熒光光譜法研究桿菌肽與溶菌酶的相互作用

倪志華，張玉明*，鄧傳懷周艷芬

（1.河北大學生命科學學院，河北 保定 071002；2.河北省生物工程技術研究中心，河北 保定 071002）

熒光光譜法研究桿菌肽與溶菌酶的相互作用

倪志華1，2，張玉明1，*，鄧傳懷1，周艷芬1，2

（1.河北大學生命科學學院，河北 保定 071002；2.河北省生物工程技術研究中心，河北 保定 071002）

利用熒光光譜法研究了桿菌肽與溶菌酶的相互作用。結果表明：桿菌肽能使溶菌酶的內源熒光發生猝滅。在不同溫度下研究桿菌肽對溶菌酶的熒光猝滅作用，證明熒光猝滅機理屬于二者形成復合物所引起的靜態猝滅。利用Stern-Volmer方程處理實驗數據，發現桿菌肽與溶菌酶具有1 個結合位點，并計算得到了不同溫度下桿菌肽與溶菌酶的結合常數（KA）：3.60×105（298 K）、1.90×105（308 K）、4.51×104L/mol（318 K）。通過計算熱力學參數，可知桿菌肽與溶菌酶的相互作用是一個吉布斯自由能降低的自發過程，且二者之間的主要作用力類型是靜電作用。三維熒光光譜實驗顯示，桿菌肽的加入引起溶菌酶構象的變化，表現為蛋白質內部色氨酸殘基所處微環境的疏水性降低。

桿菌肽；溶菌酶；相互作用；熒光光譜

桿菌肽是一種應用廣泛的畜禽專用抗生素飼料添加劑，對多種革蘭氏陽性病原菌、放線菌以及部分革蘭氏陰性菌均有較強抑制作用［1］。并且，桿菌肽還具有促進動物生長、提高機體免疫能力方面的作用，被譽為“綠色飼料添加劑”。隨著我國畜牧養殖業的快速發展，桿菌肽的市場需求與日俱增。溶菌酶是一種廣泛分布于生物體內的小分子堿性蛋白，具有抗菌、消炎、抗病毒等諸多的生物功能［2］。作為血漿中的小分子蛋白，溶菌酶在白細胞中含量高，是生物體內不可或缺的非特異性體液免疫因子。并且，溶菌酶能夠作為一種選擇性載體蛋白和很多的外源和內源性物質結合，從而行使其生物學功能［3］。因此，溶菌酶是一種用來研究小分子物質與蛋白質相互作用的良好模型［4-6］。當前對桿菌肽的研究大多集中于發酵生產和畜牧養殖應用方面，對其與生物大分子相互作用方面的研究未見報道。因此，開展桿菌肽與溶菌酶的相互作用研究很有意義。

光譜法是研究蛋白質與各種有機小分子相互作用的重要手段［7-8］。本實驗應用熒光光譜法研究溶菌酶與桿菌肽的作用，重點考察二者相互作用的結合常數、結合位點數以及結合熱力學參數，并利用三維熒光光譜研究桿菌肽對溶菌酶結構的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

桿菌肽 上海金穗生物科技有限公司；溶菌酶北京索萊寶科技有限公司；磷酸二氫鈉和磷酸氫二鈉西隴化工股份有限公司；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

1.3 方法

以0.1 mol/L pH 7.4磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）為溶劑配制1.0×10-3mol/L的溶菌酶標準溶液備用，桿菌肽使用超純水配成1.0×10-3mol/L的標準溶液備用。準確移取一定量的桿菌肽標準溶液于10 mL具塞玻璃試管中，再加入溶菌酶標準溶液，以0.1 mol/L pH 7.4 PBS定容，使體系中溶菌酶濃度達到1.0×10-3mol/L，然后分別在298、308、318 K條件下恒溫1 h。在激發和發射光柵狹縫均為5 nm，激發波長為280 nm條件下，掃描一定波長范圍內溶菌酶和溶菌酶-桿菌肽的熒光光譜。在激發波長為250～400 nm和發射波長為250～400 nm范圍內進行三維熒光掃描，比較溶菌酶與桿菌肽-溶菌酶體系的熒光等高線圖。

