氧化還原電位調控對鈍齒棒桿菌代謝通量分布的影響

陳小舉，操新民，姜紹通，李興江，*

（1.巢湖學院化學與材料工程學院，安徽 巢湖 238000；2.合肥工業大學食品科學與工程學院，安徽 合肥 230009）

氧化還原電位調控對鈍齒棒桿菌代謝通量分布的影響

陳小舉1，2，操新民2，姜紹通2，李興江2，*

（1.巢湖學院化學與材料工程學院，安徽 巢湖 238000；2.合肥工業大學食品科學與工程學院，安徽 合肥 230009）

研究不同氧化還原電位對鈍齒棒桿菌厭氧發酵特性的影響，并對菌株的代謝通量分布特征進行了分析。結果表明，氧化還原電位由-56 mV降為-400 mV時，發酵液中琥珀酸質量濃度由14 g/L上升為20.2 g/L，乳酸質量濃度由44.9 g/L下降為35.2 g/L。代謝通量分析結果表明，降低氧化還原電位對6-磷酸葡萄糖與磷酸烯醇式丙酮酸節點處的代謝流分布影響顯著。氧化還原電位為-400 mV時，胞內戊糖磷酸途徑（pentose phosphate pathway，HMP）代謝通量與-56 mV相比增加了1.74 倍，由磷酸烯醇式丙酮酸流向C4途徑的代謝通量與-56 mV相比增加了78%，琥珀酸通量由31.73 mmol/（L·g·h）增加到56.53 mmol/（L·g·h），乳酸代謝通量由159.73 mmol/（L·g·h）下降為133.50 mmol/（L·g·h）。研究結果表明6-磷酸葡萄糖與磷酸烯醇式丙酮酸節點是影響鈍齒棒桿菌厭氧發酵產琥珀酸的關鍵節點，為后期通過菌種改造以調節乳酸和琥珀酸的生成比、實現乳酸與琥珀酸聯產奠定了基礎。

鈍齒棒桿菌；氧化還原電位；代謝通量分析；厭氧發酵

琥珀酸與乳酸是廣泛用于食品行業的有機酸［1-3］。鑒于食品安全，食品產業中所用的琥珀酸與乳酸多是通過發酵法生產的，這使得發酵法制備琥珀酸與乳酸具有十分廣闊的市場前景。

鈍齒棒桿菌（Corynebacterium crenatum）發酵產精氨酸時，屬于有氧發酵過程［4］。許虹等［5］研究發現，供氧水平對鈍齒棒桿菌胞內的代謝流分布影響較大。將鈍齒棒桿菌于無氧條件下培養時，琥珀酸與乳酸是其主要產物，但70%左右的葡萄糖會轉化為乳酸，而琥珀酸的產量相對較低，不利于乳酸和琥珀酸的聯產［6-7］。

由3-磷酸甘油醛生成磷酸烯醇式丙酮酸的過程伴隨1分子H還原力的釋放，理論上僅滿足由草酰乙酸至蘋果酸或者由富馬酸至琥珀酸所需的還原力，即：糖酵解途徑所產生的還原力僅滿足制備琥珀酸所需還原力的50%。因此，如果要繼續提高琥珀酸產量，增加微生物胞內的H還原力水平是比較有效的方法之一。如Zheng Pu等［8］利用基因組改組技術得到菌株Actinobacillus succiniogenes F3-II-3-F，該菌株產琥珀酸的能力提高了73%，代謝通量分析結果顯示該菌株胞內煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide，NADH）通量增加是導致琥珀酸產量升高的主要原因。向發酵培養基中添加電子供體或電子受體來改變胞內的氧化還原電勢可以用于調控胞內的H還原力水平，從而影響到微生物的代謝特征。如Li Jian［9］、姜岷［10］等利用鐵氰化鉀和二硫蘇糖醇控制A. succinogenes厭氧發酵產琥珀酸時的氧化還原電位水平，實現了對胞內NADH/NAD+比的調控，使琥珀酸生產速率由0.75 g/（L·h）提高到1.18 g/（L·h）。

