豬心肌高鐵肌紅蛋白高級結構動態信息的光譜指認

李亞東，吳名草，湯 宇，金邦荃，*，黃鶴勇，李 鋼，馮玉英

（1.南京師范大學金陵女子學院，江蘇 南京 210097；2.南京師范大學分析測試中心，江蘇 南京 210097）

豬心肌高鐵肌紅蛋白高級結構動態信息的光譜指認

李亞東1，吳名草1，湯 宇1，金邦荃1，*，黃鶴勇2，李 鋼2，馮玉英2

（1.南京師范大學金陵女子學院，江蘇 南京 210097；2.南京師范大學分析測試中心，江蘇 南京 210097）

本實驗采用掃描電子顯微鏡、X射線衍射、拉曼、紅外等現代光譜技術和數據庫、計算軟件等，層層剖析豬心肌高鐵肌紅蛋白（pig metmyoglobin，pMetMb）凍干粉的結構特征和分子動態結構信息。結果表明，pMetMb凍干粉表觀呈明顯的棱狀結晶體，結晶度為（95.60±1.37）%，三晶胞軸長不相等（a≠b≠c），可歸屬于高晶度含水單斜結晶體。根據晶體數據庫同類化合物比對，得到pMetMb肽鏈和heme-Fe的關鍵基團來源；經拉曼和紅外光譜解析和推算，pMetMb肽鏈均有α螺旋、β折疊、β轉角和無規卷曲4 種蛋白質二級結構，分別占50%、14%、24%和12%；分別由3 個酰胺區中C=O、C=C、C—N、—COO-、C—H、N—H的不同振動形式所產生；六配位低自旋的Fe—C—N形成heme-Fe3+。因此，pMetMb為六配位低自旋構象，是結構緊密、性質穩定的球狀蛋白質。

單斜晶體；結構域；動態結構信息；光譜特征；豬心肌高鐵肌紅蛋白

肌紅蛋白（myoglobin，Mb）含有卟啉環鐵（heme-Fe）化學結構，是心肌和骨骼肌細胞的胞漿呈色蛋白質，也是生鮮肉和肉制品的主要呈色物質［1-4］。它在活體內以3 種化學態（Mb-MbO2-MetMb）的動態平衡，維系畜肉及其肉食品的色澤穩定和理想肉色［5-8］。因此，肌細胞內Mb的主要生物學功能是在低氧分壓條件下，傳遞電子，攜帶和儲備氧氣（O2），以紅潤的肉色展現良好的畜肉品質和心肌功能［1-8］。

Mb或高鐵肌紅蛋白（metmyoglobin，MetMb）是物種進化過程中一種高度穩定的球狀蛋白質，種間同源性很高［3，9-11］。隨著近年蛋白質組學的快速發展，人們對于馬和人心肌肌紅蛋白的分子結構和信息已有了較深入的了解［9-12］。馬心肌肌紅蛋白（hMb）作為生物標記物，用于臨床診斷早期心肌損傷和肉質摻假鑒別等，并取得長足的進步［3，13-14］；然而，hMb資源短缺，價格昂貴，難以進一步拓展到肉品品質的技術監控。

本實驗是在前期豬心肌高鐵肌紅蛋白（pig metmyoglobin，pMetMb）分子信息解析基礎上，采用光譜學手段，表征pMetMb高級動態結構、功能域和晶體特征，為其作為肉品品質監控等研究的生物標記物提供光譜學理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

豬高鐵肌紅蛋白（pMetMb），棕紅色凍干粉，純度≥93%，分子質量17 kD，南京師范大學金陵女子學院功能性食品實驗室制備［15-16］。

1.2 儀器與設備

JSM-5610LV高分辨率掃描電子顯微鏡、JFC-1600濺射儀 日本電子公司；CH30RF200光學生物顯微鏡日本Olympus公司；D/max 2500VL/PC陽極轉靶X射線衍射儀 日本理學公司；UVLABRAM HR800激光共焦顯微拉曼光譜儀 法國Jobin Yvon公司；NEXUS670傅里葉紅外光譜儀 美國Thermo Nicolet公司。