2 結果與分析

2.1 熒光猝滅光譜

蛋白質的熒光特性主要取決于結構中的3 種氨基酸，即色氨酸（Trp）、酪氨酸（Tyr）和苯丙氨酸（Phe）。上述3 種氨基酸的熒光強度比通常為100∶9∶0.5，即大多數情況下可以認為蛋白質的熒光主要來自色氨酸殘基的貢獻［9-10］。溶菌酶是由129 個氨基酸殘基組成的蛋白質，分子內部含有2 個色氨酸殘基［11］，因而在280 nm激發波長處能發射較強的內源熒光。

由圖1可知，激發波長為280 nm時，不同溫度下溶菌酶的最大熒光強度位置分別為335.4（298 K）、335.3 nm（308 K）和335.6 nm（318 K）。結果說明，在不同溫度下溶菌酶的最大熒光強度位置變化不大，但是其最大熒光強度的絕對值呈現隨著溫度升高而降低的趨勢。加入桿菌肽后，不同溫度下溶菌酶的內源性熒光強度均出現逐漸降低現象，溶菌酶的熒光明顯被猝滅，這說明桿菌肽與溶菌酶發生了相互作用。并且，桿菌肽的加入使溶菌酶最大熒光強度位置發生變化：當加入桿菌肽濃度為50 nmol/L時溶菌酶在298、308、318 K的最大熒光強度位置變為350.9、351.6、351.3 nm，分別紅移了15.5、16.3、15.7 nm。這說明加入桿菌肽后，溶菌酶中Trp殘基的微環境發生了變化，使其變得更加親水，從而猝滅了溶菌酶所發射的內源熒光，這也印證了桿菌肽與溶菌酶發生了相互作用。

2.2 桿菌肽對溶菌酶的熒光猝滅機理

熒光猝滅主要分為動態猝滅和靜態猝滅［12］，動態猝滅是熒光體與猝滅劑之間因相互碰撞而使熒光體的熒光被猝滅，溫度升高可增加分子碰撞的機會，能夠提高猝滅效率［13］；而靜態猝滅是熒光體與猝滅劑之間形成了不發熒光的復合物引起的，溫度升高將引起配合物的穩定度下降，從而減小靜態猝滅的程度。可以使用Stern-Volmer方程分析熒光猝滅數據［14］。

式中：F0和F分別表示不加入和加入猝滅劑時體系的相對熒光強度；［Q］為猝滅劑的濃度/（μmol/L）；K在靜態猝滅時為配合物的形成常數/（L/mol），在動態猝滅時為動態猝滅常數Ksv/（L/mol）。

路燈數據的上報分為兩大類：主動上報，觸發型上報。其中主動型包括定時路燈狀態上報，心跳上報用以鏈路保活；觸發型上報為事件觸發弄的，如主動查詢，遠程控制等。

式中：Kq為熒光猝滅速率常數/（L/（mol·s））；T0為不存在猝滅劑時熒光物質的平均壽命/s，一般為10-8s。由式（1）作圖，得到Stern-Volmer猝滅曲線，結果如圖2所示。根據曲線斜率計算得到桿菌肽和溶菌酶之間相互作用的熒光猝滅速率常數Kq及猝滅常數Ksv，結果見表1。

由圖2可知，F0/F對［Q］線性良好，相關系數r值都大于0.99，表明桿菌肽與溶菌酶之間相互作用時只存在一種猝滅機制。由圖2中直線的斜率可求出Ksv值，動態和靜態猝滅可根據猝滅常數Ksv隨溫度變化關系來判斷。由表1可知，隨著溫度的升高，溶菌酶的猝滅曲線斜率下降，Ksv值降低，說明桿菌肽對溶菌酶熒光的猝滅作用隨溫度升高而降低，符合靜態猝滅規律［11］。桿菌肽對溶菌酶的Kq值在1012數量級，大于各類猝滅劑對生物大分子最大擴散控制的碰撞猝滅速率常數2.0×1010L/（mol·s）［15］，也說明桿菌肽對溶菌酶的熒光猝滅作用不是動態猝滅。