秦義等［11］認為，在采用基因工程改造代謝網絡時，要準確分析微生物代謝網絡的結構和特征，以便對其進行定向改造。代謝通量分析是代謝工程研究領域中的一種重要研究方法［12］，通過通量分析可以找到對目的產物影響較大的關鍵節點或者確定整個代謝過程中具有特殊地位的途徑或反應。本實驗擬通過調控發酵培養基的氧化還原電位水平，對菌株在不同氧化還原電位水平下的代謝通量進行分析，考察不同氧化還原電位對鈍齒棒桿菌代謝流分布的影響，找出可以提高琥珀酸產量的關鍵節點，這對于后期通過改造菌種、優化發酵過程以調節乳酸和琥珀酸的生成比，實現乳酸與琥珀酸聯產具有指導意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

鈍齒棒桿菌 CICC20219，購于中國工業微生物保藏中心，合肥工業大學農產品加工重點實驗室保藏。

1.1.2 培養基

菌株增殖培養基：葡萄糖40 g/L、尿素2 g/L、酵母浸粉 2 g/L、酪蛋白氨基酸 7 g/L、硫酸銨7 g/L、磷酸二氫鉀0.5 g/L、磷酸氫二鉀0.5 g/L、硫酸鎂0.5 g/L、硫酸亞鐵6 mg/L、硫酸錳4.2 mg/L、生物素0.2 mg/L、硫胺素0.2 mg/L，pH 7.0，于0.1 MPa滅菌15 min。

發酵培養基：葡萄糖80 g/L、磷酸二氫鉀0.5 g/L、磷酸氫二鉀0.5 g/L、硫酸鎂0.5 g/L、硫酸亞鐵6 mg/L、硫酸錳4.2 mg/L、生物素 0.2 mg/L、硫胺素 0.2 mg/L，pH 7.0，于0.1 MPa滅菌15 min。

1.2 方法

1.2.1 培養方法

1.2.1.1 有氧培養富集菌體

將單菌落鈍齒棒桿菌接種于含30 mL增殖培養基的250 mL搖瓶中，30 ℃、200 r/min培養12 h以制備種子。吸取5 mL種子液接種于含150 mL增殖培養基的搖瓶中，在30 ℃、200 r/min的條件下培養10 h，使生物量大量增加，然后將培養液于5 000 r/min、4 ℃離心10 min收集菌體。

1.2.1.2 厭氧發酵產有機酸

將收集的菌體接種于含1.5 L發酵培養基的3 L發酵罐中，每罐生物量干質量濃度平均為5 g/L左右。通入CO2， 持續5 min后停止通入任何氣體，密封發酵罐，于30 ℃、150 r/min進行厭氧發酵，pH值為7.0，中和劑為MgCO3。每組實驗均重復3 次。

1.2.2 氧化還原電位控制

K3Fe（CN）6與Na2S·7H2O分別作為氧化劑與還原劑。發酵開始后，通過添加1 g/L的K3Fe（CN）6與10 mg/L的Na2S·7H2O分別將發酵液的氧化還原電位控制在原始水平（-56 mV）、-200 mV與-400 mV這3 種水平。發酵過程中，當發酵液的氧化還原電位水平與最初設定的水平相差超過5 mV時，通過人工流加K3Fe（CN）6與Na2S·7H2O將其維持在設定水平。

1.2.3 代謝通量分析

代謝網絡構建方法如文獻［13］所述，主要包括糖酵解（embden meyerhof parna，EMP）途徑、磷酸戊糖途徑、（pentose phosphate pathway，HMP）C4（由草酰乙酸到琥珀酸）途徑及乙醛酸循環。整個代謝網絡包含27 個代謝反應（表1），其中第27號方程為維持細胞代謝的ATP消耗。鈍齒棒桿菌在厭氧培養時不再增殖，其生物量變化很小，因此，在通量計算過程中可以忽略生物量對代謝分布的影響［6-7］。如表2所示，中間代謝物為23 個，據此列出的代謝通量方程為27 個（表1），即變量數與代謝方程數分別為23與27，由此可知方程自由度為4，需測定4 個變量才能對方程求解。本研究可離線精確檢測4 個變量，分別是葡萄糖消耗速率及乳酸、琥珀酸和乙酸的生成速率，可檢測變量與自由度相等，表明代謝方程可求解。

