矢車菊素-3-O-葡萄糖苷進入巨噬細胞的熒光檢測

張英慧，王丙云，黃劍波，計慧琴，馬艷玲，鐘希瓊，董華強

（1.佛山科學技術學院北院食品安全系，廣東 南海 528231；2.佛山科學技術學院北院動物醫學系，廣東 南海 528231）

矢車菊素-3-O-葡萄糖苷進入巨噬細胞的熒光檢測

張英慧1，王丙云2，黃劍波1，計慧琴2，馬艷玲1，鐘希瓊1，董華強1

（1.佛山科學技術學院北院食品安全系，廣東 南海 528231；2.佛山科學技術學院北院動物醫學系，廣東 南海 528231）

利用熒光技術探索矢車菊素-3-O-葡萄糖苷（cyanidin 3-O-glucoside，C3G）在體外培養的巨噬細胞中的分布。首先采用熒光分光光度法掃描C3G的特異激發波長和發射波長，再利用激光共聚焦技術探討C3G進入小鼠和人巨噬細胞的過程以及C3G在細胞中的定位，并分析C3G孵育時間對細胞內熒光強度變化的影響。結果表明：在488 nm和520 nm的激發波長下，C3G孵育15 min的細胞質內開始呈現綠色和紅色熒光，并且隨著孵育時間的變化，細胞內熒光強度逐漸增強，其中孵育60 min可觀察到熒光布滿細胞核，其熒光強度是孵育前的6.45 倍。研究表明采用特異波長的激光共聚焦斷層掃描技術可示蹤到花色苷在干預細胞內的分布，結果顯示花色苷C3G可快速穿過巨噬細胞的細胞膜和核膜，直達細胞核。

矢車菊素-3-O-葡萄糖苷；巨噬細胞；激光共聚焦顯微技術；熒光分光光度法

矢車菊素-3-O-葡萄糖苷（cyanidin 3-O-glucoside，C3G）類屬于植物中的花青素類，為呈色物質，其天然提取物粉末為紫紅色，是自然界分布最廣的花色苷。盡管大量的研究證實C3G具有抗氧化［1］、降血脂［1］、抗腫瘤［2］、抗炎癥［3］、抑制血小板凝集［4］、預防糖尿?。?］、減肥［6］、保護視力［7］和保護神經元細胞［8］等諸多生理活性，但其在機體細胞中的存在部位和結合位點目前尚無定論。

高效液相色譜是目前普遍應用的檢測C3G的方法，血液中C3G的含量可采用高效液相色譜的方法檢測［9-10］，但是這種方法應用于體外培養細胞中C3G的檢測有一定的難度，由于細胞培養的數量有限，干預后進入細胞內的C3G有限，C3G的豐度往往低于儀器的靈敏度。另外，高效液相色譜也很難檢測到C3G在細胞中的定位。再加上細胞膜、細胞漿、細胞核的分離過程必然增加了C3G的損失。Agati等［11］報道花青素為植物細胞中的熒光物質，具有特定的吸收波長和發射波長，例如葡萄中花青素的特異吸收波長為540 nm，最大發射波長為685 nm，并利用這一特性建立了植物活體中該類色素的檢測方法；Lin Yakang等［12］利用包括花青素在內的類黃酮物質的熒光研究了植物化學物在玉米細胞中的合成與轉運。

激光共聚焦顯微鏡作為近年來發展起來的大型生物學分析儀器，它借助熒光標記方法，采用激光作為光源，使激光經過照明針孔后形成點光源，對焦平面每一點進行掃描，并在共焦針孔處成像，大大提高了圖像分辨率和檢測靈敏度，具有活細胞動態監測、斷層掃描及三維圖像重建等功能，可對所觀察細胞內熒光標記的物質進行定量、定性、定位和時空監測［13-14］。

本實驗綜合借鑒以上方法，首先掃描了C3G特異的熒光波長，并根據特征波長進行激光共聚焦斷層掃描，嘗試觀察C3G是否可以進入小鼠和人的巨噬細胞中。

1 材料與方法

1.1 材料、培養基與試劑

15 只SPF級C57BL/6J雌性小鼠（動物合格證號：SCXK（粵）2013-0002），體質量為18～22 g，由廣東省醫學實驗動物中心提供；THP-1細胞株 美國培養物典藏中心（American Type Culture Collection，ATCC）。

