛,葡萄糖降解成5-羥甲基糠醛[23],均可溶于甲醇;另外,蒸汽爆破處理時,木質素分解生成的酚酸類物質,在甲醇中溶解性也會增加[24-26]。總之,物理結構發生改變,傳質阻力減小,黃酮等活性成分被有效釋放,以及纖維素、木質素的降解,引起溶解性增大而引起的,龔凌霄[27]在對青稞麩皮研究的實驗中得到了同樣的結論。

2.4 蒸汽爆破對甲醇提取液抗氧化能力的影響

對不同爆破條件下提取液的抗氧化能力采用DPPH自由基清除法對比。由圖4可知,經過預處理后,提取液的抗氧化能力顯著增加。處理條件為2.0 MPa、60 s時,粉葛總黃酮的提取量出現下降,但是粉葛醇提液的抗氧化活性卻沒有降低。隨著提取液質量濃度的增加,抗氧化能力增大的趨勢開始減緩,此條件下IC50為10.10 g/L,遠遠低于未處理粉葛的IC50(30.65 g/L)。出現這一現象可能是,由于粉葛中木質素含量約為9.05%,蒸汽爆破處理之后木質素會部分降解為低分子酚類物質[26],這在一定程度上有助于抗氧化能力的提高。同時,粉葛中淀粉含量較多,在本課題組未發表的研究中已經證明,蒸汽爆破處理后水溶性總糖的含量增加,多糖熱分解產生5-羥甲基糠醛等,也會有助于抗氧化能力的提高。在Noda等[28]的研究中同樣證明,蒸汽爆破之后物料的抗氧化性增加是由于黃酮類物質的增加,以及其他物質的降解所引起的。

3 結 論

將蒸汽爆破預處理應用到粉葛總黃酮的提取過程中,隨著蒸汽壓強的增加和維壓時間的延長,總黃酮提取量、甲醇提取物得率和抗氧化活性在一定程度上會有所提高,這是因為蒸汽爆破預處理可以減弱粉葛細胞壁的阻礙作用,致使比表面積增大、傳質阻力減小、溶劑滲透加快,促進了活性成分的提取。同時,高溫、高壓對不穩定化學鍵(如糖苷鍵)的破壞,導致預處理過程中發生化學變化,細胞內結合態的黃酮轉化為游離態,且木質素、纖維素類物質發生降解,也對上述結果起到了促進作用。根據本實驗結果可知,在合適的處理條件下蒸汽爆破有利于總黃酮的提取和抗氧化性的增強,同時劇烈的預處理導致黃酮類物質分解,阻礙了提取量的增加。在本實驗中,總黃酮的提取量比對照組增加了0.39~1.32 倍,抗氧化活性明顯增強,壓力與維壓時間對各項指標的影響均為極顯著(P<0.01)。

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Effect of Steam Explosion on Total Isoflavone Content and Antioxidant Capacity of Puerariae thomsonii Radix

ZHANG Qi1, YI Junpeng1,*, LI Xin2, WANG Xinsheng2, LI Bing1, ZHU Wenxue1
(1. College of Food and Bioengineering, Henan University of Science and Technology, Luoyang 471023, China;2. College of Chemical Engineering and Pharmacy, Henan University of Science and Technology, Luoyang 471023, China)

Steam explosion pretreatment was employed on Puerariae thomsonii Radix at a steam pressure of 1.0 and 2.0 MPa for 30, 40, 60 and 80 s, respectively. In order to explore the effect of steam explosion pretreatment on the total isoflavone content and antioxidant capacity of Puerariae thomsonii Radix, the content of total isoflavones was determined using UV spectrophotometry. The 1, 1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) radical scavenging activity was used to evaluate free radical scavenging capacity. The results indicated that the extraction efficiency of total isoflavones, the yield of methanol extract and antioxidant capacity significantly increased after steam explosion. Under optimal conditions, the yield of total isoflavones (calculated as puerarin) was 5.43 mg/g, which was 2.32 times as much as that of the untreated sample; the yield of methanol extract was 16.92%, and the 50% inhibitory concentration (IC50) for DPPH radical scavenging activity decreased from 30.65 g/L to 10.10 g/L, suggesting that the antioxidant capacity was improved. It can be concluded that a proper and reasonable steam explosion pretreatment can be applied to extract the active compounds and enhance the antioxidant capacity of Puerariae thomsonii Radix.

steam explosion; Puerariae thomsonii Radix; total isoflavones; antioxidant capacity

10.7506/spkx1002-6630-201609008

TS202.3

A

1002-6630(2016)09-0040-05

張棋, 易軍鵬, 李欣, 等. 蒸汽爆破預處理對粉葛總黃酮及抗氧化性的影響[J]. 食品科學, 2016, 37(9): 40-44. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201609008. http://www.spkx.net.cn

ZHANG Qi, YI Junpeng, LI Xin, et al. Effect of steam explosion on total isoflavone content and antioxidant capacity of Puerariae thomsonii Radix[J]. Food Science, 2016, 37(9): 40-44. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201609008. http://www.spkx.net.cn

2015-06-05

國家自然科學基金面上項目(31271972);河南科技大學博士科研基金資助項目(400813480035)

張棋(1990—),女,碩士研究生,研究方向為農產品加工與貯藏。E-mail:zhang2014qi@126.com

*通信作者:易軍鵬(1976—),男,副教授,博士,研究方向為藥食兩用生物資源高值化利用。E-mail:yijunpeng@126.com

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