1.2.4 檢測分析方法

發酵液樣品處理與代謝物精確檢測方法如文獻［13］所述。生物量采用干質量法測定［14］。

2 結果與分析

2.1 氧化還原電位調控對發酵結果的影響

微生物胞內的多種代謝反應都涉及電子的得失，因此，可以通過合適手段調控培養基的氧化還原電位以改變代謝網絡中關鍵節點的代謝流分布，使代謝反應朝著有利于目標產物積累的方向進行［15］。在本研究中，通過人為流加K3Fe（CN）6與Na2S溶液分別將發酵培養基的氧化還原電位控制在-56、-200 mV與-400 mV（-56 mV為發酵培養基最初氧化還原電位水平），以研究胞外不同氧化還原電位水平對鈍齒棒桿菌厭氧發酵結果的影響，結果如圖1所示。由于鈍齒棒桿菌在厭氧條件下其生物量變化很小，因此，本研究中忽略了生物量變化對厭氧發酵結果的影響。

由圖1可知，改變發酵培養基的氧化還原電位水平對鈍齒棒桿菌在厭氧發酵條件下的葡萄糖代謝速率、乳酸與琥珀酸的產量影響較大。由1.2.1節可知，本研究是采用兩階段發酵法。在厭氧階段時，生物量平均為5 g/L左右，因此，在發酵開始后的4 h內，3 種氧化還原電位下的葡萄糖利用速率都處于較高的水平（圖1A）。隨著發酵時間的延長，氧化還原電位對底物利用速率的影響開始顯現，降低氧化還原電位水平對葡萄糖利用速率產生不利影響。當氧化還原電位由-56 mV變為-400 mV時，發酵結束后發酵液中殘糖含量由2.3 g/L增加到17.0 g/L，葡萄糖平均利用速率同比下降19%。在降低氧化還原電位后，胞內的NADH/NAD+比會升高［7］，而高水平的NADH/NAD+比會對糖酵解途徑中的3-磷酸甘油醛脫氫酶產生一定的抑制［16］，進而對葡萄糖利用速率產生不利影響。

降低氧化還原電位水平后，鈍齒棒桿菌利用的葡萄糖雖然減少，但發酵液中的琥珀酸終質量濃度明顯增加。由圖1C可知，當氧化還原電位處于-400 mV時，發酵液中琥珀酸終質量濃度由14 g/L上升到20.2 g/L，與-56 mV相比，琥珀酸質量濃度增加了44%，琥珀酸對葡萄糖的得率也由19.5%增加到32%。同時，乳酸質量濃度由44.9 g/L降為35.2 g/L，與-56 mV相比，乳酸質量濃度下降22%，其對葡萄糖的得率也由63%變為59%（圖1B）。

氧化還原電位調控已成功用于對多種厭氧微生物的發酵過程進行代謝調節［17］。已有研究表明，微生物胞外的氧化還原電位變化會對胞內的氧化還原電勢產生影響，主要體現為物質代謝和能量代謝的變化［15，18］。在厭氧發酵過程中，發酵環境的氧化還原電位被人為降低以后會使胞內還原電勢升高，微生物只有通過調節胞內代謝反應以產生還原力更強的代謝產物（如琥珀酸），才能降低胞內的還原電勢以使胞內氧化還原電勢重歸平衡。Sridhar［19］、Liu Rongming［20］等分別對Clostridium thermosuccinogenes、Escherichia coli進行研究時也發現低氧化還原電位水平更有利于琥珀酸的生產。

2.2 氧化還原電位對代謝通量的影響

鈍齒棒桿菌在厭氧發酵時主要利用C4途徑和乙醛酸循環生產琥珀酸，其中C4途徑對還原力的需求較大。已有研究結果表明，降低鈍齒棒桿菌發酵液中的氧化還原電位會增加其胞內的可用還原力水平［7］，而還原力主要由HMP途徑與EMP途徑產生。通過代謝流分析，研究不同氧化還原電位水平下6-磷酸葡萄糖節點處的代謝通量分布變化，可以更深入地了解HMP途徑與EMP途徑對琥珀酸得率的影響，為進一步通過代謝調控提高琥珀酸得率以調節乳酸和琥珀酸生成比，為實現乳酸與琥珀酸聯產提供依據。

