半乳糖基甘油月桂酸單酯的抑菌活性和穩定性

刁明明，齊丹萍，張 充，別小妹，呂鳳霞，陸兆新，趙海珍*

（南京農業大學食品科技學院，江蘇 南京 210095）

半乳糖基甘油月桂酸單酯的抑菌活性和穩定性

刁明明，齊丹萍，張 充，別小妹，呂鳳霞，陸兆新，趙海珍*

（南京農業大學食品科技學院，江蘇 南京 210095）

研究半乳糖基甘油月桂酸單酯對食品中幾種常見腐敗菌的抑菌作用及其穩定性。方法：采用倍比稀釋法測定半乳糖基甘油月桂酸單酯對5 種細菌和3 種真菌的最小抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）。同時以大腸桿菌和蠟樣芽孢桿菌為指示菌，研究pH值、溫度、紫外線照射及NaCl質量分數對半乳糖基甘油月桂酸單酯抑菌穩定性的影響。結果：半乳糖基甘油月桂酸單酯對大腸桿菌、蠟樣芽孢桿菌等5 種細菌具有較好的抑菌活性，而對黃曲霉、黑曲霉和釀酒酵母等真菌的抑制效果不明顯或無抑制效果。半乳糖基甘油月桂酸單酯對熒光假單胞菌的MIC為0.078 mg/mL，對大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、蠟樣芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌的MIC均為0.156 mg/mL。半乳糖基甘油月桂酸單酯在pH 5～8范圍內具有較好的抑菌活性，經溫度和紫外線照射處理后，抑菌活性有微弱下降，隨著NaCl質量分數的增加，其抑菌活性顯著下降。

半乳糖基甘油月桂酸單酯；抑菌活性；穩定性

刁明明， 齊丹萍， 張充， 等. 半乳糖基甘油月桂酸單酯的抑菌活性和穩定性［J］. 食品科學， 2016， 37（15）: 1-6.

DIAO Mingming， QI Danping， ZHANG Chong， et al. Antimicrobial properties and stability of galactosyl monolaurin［J］. Food Science， 2016， 37（15）: 1-6. （in Chinese with English abstract） DOI:10.7506/spkx1002-6630-201615001. http://www.spkx.net.cn

在食品工業中，各類食品的防腐保鮮始終是一個亟待解決的重要問題，據不完全統計，我國每年約有20%～30%的食物因為各種腐敗變質而損失［1-2］。食品腐敗的原因主要包括物理因素、化學因素、酶及微生物四方面，其中以微生物的作用最為嚴重［3］。食品腐敗變質不僅降低食品的營養價值，而且還可產生各種有毒有害物質，引起食用者發生急性中毒或產生慢性毒害。因此，食品防腐是防止食品的腐敗、保障食品安全的重要手段。傳統的防腐方法如煙熏、干制、鹽腌等會影響食品的風味、質地，而現代的防腐技術如冷凍干燥、真空包裝、輻射保藏等不能適用于所有食品，且成本較高，為保證食品在保質期內不發生腐敗變質，食品防腐劑在現代食品工業中被廣泛應用［4-5］。隨著食品工業的發展，人們對于防腐劑的要求越來越高，而傳統的有機酸型食品防腐劑如山梨酸鉀、苯甲酸鈉等的功效受pH值的影響較大，在中性、偏堿性食品中效果不佳［6］。因此，開發新型的抗菌性強、安全無毒、適應性廣、穩定性強的食品防腐劑具有重要的意義。

甘油糖酯是糖類通過還原末端以α-或β-糖苷鍵與親脂性的長鏈單脂酰基或二脂酰基甘油相連接起來的一類化合物［7］。甘油糖酯廣泛存在于植物界和微生物中，是細菌原生質膜、植物葉綠體類囊膜的主要組成成分，參與細胞膜的識別活動［7-8］。甘油糖酯是一種非離子型表面活性劑，具有兩親性結構，這種特殊的兩親性使它具有抗氧化、抗菌、抗腫瘤、溶血、免疫抑制等多種生理活性［8-13］。目前國內外對酶法合成的脂肪酸糖酯及其抗菌活性有較多的報道，劉巧瑜等［14］研究發現月桂酸麥芽糖單酯和蔗糖月桂酸單酯對大腸桿菌、蠟樣芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌等多種細菌具有較好的抑菌活性。Nobmann等［15］報道了新合成的甲基化葡萄糖月桂酸單醋和月桂酸甘露糖單酯對L. monocytogenes具有較好的抑菌活性，而且甲基化的辛酸葡萄糖單酯對Escherichia coli和Pseudomouas fluorescens有一定的抑制作用。但關于甘油糖酯抑菌活性的研究卻鮮有報道，有研究者從菊科植物Serratula strangulata的根莖中分離得到3 種甘油糖酯，其對大腸桿菌、枯草芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌3 種細菌具有明顯的抑制作用［16］。Deml等［17］從苔草裂孢黑粉菌（Schizonella melanogramma）中分離到兩種甘油糖酯Schizonelin A和B對革蘭氏陽性菌和某些革蘭氏陰性菌也有一定的抑制作用。為進一步研究甘油糖酯的抑菌活性，本實驗采用酶法合成半乳糖基甘油月桂酸單酯（簡稱C12單酯），考察C12單酯對幾種細菌、霉菌和酵母菌的抑菌活性大小及其對溫度、pH值、紫外線、NaCl的抑菌穩定性，為開發一種高效、安全、適應性廣的新型甘油糖酯類食品防腐保鮮劑奠定理論基礎，同時豐富天然食品防腐劑的品種。