1.3 方法

1.3.1 pMetMb晶體結構解析

于500、1 000、2 000、5 000 倍掃描電子顯微鏡下，分別觀察pMetMb凍干粉末晶體結構的超微特征［17］。pMetMb凍干粉壓片后，直接陽極轉靶X射線衍射（X-ray single crystal diffractometer，XRD）儀檢測和數據庫比對。X射線（X-ray）工作條件：管壓40 kV、管流200 mA、狹縫寬度DS=SS=1°，布拉格衍射角（2θ）掃描范圍3°～85°，設定掃描速率0.12°/min和步進間隔0.02°［18-19］。運用XRD-PDF-2004數據庫和Jade5.0（MDI-R99100）計算軟件，對pMetMb X射線衍射峰數據進行解析、計算和擬合，使擬合圖譜誤差R＜9%（P≥0.05），解讀其晶體高級結構的重要化學基團。

pMetMb晶粒直徑按Debye-Scherrer公式（1）計算［20-21］。

式中：dhkl為晶粒直徑/nm；λ為入射X射線衍射波長/nm；β為衍射峰半高峰寬；θ為布拉格衍射角/（°）。

pMetMb結晶度按Debye-Scherrer公式（2）計算［21］。

1.3.2 pMetMb結構信息的拉曼和紅外光譜指認

用雙蒸水（ddH2O）將pMetMb稀釋至100 mg/mL，5 μL上樣量。

拉曼光譜工作條件：163型氬離子激光光源、激發線波長（λ）514.15 nm、出射功率10 mW、分辨率2 cm-1，重復掃描3 次，由計算機作信號累加平均并繪圖輸出各樣品的拉曼譜圖，峰位誤差小于±3 cm-1［22-25］。

紅外光譜工作條件：KRS-5壓片法透射光譜測定法，采用DTGS型KBr探頭和4 cm-1分辨率，重復掃描32 次［26］。

運用Microcal Origin 6.0（序列號：MA 01060）軟件，對pMetMb拉曼和紅外光譜的高級結構解析；運用NGSLabSpec軟件，以（1 005±1） cm-1處苯丙氨酸（Phe）特征峰強度為單位1，進行歸一化處理。對于酰胺Ⅰ和Ⅲ特征區域采用兩點基線校正，用5點Savitsk-Golay函數平滑圖譜，做二階導數和傅里葉去卷積，手動選定并估算各子峰的峰位和半峰寬，采用Gaussian函數進行圖譜擬合，從而完全分辨開重疊在一起的不同譜帶，進一步確定各子峰和不同二級結構的對應關系后，積分后根據峰面積計算各種二級結構的相對比例。

2 結果與分析

2.1 pMetMb三維晶體結構解析

2.1.1 結晶度和結晶態

由圖1可知，將pMetMb凍干粉平鋪于載玻片上，置于500～5 000 倍電子顯微鏡下掃描，可觀察到連接成片的晶狀體結構；2 000和5 000 倍電子顯微鏡下，pMetMb呈典型的棱狀晶體，初步表明其為結晶態凍干粉。

對pMetMb凍干粉進行陽極轉靶X射線衍射，得到其X射線衍射峰圖譜。由圖2可知，pMetMb產生6 個XRD，圖形清晰陡直，X射線的信號強度高，無明顯干擾噪音，且基線平穩，表明該凍干粉結晶度高、規整性好。

采用Debye-Scherrer公式（1）和公式（2）計算pMetMb晶粒直徑和結晶度，其晶粒平均直徑（dhkl）為（0.985±0.168）nm，平均結晶度達到（95.60±1.37）%（表1）。通過X射線衍射證明，pMetMb凍干粉具有極高的結晶度，可以進一步分析它的結晶態［18-21］。

在15°～35°布拉格衍射角（2θ）范圍內，pMetMb出現6 個尖銳2θ XRD，分別對應19.196 °、20.276 °、23.501 °、25.360 °、27.442 °和31.799 °（簡稱1～6），它們峰面積比值分別為2.2、4.5、2.0、1.3、8.9和81.1，并以第6 XRD信號最強（圖2）。將得到的6 個XRD 2θ等5 個參數輸入XRD-PDF-2004數據庫，計算pMetMb結晶態。由表2可知，3 個有機物XRD晶胞三軸長均不相等，即a≠b≠c；而且其中氧化鉬銨蘋果酸水合物（ammonium molybdenum oxide malate hydrate，C8H22Mo4N4O21·H2O）含有水分子（H2O）。由此推論，pMetMb結晶態可能歸屬于含水單斜晶體結構。

2.1.2 結構中化學信息比對

將pMetMb X射線衍射采集到的6 個XRD信號，計算匹配化合物的品質因子（figure of merit，FOM），并在數據庫中與已有高信噪比的化合物進行比對，找到3 個有機化合物和3 個無機高匹配度化合物（表2，圖3）。

3 個高匹配度有機化合物分別對應于對硝基苯胺（C6H6N2O2）、對氟苯氧乙酸（C8H7FO3）和氧化鉬銨蘋果酸水合物（C8H22Mo4N4O21·H2O），它們與pMetMb的FOM值為22.0、22.4和22.6，理論上它們化學結構與pMetMb的十分接近［19-21］，因此本研究可用于解讀pMetMb化學結構信息。