本研究對比分析了鈍齒棒桿菌在-56、-200、-400 mV條件下的代謝通量分布變化。在通量計算過程中對結果進行了歸一化處理，所有代謝通量數據單位均為mmol/（L·g·h），即以100 mmol/（L·g·h）的葡萄糖為計算基準。由于代謝通量計算的前提是：假設細胞內的中間代謝物均處于擬穩態，因此取發酵穩定且菌體代謝旺盛時的發酵液以精確計算葡萄糖消耗速率及乳酸、琥珀酸、乙酸生成速率，并將其作為代謝通量常數項代入方程進行求解，更能準確地比較分析鈍齒棒桿菌在氧化還原電位調控前后的代謝通量分布變化。本實驗取發酵時間6～8 h時間段的樣品進行代謝通量分析，代謝通量計算結果如表3所示。調控氧化還原電位對6-磷酸葡萄糖節點處的代謝流分布產生顯著影響，氧化還原電位越低，HMP途徑的代謝通量越大。氧化還原電位為-56 mV時，HMP途徑（J9）與EMP途徑（J2）的代謝通量比為9.89∶90.11，將氧化還原電位調為-400 mV時，HMP途徑與EMP途徑的代謝通量比增加為27.09∶72.91，HMP途徑代謝通量同比增加了1.74 倍。HMP通量增加后，磷酸烯醇式丙酮酸節點處的代謝通量分布也有較大變化。氧化還原電位調為-56 mV時，流向C4途徑的通量（J22）與流向丙酮酸的通量比為（J7）31.73∶164.97，表明多數葡萄糖用于乳酸的生成。氧化還原電位為-400 mV時，與-56 mV相比，流向C4途徑的代謝通量增加了78%，結果使琥珀酸通量由31.73 mmol/（L·g·h）增加到56.53 mmol/（L·g·h），同時，乳酸通量（J16）由159.73 mmol/（L·g·h）下降為133.50 mmol/（L·g·h），主要副產物乙酸的通量也下降了98%。

菌株產琥珀酸的代謝途徑主要是EMP途徑、HMP途徑、C4途徑及乙醛酸循環，已有研究結果表明C4途徑是該菌株產琥珀酸的主要代謝途徑，經由C4途徑生產的琥珀酸占整個琥珀酸產量的93%以上［13］。利用C4途徑產琥珀酸，理論上每消耗1 mol葡萄糖可產生2 mol琥珀酸，需要4 mol NADH，而每摩爾葡萄糖經由EMP途徑只產生2 mol的NADH［21-22］，即使考慮HMP途徑所產生的還原力（由于糖酵解途徑是菌株代謝葡萄糖的主要途徑），微生物胞內的總NADH也處于不足的水平，所以NADH不足是鈍齒棒桿菌厭氧發酵制備琥珀酸的核心矛盾之一。微生物胞內的氧化還原態勢會受到外界環境變化的影響，氧化還原電位的改變會對胞內的氧化還原態勢產生影響，主要表現為NADH/NAD+比的改變［23］。NADH及NAD+是3-磷酸甘油醛脫氫酶、乳酸脫氫酶、蘋果酸脫氫酶及琥珀酸脫氫酶等關鍵酶的輔酶，因此，胞外氧化還原電位的調控會對微生物代謝產物的分布產生復雜影響，進而影響到菌株的整個代謝通量分布［6，17，24］。如本研究結果所示，降低氧化還原電位后，HMP代謝通量增加，細胞可以合成更多的NADPH，NADPH可以在轉氫酶的作用下轉化為NADH，繼而用于產生更多的琥珀酸。結果表明，6-磷酸葡萄糖與磷酸烯醇式丙酮酸節點是影響鈍齒棒桿菌厭氧發酵產琥珀酸的關鍵節點，即對6-磷酸葡萄糖進行代謝調控可以調節乳酸和琥珀酸的生成比。