RPMI1640培養基 美國Gibco公司。

C3G 挪威Polyphenols Laboratories AS公司；豆蔻酰佛波醇乙酯（phorbol-12-myristate-13- acetate，PMA）、臺盼藍、多聚甲醛 美國Sigma公司；抗生素（青霉素和鏈霉素） 美國Invitrogen公司；0.01 mol/L pH 7.2～7.4磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）福州邁新生物技術開發有限公司；胎牛血清（fetal bovine serum，FBS） 美國Gibco公司；細胞培養板 美國Corning公司；玻璃底細胞培養皿 美國MatTek公司。

1.2 儀器與設備

CO2培養箱 美國Haraeus公司；熒光分光光度計美國Varian公司；倒置顯微鏡 重慶光學儀器廠；冷凍離心機 德國Eppendorf公司；FV500-IX81 OLYMPUS激光共聚焦顯微鏡 日本Olympus公司。

1.3 方法

1.3.1 C3G熒光波長的掃描

將C3G溶解到PBS中，配成終濃度為1 mmol/L的溶液，利用熒光分光光度計進行發射波長和激發波長的掃描，確定C3G特異的激發波長和發射波長。對照組為PBS溶液。

1.3.2 激光共聚焦顯微鏡掃描C3G在巨噬細胞中的分布

1.3.2.1 檢測C3G在小鼠腹腔巨噬細胞中的分布

1）小鼠腹腔注射1 mL無菌液體石蠟，3 d后收集腹部巨噬細胞。具體方法為：小鼠腹部消毒，沿中線注入3～4 mL冰中預冷的無菌PBS，輕輕按摩腹部5 min。無菌剪開腹壁，用吸管吸出滲出液，再用同樣體積的預冷的PBS沖洗腹腔2～3 次，合并滲出液于離心管中，4 ℃、800 r/min條件下離心5 min，去上清液。用預冷的RPMI-1640培養液洗滌細胞2～3 次，每次4 ℃、800 r/min 離心5 min，去上清液，用預冷的適量RPMI-1640培養液懸浮細胞，臺盼藍染色計數，調整細胞濃度為1.0×105/mL，加于含蓋玻片的6 孔培養板中，于玻片上爬壁4 h。

2）棄去未貼壁細胞，加含50 μmol/L C3G的體積分數10% FBS-RPMI1640完全培養基培養0～1 h。分別取0、15、30、45、60 min 各時段進行體積分數4%多聚甲醛固定5 min。每次實驗設3個重復孔，獨立重復3 次。

3）以FV500-IX81 OLYMPUS激光共聚焦顯微鏡600 倍水鏡斷層掃描固定后的細胞，激發波長分別設置為488 nm和520 nm。操作設置為：PmT1881，Gain 2.4，C.A 715，MAr220.5%；PmT2791，Gain 2.0，offset 5%，C.A 580nm，He 50.0%。圖像生成采用FluoView軟件。

1.3.2.2 檢測C3G在人巨噬細胞株THP-1中的分布

1）將人THP-1單核/巨噬細胞以2.0×105/孔接種于6孔玻璃底細胞培養皿，以含100 ng/mL PMA、體積分數10% FBS、2 mmol/L L-谷氨酰胺、100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素的RPMI 1640在體積分數5% CO2的培養箱中37 ℃條件下誘導分化貼壁48 h。

2）PBS洗3 次，加含50 μmol/L C3G的10% FBSRPMI1640完全培養基培養0～1 h。每次實驗設3 個重復孔，獨立重復3 次。

3）以FV500-IX81 OLYMPUS激光共聚焦顯微鏡600 倍水鏡斷層掃描干預后的細胞，激發波長分別設置為488 nm和520 nm。操作設置同1.3.2.1節3），利用FluoView軟件合成圖像并計算平均熒光強度。

1.4 數據分析

采用SPSS13.0軟件包建立數據庫，并進行統計分析。結果以±s表示。多組均數進行單因素方差分析，各組間的兩兩比較采用Tukey's honestly法，P＜0.05為差異顯著。