2.3 桿菌肽與溶菌酶的結合常數及結合位點數

對于靜態猝滅過程，蛋白質與小分子的結合位點數可由式（3）導出［16］。

式中：F0和F分別表示不加入和加入猝滅劑時體系的相對熒光強度；［Q］為猝滅劑的濃度/（μmol/L）；KA和n分別為桿菌肽與溶菌酶的結合常數和結合位點數。

以不同溫度下桿菌肽對溶菌酶的熒光猝滅結果，將lg［（F0-F）/F］對lg［Q］作圖，并進行線性回歸。從圖3中回歸直線的斜率和截距可求得溶菌酶與桿菌肽的結合位點數n和結合常數KA。如表2所示，溫度分別為298、308、318 K時，lg［（F0-F）/F］對lg［Q］的線性關系良好，r值都達到0.99以上。桿菌肽與溶菌酶的結合位點數均接近于1，表明二者近似的以1∶1形式結合而生成復合物，溫度對二者之間結合比例影響不大。本研究中，桿菌肽與溶菌酶在各溫度的結合常數KA值均達到或超過104數量級，表明二者之間的結合作用較強。

2.4 桿菌肽與溶菌酶結合熱力學參數及結合力類型

小分子物質和蛋白質之間的相互作用力主要有疏水作用力、氫鍵、范德華力和靜電引力等［17］。在溫度變化范圍不大時，可以近似認為作用過程的焓變ΔH是一個常數。根據公式（4）～（6），可分別求得焓變ΔH、熵變ΔS和生成自由能變ΔG。Ross等［18］總結了小分子間與生物大分子反應的熱力學參數與主要作用力類型的關系，即當ΔH＞0、ΔS＞0為典型的疏水作用力；ΔH＜0、ΔS＜0為氫鍵和范德華力；當ΔH＜0、ΔS＞0時，主要存在靜電作用。根據熱力學公式（4）、（5）、（6）及不同溫度下的結合常數，可求得相應的熱力學參數（表3）。

由表3可知，桿菌肽與溶菌酶相互作用時熱力學參數ΔH＜0、ΔS＞0，可以認為二者之間的作用力主要為靜電相互作用。反應的自由能變ΔG＜0，說明桿菌肽與溶菌酶的相互作用是自發進行的。反應的ΔH＜0，說明反應為放熱反應。并且，升高溫度將不利于反應的進行，這也符合前文所述的桿菌肽對溶菌酶的猝滅機制為靜態猝滅。

2.5 桿菌肽與溶菌酶的三維熒光光譜

三維熒光光譜是以激發波長、發射波長和熒光強度3 個參數分別為坐標的熒光矩陣光譜［19-20］。同時，三維圖譜可用強度等高線代替以更為直觀地描述被測組分的熒光信息，是一種有價值的光譜指紋技術［21］。研究溶液狀態下蛋白質-藥物小分子相互作用中蛋白質的構象變化時，三維熒光光譜能提供比常規熒光光譜更完整的光譜信息。本實驗在激發波長250～400 nm和發射波長250～400 nm范圍內進行三維熒光掃描，得到溶菌酶和桿菌肽-溶菌酶復合物的熒光等高線圖（圖4）。其中，使用的溶菌酶和桿菌肽濃度分別為100、20 μmol/L，實驗溫度為298 K。

從峰的類別看，圖4a、b中都存在兩條“鉛筆”形紋線，它們的共同特征是激發波長（λex）等同于發射波長（λem），是典型的瑞利散射峰［22］。并且，圖4a、b中瑞利散射線左上方λex=300 nm左右都存在“指紋”形紋線，λem分別是340 nm和350 nm左右。上述“指紋”形紋線符合λex＜λem的規律，是熒光峰的典型特征。從峰的位置看，加入桿菌肽后，溶菌酶的瑞利散射峰起始位置及熒光峰位置均無顯著變化。從峰的強度看，圖4b中的“鉛筆”形和“指紋”形紋線變得稀疏，“指紋”形紋線的變化趨勢尤為明顯。也就是說，加入桿菌肽后瑞利散射峰和熒光峰的相對強度均有不同程度的降低。