3 結 論

微生物胞外的氧化還原電位變化會對胞內的物質代謝和能量代謝產生影響。本實驗研究了不同氧化還原電位水平對鈍齒棒桿菌厭氧發酵特性的影響并對其代謝通量分布進行了分析。發酵結果顯示，不同氧化還原電位水平對鈍齒棒桿菌在厭氧發酵條件下的葡萄糖代謝速率、乳酸及琥珀酸的產量影響較大，降低發酵液氧化還原電位水平對6-磷酸葡萄糖與磷酸烯醇式丙酮酸節點處的代謝流分布影響顯著，使更多的碳源流向HMP途徑與C4途徑，以增加胞內還原力的可用水平與琥珀酸產量，說明低氧化還原電位更有利于琥珀酸的產生。本實驗確定了6-磷酸葡萄糖與磷酸烯醇式丙酮酸節點是影響鈍齒棒桿菌產琥珀酸的關鍵節點，即對6-磷酸葡萄糖與磷酸烯醇式丙酮酸節點進行代謝調控可以調節乳酸和琥珀酸的生成比，為后期通過菌種改造以調節乳酸和琥珀酸的生成比、實現乳酸與琥珀酸聯產奠定了基礎。

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Effect of Redox Potential Regulation on Metabolic Flux Distribution of Corynebacterium crenatum

CHEN Xiaoju1，2， CAO Xinmin2， JIANG Shaotong2， LI Xingjiang2，*
（1. College of Chemistry and Material Engineering， Chaohu University， Chaohu 238000， China；2. College of Food Science and Engineering， Hefei University of Technology， Hefei 230009， China）

For the co-production of lactic acid and succinic acid， the effect of redox potential regulation on the fermentation

Corynebacterium crenatum； redox potential； metabolic flux analysis； anaerobic fermentation

10.7506/spkx1002-6630-201609031

Q812

A

1002-6630（2016）09-0165-05

陳小舉， 操新民， 姜紹通， 等. 氧化還原電位調控對鈍齒棒桿菌代謝通量分布的影響［J］. 食品科學， 2016， 37（9）： 165-169. DOI：10.7506/spkx1002-6630-201609031. http：//www.spkx.net.cn

CHEN Xiaoju， CAO Xinmin， JIANG Shaotong， et al. Effect of redox potential regulation on metabolic flux distribution of Corynebacterium crenatum［J］. Food Science， 2016， 37（9）： 165-169. （in Chinese with English abstract） DOI：10.7506/ spkx1002-6630-201609031. http：//www.spkx.net.cn

2015-05-08

國家自然科學基金面上項目（31470002）；安徽省高等學校自然科學研究重點項目（KJ2015A216）；巢湖學院科研啟動項目（KYQD-201402）

陳小舉（1984—），男，博士研究生，研究方向為生物資源綜合利用。E-mail：chenxiaoju2012@hotmail.com

*通信作者：李興江（1978—），男，副教授，博士，研究方向為食品發酵工程。E-mail：lixingjiang1978@hfut.edu.cn

process of Corynebacterium crenatum was studied and the metabolic flux distribution was also analyzed. When the redox potential level was changed from -56 to -400 mV， the concentration of succinic acid in the fermented broth increased from 14 to 20.2 g/L；meanwhile， the concentration of lactic acid decreased from 44.9 to 35.2 g/L. The results of metabolic flux analysis indicated the metabolic flux distribution at the glucose 6-phosphate and phosphoenolpyruvate nodes were affected significantly. Compared with the value obtained at -56 mV， the flux of pentose phosphate pathway （HMP） pathway increased by 2.74 fold and the flux from phosphoenolpyruvate to oxaloacetate increased by 78%. As a result， the flux of succinic acid increased from 31.73 to 56.53 mmol/（L·g·h） and the flux of lactic acid decreased from 159.73 to 133.50 mmol/（L·g·h）. The results of this study demonstrated that glucose 6-phosphate and phosphoenolpyruvate were the key nodes that could affect the production of succinic acid by C. crenatum fermentation under anaerobic conditions， which has contributed to the co-production of lactic acid and succinic acid by manipulating wild-type C. crenatum to change the ratio of succinic acid/ lactic acid through metabolic engineering.