由表2、圖3a可知，該3 個有機化合物具有pMetMb化學結構中所存在的苯環（C6H6）、甲胺基（CH3—NH—）、酰胺基（—CO—NH—）、羧甲基（—CH2COOH）和水分子（H2O）等基團，它們的XRD信號與pMetMb有高度重疊，尤其在pMetMb第6 XRD（31.799 °）處。推測pMetMb在烷基化縮合過程中，可通過這些基團形成肽骨架結構，以及由咪唑基團（C3H4N2）縮合而成卟啉環（heme）結構［27-29］。

3 個高匹配度無機化合物可能來自KFeO2、Fe2SiV和Fe3Si，它們的FOM值分別是14.3、19.9和32.8，三者均為含鐵（Fe）化合物。它們在31.799 °處與pMetMb XRD高度重合（表2，圖3b）。由此證實pMetMb分子結構中含有Fe配位基團，當與pMetMb中的heme螯合，就有可能形成了heme-Fe的電子傳遞核心結構域［27-31］。

2.2 pMetMb二級結構及官能團的拉曼光譜指認

由圖4可知，300～3 900 cm-1范圍內得到pMetMb拉曼光譜，出峰良好，未經平滑處理即可觀察到清晰的結構域特征峰。

由圖4、表3可知，酰胺Ⅰ和酰胺Ⅲ的結構域分別定位于1 640～1 690 cm-1和1 230～1 300 cm-1，前者1 654、1 666、1 682、1 662 cm-1特征峰分別歸屬α螺旋、β折疊、β轉角和無規卷曲結構；后者4 種二級結構特征峰對應于1 267～1 281、1 238、1 304、1 247 cm-1［22-23］。二硫鍵（S—S）的結構域（官能團）位于507～540 cm-1，其中510 cm-1峰強度最大，為順式構象，屬于天然蛋白質的優勢構象；525 cm-1處還呈現一弱峰，為S—S反式構象；推測pMetMb在純化過程中，S—S部分發生反轉，高級結構出現微小改變［22-25］。卟啉環鐵（heme-Fe）的結構域（Fe—C—N）出現在高頻區的1 354 cm-1（v4），1 463、1 559 cm-1（v3），226 cm-1（v2）。

根據拉曼光譜，pMetMb肽鏈含有酰胺Ⅰ和酰胺Ⅲ結構域，其中包含多個α螺旋的4 種蛋白質二級結構；除heme-Fe（Fe—C—N）核心基團外，其肽鏈中還包含色氨酸（Try）、酪氨酸（Trp）和苯丙氨酸（Phe）等芳香族氨基酸結構域，和順式/反式S—S及C—H等鍵合結構。

2.3 pMetMb高級結構動態信息的紅外光譜指認

對pMetMb水溶液進行傅里葉紅外光譜掃描，在500～4 000 cm-1范圍內進一步解讀它的動態結構信息，以補充對pMetMb高級結構信息的認識。研究觀察到，600～1 700 cm-1和2 900～3 500 cm-1是pMetMb特征峰的主要區域，且與拉曼光譜相互映證。

由圖5、表4可知，解析出3 個酰胺結構域，即1 564～1 703 cm-1的酰胺Ⅰ，形成了以C=O和C=C等伸縮振動為主的α螺旋肽骨架結構紅外光譜吸收峰，這些主要來自肽鏈中谷氨酰胺（Gln）、谷氨酸（Glu）、組氨酸（His）、賴氨酸（Lys）、Trp和天冬氨酸（Asp）等氨基酸的鍵合行為；酰胺Ⅱ位于1 386～1 525 cm-1，跨度較大，呈現多種光譜振動形式，有C=C、C—N、—COO-反式彎曲振動和C—N、C—H、N—H伸縮振動等，它們來自肽鏈中Lys、Tyr、Trp、脯氨酸（Pro）和His等；1 198～1 274 cm-1區域的酰胺Ⅲ的紅外光譜具有單酰胺模型特征，呈現β折疊二級結構的振動光譜，產生了源于Trp、Tyr和His等氨基酸的合并N—H彎曲和C—N伸縮振動，并伴隨C=O平面內彎曲和C=C伸縮振動。從而表明pMetMb分子結構至少含有3 個酰胺結構域，通過C=O、C=C伸縮振動或C=C、C—N反式彎曲振動等，從動態紅外光譜信息也證實其肽骨架具有了α螺旋和β折疊的二級結構和化學鍵的氨基酸來源［26］。

運用Microcal Origin 6.0軟件，進一步對pMetMb的1 600～1 700 cm-1酰胺Ⅰ和1 200～1 300 cm-1酰胺Ⅲ特征區紅外光譜進行高斯積分和精確定位，計算其峰面積和半峰寬。結果顯示，酰胺Ⅰ的1 616、1 631 cm-1，1 640、1 651 cm-1，1 659、1 668～1 690 cm-1等依次對應為β折疊、無規卷曲、α螺旋和β轉角結構，其中1 659 cm-1是α螺旋紅外光譜振動區；酰胺Ⅲ中的1 219、1 263 cm-1，1 280、1 284 cm-1，1 293、1 299 cm-1，1 307、1 327 cm-1處積分，分別指認為β折疊、無規卷曲、β轉角和α螺旋結構，α螺旋位于1 307、1 327 cm-1振動區（圖6）。