溶菌酶是橢圓形的分子，在其表面有一個深陷而狹長的凹槽。它的活性中心位于溶菌酶分子表面葡萄糖（Glu）35、天冬氨酸（Asp）52和Trp 62兩個結構域之間的溝槽內。大多數的非極性和極性側鏈分別埋藏在分子內部和分布在分子表面上［23］。據此推斷出桿菌肽可能在溶菌酶的非極性凹槽內與之結合發生作用，誘導了溶菌酶構象的變化。分析認為，桿菌肽的加入使水溶液中溶菌酶疏水腔體內微環境的極性和疏水效應發生改變，從而導致溶菌酶構象的變化［24］，表明溶菌酶和桿菌肽發生反應而生成了一種新的復合物，這也印證了桿菌肽對溶菌酶的熒光猝滅機制為靜態猝滅。

3 結 論

利用熒光光譜法研究了桿菌肽與溶菌酶的相互作用。桿菌肽對溶菌酶的內源熒光具有較強的猝滅作用，原因是桿菌肽與溶菌酶分子發生結合形成復合物。測定了不同溫度下桿菌肽與溶菌酶的結合常數、結合位點和熱力學參數，結果表明桿菌肽對于溶菌酶的熒光猝滅機制為靜態猝滅，二者的結合主要是基于靜電作用，大約形成1 個結合位點。三維熒光光譜研究表明，桿菌肽和溶菌酶之間結合導致了蛋白質分子內部疏水微環境極性的改變，進而導致了溶菌酶構象的變化。上述結果均說明溶菌酶是桿菌肽在機體內的有效載體。

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Fluorescence Spectroscopic Study of the Interaction of Lysozyme with Bacitracin

NI Zhihua1，2， ZHANG Yuming1，*， DENG Chuanhuai1， ZHOU Yanfen1，2
（1. College of Life Sciences， Hebei University， Baoding 071002， China；2. Research Center of Bioengineering of Hebei Province， Baoding 071002， China）

The interactions between bacitracin and lysozyme were studied by fluorescence spectroscopy. The results showed that the intrinsic fluorescence of lysozyme could be quenched by bacitracin. The fluorescence quenching of lysozyme was analyzed at different temperatures. The quenching mechanism was accomplished in a static manner by forming a bacitracin-lysozyme complex. The binding parameters were determined according to Stern-Volmer equation， and the thermodynamic parameters were calculated. The results showed that there was only one binding site between bacitracin and lysozyme. The binding constants （KA） between bacitracin and lysozyme at different temperatures were 3.60 × 105（298 K），1.90 × 105（308 K）， and 4.51 × 104L/mol （318 K）， respectively. Thermodynamic analysis indicated that the interaction process was spontaneous， and electrostatic force might be primarily responsible for the interaction. In addition， the effect of bacitracin on the conformation of lysozyme was analyzed by three-dimensional fluorescence spectroscopy. The result indicated that the polarity of the microenvironment around Trp residues decreased.

bacitracin； lysozyme； interaction； fluorescence spectroscopy

10.7506/spkx1002-6630-201609026

TS201.2

A

1002-6630（2016）09-0139-05

倪志華， 張玉明， 鄧傳懷， 等. 熒光光譜法研究桿菌肽與溶菌酶的相互作用［J］. 食品科學， 2016， 37（9）： 139-143. DOI：10.7506/spkx1002-6630-201609026. http：//www.spkx.net.cn

NI Zhihua， ZHANG Yuming， DENG Chuanhuai， et al. Fluorescence spectroscopic study of the interaction of lysozyme with bacitracin［J］. Food Science， 2016， 37（9）： 139-143. （in Chinese with English abstract） DOI：10.7506/spkx1002-6630-201609026. http：//www.spkx.net.cn

2015-07-30

保定市科學技術研究與發展指導計劃項目（15ZN001）；河北省高等學校科學技術研究項目（QN2015174）；河北大學中西部提升綜合實力專項資金資助項目

倪志華（1979—），女，講師，碩士，研究方向為應用生物化學。E-mail：nizhihua@hbu.edu.cn

*通信作者：張玉明（1979—），男，講師，博士，研究方向為生物化工。E-mail：zhangyuming@hbu.edu.cn