2 結果與分析

2.1 C3G熒光波長的掃描

利用熒光分光光度計掃描1 mmol/L C3G-PBS溶液的發射波長和激發波長。由圖1可知，1 mmol/L C3G-PBS溶液在488 nm激發下于520 nm處有弱的熒光發射（圖1a），在520 nm激發下于630 nm左右有弱的熒光發射（圖1c），而PBS在相同的激發條件下無熒光（圖1b、d）。

2.2 激光共聚焦顯微鏡斷層掃描檢測C3G在巨噬細胞中的分布

2.2.1 C3G在小鼠腹腔巨噬細胞中的分布

激光共聚焦斷層掃描技術可逐層觀察細胞的橫切面，圖2顯示了50 μmol/L C3G孵育小鼠腹腔巨噬細胞0～60 min，激光共聚焦顯微鏡觀察到的C3G的熒光分布。C3G在488 nm激發波長下呈現綠色熒光，在520 nm激發波長下呈現紅色熒光，紅色熒光的強度高于綠色熒光。孵育小鼠巨噬細胞15 min左右，即有帶熒光的C3G進入細胞質，隨時間的增加，熒光強度逐漸增加，孵育60 min左右C3G甚至可到達小鼠巨噬細胞的細胞核。

2.2.2 C3G在人巨噬細胞株THP-1中的分布

激光共聚焦顯微鏡觀察到50 μmol/L C3G孵育人巨噬細胞株THP-1 30 min，僅有弱的熒光物質聚集于細胞膜周圍，45 min時細胞中熒光略強，60 min繼續增強，并有部分細胞表現為已染核（圖3）。以FluoView軟件計算平均熒光強度，C3G孵育THP-1細胞的時間延長到60 min，細胞內的平均熒光強度為孵育前的6.45 倍（表1）。

3 討 論

實驗結果顯示C3G 具有特定的激發波長和發射波長，激光共聚焦顯微鏡斷層掃描結果表明C3G可以進入小鼠和人的巨噬細胞，在488 nm和520 nm的光波激發下，C3G在細胞內分別呈現綠色和紅色熒光，雖然熒光強度較弱。小鼠腹腔巨噬細胞對C3G的攝取能力高于人巨噬細胞系THP-1，孵育15 min即可呈現熒光，而分化的THP-1細胞只有在孵育30 min以后才呈現明顯的時間-熒光強度梯度變化。有研究者發現小鼠在灌胃果汁30 min內可利用高效液相色譜的方法在血液和腦組織檢測到花色苷的濃度高峰［9］，人在飲用富含花色苷的飲料后1～2 h內血液中C3G可達到高峰［10，15］，Fernandes等［16］報道花青素可以穿過中度分化的胃腺癌細胞MKN-28，提示花青素可能會穿過胃壁屏障，這也許是花色苷迅速出現在血液中的原因?；ㄉ杖绱丝斓奈辙D運速率與本實驗在巨噬細胞中檢測到的結果相一致。

利用熒光檢測動物細胞對類黃酮化合物的吸收方法曾經應用于矢車菊素的結構類似物槲皮素的研究上，槲皮素具有黃酮醇的結構，植物的花青素和黃酮醇都以二氫黃酮醇為前體物由酶催化生成，二氫黃酮醇還原酶是植物體內產生花青素的關鍵酶。酸性溶液中的還原反應可使槲皮素轉化為矢車菊素。Kuo等［17］早在1996年利用熒光顯微鏡檢測了經100 μmol/L槲皮素孵育40 min的Caco-2細胞，認為槲皮素在細胞內有積累，其最大發射峰為550 nm，并且槲皮素主要分布于核仁周圍。Walgren等［18］證明了槲皮素-4'-β-葡萄糖苷15 min即可進入Caco-2細胞，并呈現出熒光，而其代謝物槲皮素-3-硫酸酯則沒有熒光，說明分子的極性和結構的改變影響熒光的產生。Nifli等［19］利用另一個細胞系HepG2檢測到細胞內攝的槲皮素在488 nm紫外光激發下，于500～540 nm波長處有特異的熒光，配合質譜分析認為天然的槲皮素是孵育初期細胞內的主要形式，也是熒光的來源，雖然在15 min后出現少量的甲基化代謝物，但是并未檢測到槲皮素的氧化衍生物。