經NGSLabSpec軟件計算和解讀（表5），pMetMb 4 種二級結構中，α螺旋、β折疊、β轉角和無規卷曲的比例分別占二級結構的50%、14%、24%和12%，因此pMetMb具有α螺旋為主型的球蛋白結構；二級結構數據的標準偏差（standard deviation，SD）分析（SD＜0.03）表明，拉曼和紅外光譜對pMetMb二級結構的指認和比例分析的可信度高。

3 結 論

掃描電子顯微鏡下觀察發現，pMetMb凍干粉呈現明顯的棱狀結晶體。經X射線衍射和胞晶計算，它的晶胞三軸長不相等（a≠b≠c）且含有結晶水，可歸屬于單斜晶體結構；由于dhkl為（0.985±0.168）nm，結晶度達到（95.60±1.37）%。根據它的布拉格衍射角（2θ）等參數計算，將它6 個XRD與晶體數據庫同類化合物比對，pMetMb肽鏈和heme-Fe等關鍵基團來源均得到映證。

對pMetMb高級結構的拉曼和紅外光譜解析，它肽鏈兼有α螺旋、β折疊、β轉角和無規卷曲4 種蛋白質二級結構，分別占50%、14%、24%和12%，歸屬于α螺旋為主型球蛋白。它的結構動態信息還顯示，其具有3 個酰胺區域，即酰胺Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ；其C=O、C=C、C—N、—COO-、C—H、N—H的不同振動形式，產生了不同的二級結構；由于它核心區域heme-Fe以Fe—C—N六配位低自旋，從而呈現MetMb構象。

綜上所述，本研究的pMetMb球狀結構緊密，化學性質穩定，可以作為生物標記物用于肉品品質等研究。

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Spectral Assignment of Dynamic Structure Information of Porcine Myocardial Metmyoglobin （pMetMb）

LI Yadong1， WU Mingcao1， TANG Yu1， JIN Bangquan1，*， HUANG Heyong2， LI Gang2， FENG Yuying2
（1. Ginling College， Nanjing Normal University， Nanjing 210097， China；2. Center of Analysis and Testing， Nanjing Normal University， Nanjing 210097， China）

The dynamic molecular structures and domains of porcine myocardial metmyoglobin （pMetMb） were studied and analyzed by scanning electron microscopy， X-ray diffraction， Raman and Infrared spectroscopy with matched databases and softwares. Obviously prismatic crystalline structures were observed on the surface of lyophilized pMetMb powder. The crystallinity of pMetMb was （95.60 ± 1.37）%， and it was highly crystalline and monoclinic powder because the lengths of its three-dimensional unit cell were inequality （a ≠ b ≠ c）. By comparison with crystal databases the source of heme-Fe domain in pMetMb was identified. The Raman and Infrared spectra proved that the peptide chain of pMetMb contained 50% α-helix，14% β-fold， 24% β-turn and 12% random coil， which came from the different shake forms C=O， C=C， C-N， -COO-，C-H and N-H in the amide I， II and III regions. The heme-Fe domain in pMetMb formed by imidazole group （C3H4N2）binding with Fe3+. So it belonged to globin with compact structure and stable properties.

monoclinic crystal； structural domain； dynamic structural information； spectral characteristics； porcine myocardial metmyoglobin （pMetMb）

10.7506/spkx1002-6630-201609021

TS251

A

1002-6630（2016）09-0111-06

李亞東， 吳名草， 湯宇， 等. 豬心肌高鐵肌紅蛋白高級結構動態信息的光譜指認［J］. 食品科學， 2016， 37（9）： 111-116. DOI：10.7506/spkx1002-6630-201609021. http：//www.spkx.net.cn

LI Yadong， WU Mingcao， TANG Yu， et al. Spectral assignment of dynamic structure information of porcine myocardial metmyoglobin （pMetMb）［J］. Food Science， 2016， 37（9）： 111-116. （in Chinese with English abstract） DOI：10.7506/ spkx1002-6630-201609021. http：//www.spkx.net.cn

2015-07-12

江蘇省六大人才高峰項目（184080H10202）；江蘇省農業科技自主創新資金項目（CX（11）1301）

李亞東（1989—），男，碩士研究生，研究方向為肉品科學。E-mail：ns_liyadong@163.com

*通信作者：金邦荃（1956—），女，教授，博士，研究方向為食品科學。E-mail：jinbangquan@njnu.edu.cn