目前并未見有關C3G在培養的動物細胞中自發熒光的報道。本研究表明C3G在巨噬細胞中不但類似于槲皮素-4'-β-葡萄糖苷發射綠色熒光，還可以發射紅色熒光，而且紅色熒光的強度明顯高于綠色熒光。

C3G在細胞內不同部位呈現多種生物活性，例如C3G可降低低氧環境下人臍靜脈血管內皮細胞中自由基水平的增加，減緩氧化應激，并抑制血管生成和細胞凋亡［20］；C3G可降低細胞內自由基的生成，抑制高糖誘導的線粒體膜電位損傷，下調細胞內促凋亡因子Bax的表達［21］；C3G可以降低糖尿病小鼠內皮細胞的內質網應激水平［22］；研究表明C3G可以通過氫鍵和疏水作用力直接結合在小牛胸腺DNA上，并自發地保護DNA免受自由基的損傷［23］，C3G還可抑制赭曲霉素A誘導的人成纖維細胞的DNA損傷［24］；前期研究表明C3G可以激活多個細胞核受體報告基因的表達［25］，本研究檢測到C3G可進入細胞核，提示了C3G作為核受體的激動劑發揮作用或直接調控細胞核內基因表達的可能性。

本研究利用熒光分光光度計掃描1 mmol/L C3G-PBS溶液的發射波長和激發波長，確定1 mmol/L C3G-PBS溶液在488 nm激發下有弱的熒光發射波長520 nm，在520 nm激發下有弱的630 nm左右的熒光發射波長。利用激光共聚焦顯微鏡斷層掃描C3G在小鼠腹腔巨噬細胞和人巨噬細胞株THP-1中的分布。檢測結果表明，小鼠腹腔巨噬細胞對C3G的攝取能力高于人巨噬細胞THP-1。無論是小鼠巨噬細胞還是人巨噬細胞THP-1，C3G進入細胞中的熒光強度隨著時間的增加而逐漸增加，并可穿過細胞質進入細胞核中，其跨膜轉運的機制和C3G與細胞內各種物質的相互作用關系有待深入探討。

［1］ DUCHNOWICZ P， BRONCEL M， PODS?DEK A， et al. Hypolipidemic and antioxidant effects of hydroxycinnamic acids，quercetin， and cyanidin 3-glucoside in hypercholesterolemic erythrocytes （in vitro study）［J］. European Journal of Nutrition， 2012，51（4）： 435-443. DOI：10.1007/s00394-011-0227-y.

［2］ 陳亮， 辛秀蘭， 袁其朋. 矢車菊-3-葡萄糖的抗癌效應研究進展［J］.食品科學， 2013， 34（13）： 329-333. DOI：10.7506/spkx1002-6630-201313069.

［3］ ZHANG Y H， LIAN F Z， ZHU Y N， et al. Cyanidin-3-O-β-glucoside inhibits LPS-induced expression of inflammatory mediators through decreasing IκBα phosphorylation in THP-1 cells［J］. Inflammation Research， 2010， 59（9）： 723-730. DOI：10.1007/s00011-010-0183-7.

［4］ 鄧秀娟， 任婧， 宋豐林， 等.矢車菊素-3-葡萄糖苷對高膽固醇血癥小鼠血小板顆粒物釋放的影響［J］. 熱帶醫學雜志， 2015， 15（1）： 4-7.

［5］ SUN C D， ZHANG B， ZHANG J K， et al. Cyanidin-3-glucoside-rich extract from Chinese bayberry fruit protects pancreatic β cells and ameliorates hyperglycemia in streptozotocin-induced diabetic mice［J］. Journal of Medicinal Food， 2012， 15（3）： 288-298. DOI：10.1089/ jmf.2011.1806.

［6］ 衛曉怡， 白晨， 唐立偉， 等. 矢車菊素-3-葡萄糖苷對骨骼肌細胞脂蛋白脂肪酶活性的影響［J］. 食品科學， 2013， 34（5）： 246-250.

［7］ LEE S H， JEONG E， PAIK S S， et al. Cyanidin-3-glucoside extracted from mulberry fruit can reduce N-methyl-N-nitrosourea-induced retinal degeneration in rats［J］. Current Eye Research， 2013， 39（1）： 79-87. DOI：10.3109/02713683.2013.825275.

［8］ MIN J， YU S W， BAEK S H， et al. Neuroprotective effect of cyanidin-3-O-glucoside anthocyanin in mice with focal cerebral ischemia［J］. Neuroscience Letters， 2011， 500（3）： 157-161. DOI：10.1016/ j.neulet.2011.05.048.

［9］ MARCZYLO T H， COOKE D， BROWN K， et al. Pharmacokinetics and metabolism of the putative cancer chemopreventive agent cyanidin-3-glucoside in mice［J］. Cancer Chemotherapy and Pharmacology， 2009， 64（6）： 1261-1268. DOI：10.1007/s00280-009-0996-7.

［10］ de FERRARS R M， CZANK C， ZHANG Q， et al. The pharmacokinetics of anthocyanins and their metabolites in humans［J］. British Journal of Pharmacology， 2014， 171（13）： 3268-3282. DOI：10.1111/bph.12676.

［11］ AGATI G， MEYER S， MATTEINI P， et al. Assessment of anthocyanins in grape （Vitis vinifera L.） berries using a noninvasive chlorophyll fluorescence method［J］. Journal of Agricultural and Food Chemistry， 2007， 55（4）： 1053-1061. DOI：10.1021/jf062956k.

［12］ LIN Y， IRANI N G， GROTEWOLD E. Sub-cellular trafficking of phytochemicals explored using auto-fluorescent compounds in maize cells［J］. BMC Plant Biology， 2003， 3（1）： 1-12. DOI：10.1186/1471-2229-3-10.

［13］ GUST A， ZANDER A， GIETL A， et al. A starting point for fluorescence-based single-molecule measurements in biomolecular research［J］. Molecules， 2014， 19（10）： 15824-15865. DOI：10.3390/ molecules191015824.

［14］ 游雪嬌， 李良秋， 馬連營， 等. 激光共聚焦掃描顯微鏡在抗菌機理研究中的應用［J］. 微生物學通報， 2015， 42（6）： 1108-1121.

［15］ CAO G， MUCCITELLI H U， SANCHEZ-MORENO C， et al. Anthocyanins are absorbed in glycated forms in elderly women： a pharmacokinetic study［J］. American Journal of Clinical Nutrition，2001， 73（5）： 920-926. DOI：10.1016/j.jmr.2006.06.015.

［16］ FERNANDES I， de FREITAS V， REIS C， et al. A new approach on the gastric absorption of anthocyanins［J］. Food & Function， 2012，3（5）： 508-516. DOI：10.1039/C2FO10295A.

［17］ KUO S M. Antiproliferative potency of structurally distinct dietary flavonoids on human colon cancer cells［J］. Cancer Letters， 1996，110（Suppl1/2）： 41-48. DOI：10.1016/S0304-3835（96）04458-8.

［18］ WALGREN R A， LIN J T， KINNE R K， et al. Cellular uptake of dietary flavonoid quercetin 4'-beta-glucoside by sodium-dependent glucose transporter SGLT1［J］. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics， 2000， 294（3）： 837-843. DOI：10.1134/ S0036023608100112.

［19］ NIFLI A P， THEODOROPOULOS P A， MUNIER S， et al. Quercetin exhibits a specific fluorescence in cellular milieu： a valuable tool for the study of its intracellular distribution［J］. Journal of Agricultural and Food Chemistry， 2007， 55（8）： 2873-2878. DOI：10.1021/jf0632637.

［20］ ANWAR S， SPECIALE A， FRATANTONIO D， et al. Cyanidin-3-O-glucoside modulates intracellular redox status and prevents HIF-1 stabilization in endothelial cells in vitro exposed to chronic hypoxia［J］. Toxicology Letters， 2014， 226（2）： 206-213. DOI：10.1016/ j.toxlet.2014.01.048.

［21］ JIANG X W， TANG X L， ZHANG P W， et al. Cyanidin-3-O-βglucoside protects primary mouse hepatocytes against high glucoseinduced apoptosis by modulating mitochondrial dysfunction and the PI3K/Akt pathway［J］. Biochemical Pharmacology， 2014， 90（2）： 135-144. DOI：10.1016/j.bcp.2014.04.018.

［22］ ZHAO R Z， XIE X P， LE Khuong， et al. Endoplasmic reticulum stress in diabetic mouse or glycated LDL-treated endothelial cells：protective effect of Saskatoon berry powder and cyanidin glycans［J］. Journal of Nutritional Biochemistry， 2015， 26（11）： 1248-1253. DOI：10.1016/j.jnutbio.2015.05.015.

［23］ ZHANG C， GUO X F， CAI W Q， et al. Binding characteristics and protective capacity of cyanidin-3-glucoside and its aglycon to calf thymus DNA［J］. Journal of Food Science， 2015， 80（4）： H889-H893. DOI：10.1111/1750-3841.12823.

［24］ RUSSO A， FAUCI L L， ACQUAVIVA R， et al. Ochratoxin A-induced DNA damage in human fibroblast： protective effect of cyanidin 3-O-β-D-glucoside［J］. Journal of Nutritional Biochemistry， 2005， 16（1）： 31-37. DOI：10.1016/j.jnutbio.2004.05.005.

［25］ 張英慧， 王丙云， 計慧琴， 等. 花色苷對LO2細胞核受體報告基因的影響［J］. 食品科學， 2011， 32（21）： 156-160.

Fluorescence Detection of the Entry of Cyanidin-3-O-Glucoside into Macrophages

ZHANG Yinghui1， WANG Bingyun2， HUANG Jianbo1， JI Huiqin2， MA Yanling1， ZHONG Xiqiong1， DONG Huaqiang1
（1. Department of Food Safety， Foshan University （Northern Campus）， Nanhai 528231， China；2. Department of Veterinary Medicine， Foshan University （Northern Campus）， Nanhai 528231， China）

The distribution of cyanidin-3-O-glucoside （C3G） in cultured mouse and human macrophages was detected with fluorescence technique. First， the specific excitation wavelength and emission wavelength of C3G were scanned with fluorescence spectrophotometric assay. Then， a confocal laser scanning microscopy was utilized to investigate the entry process of C3G into cultured mouse macrophages and human macrophage THP-1 cells， and to trace the location of C3G as well as the change in fluorescence intensity in the cells during incubation. The results showed that green and red fluorescence in macrophages after 15 min C3G incubation could be detected with light excitation at 488 nm and 520 nm， respectively. The fluorescence signals were enhanced in the cells as the incubation time was prolonged. The special fluorescence appeared in nuclei when the cells were treated with C3G for 60 min， and the average fluorescence intensity was enhanced by 6.45 folds when C3G incubation time was increased up to 60 min. These results indicated that the distribution of C3G in cells during incubation could be traced with laser scanning confocal microscopy assay. It was concluded that C3G could pass rapidly through the cell membrane and nuclear membrane of macrophages， and entered directly the cell nucleus.

cyanidin-3-O-glucoside； macrophages； confocal laser scanning microscopy； fluorescence spectrophotometric assay

10.7506/spkx1002-6630-201609037

TS201.4

A

1002-6630（2016）09-0198-05

張英慧， 王丙云， 黃劍波， 等. 矢車菊素-3-O-葡萄糖苷進入巨噬細胞的熒光檢測［J］. 食品科學， 2016， 37（9）： 198-202. DOI：10.7506/spkx1002-6630-201609037. http：//www.spkx.net.cn

ZHANG Yinghui， WANG Bingyun， HUANG Jianbo， et al. Fluorescence detection of the entry of cyanidin-3-O-glucoside into macrophages［J］. Food Science， 2016， 37（9）： 198-202. （in Chinese with English abstract） DOI：10.7506/spkx1002-6630-201609037. http：//www.spkx.net.cn

2015-07-24

國家自然科學基金項目面上項目（31071537）；廣東省科技計劃項目（2011A030100018）；佛山市科技創新專項資金項目（2014GA000425）

張英慧（1974—），女，副教授，博士，研究方向為食品營養與安全。E-mail：zhang_ying-hui@163.com