1　材料與方法

1.1菌株與培養基

大腸桿菌（Escherichia coli）ATCC 25922、熒光假單胞菌（Pseudomouas fluorescens）ATCC 49642、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）ATCC 6633、蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus）ATCC 14579、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）ATCC 25923、黑曲霉（Aspergillus niger）AS 3.350、黃曲霉（Aspergillus flavus）CICC 2062、釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）CICC 32788，均由南京農業大學食品科技學院酶工程實驗室保藏。

營養瓊脂（NA）培養基用于細菌的培養，馬鈴薯葡萄糖（PDA）培養基用于真菌的培養［18］。

1.2材料制備

半乳糖基甘油、C12單酯（純度＞97%）由南京農業大學食品科技學院酶工程實驗室自制。C12單酯為乳白色固體，性質穩定，在-20 ℃能貯存較長時間，不易溶于水，易溶于甲醇、乙醇、丙酮、三氯甲烷等有機溶劑中。

半乳糖基甘油的制備：以β-半乳糖苷酶為催化劑，以半乳糖為糖基供體，甘油為糖基受體，選擇性合成半乳糖基甘油。隨后對半乳糖基甘油進行分離純化，得到的純品進行高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）、質譜（mass spectrometry，MS）、核磁共振（nuclear magnetic resonance，NMR）鑒定，確定其化學結構，以作為后期合成半乳糖基甘油酯的中間物［7］。

C12單酯的制備：以固定化脂肪酶Novozyme435為催化劑，以半乳糖基甘油為糖基供體，以月桂酸為酰基供體，合成C12單酯，通過薄層色譜法（thin-layer chromatography，TLC）、硅膠柱層析、HPLC-蒸發光散射檢測（evaporation light-scattering detection，ELSD）、MS等方法對C12單酯進行分離純化和鑒定［19］。

1.3儀器與設備

SX-700高壓蒸汽滅菌器 日本TOMY公司；HYL-A全溫搖瓶柜 太倉市強樂實驗設備廠；Orion 3 STAR pH計 美國Thermo公司；UV-2450紫外分光光度計日本島津公司；迷你渦旋混勻器 美國精騏有限公司；AY120電子精密天平 日本Shimadzu公司；SW-CJ-IBU超凈工作臺 蘇州凈化設備有限公司。

1.4方法

1.4.1菌懸液的制備

1.4.1.1細菌、酵母菌菌懸液

采用平板菌落計數法和分光光度法結合的方法，使用前將初始菌液稀釋成濃度為106～107CFU/mL的菌懸液。

1.4.1.2孢子菌懸液

用無菌生理鹽水將霉菌產生的孢子從斜面洗下，轉移至離心管中，渦旋振蕩10 min，用已滅菌的脫脂棉過濾，用血球計數板計數，使用前將初始菌液稀釋成濃度為106～107CFU/mL的菌懸液。

1.4.2抑菌活性的測定

以熒光假單胞菌、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、蠟樣芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、黃曲霉、黑曲霉和釀酒酵母為指示菌，采用打孔法測定半乳糖基甘油和C12單酯的抑菌情況。將配好的菌懸液加入融化的NA培養基（霉菌和酵母菌為PDA培養基）中混勻，使培養基中菌濃度為106～107CFU/mL，室溫冷卻凝固后得到指示菌平板。用滅菌的5 mm打孔器打孔后用牙簽將瓊脂塊挑出，向孔內加入50 μL制備好的樣品溶液，以甲醇溶液為對照，細菌37 ℃培養24 h，霉菌和酵母菌28 ℃培養48 h后觀察測量和記錄抑菌圈的直徑。每組進行3 次平行實驗，并取其平均值。

1.4.3最小抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）的測定

使用倍比稀釋法將C12單酯母液配制成質量濃度10、5、2.5、1.25、0.625、0.313、0.156、0.078、0.039 mg/mL的樣品溶液，各取100 μL加入到含有100 μL菌濃度為106CFU/mL的NA培養基中，得到的樣品質量濃度均減半。將處理后的96 孔板放在37 ℃培養箱內孵育24 h后，用酶標儀在600 nm波長處測定吸光度。以上述樣品中對應的不同劑量的甲醇溶液作為對照（排除樣品中甲醇對細菌的抑制作用）。選取抑菌活性最佳的質量濃度，觀察記錄MIC值，實驗平行3 次。

1.4.4抑菌時效的測定

以大腸桿菌和蠟樣芽孢桿菌為指示菌，采用光電比濁法測定C12單酯的抑菌時效。將處于對數生長期的種子液接種至含有1×MIC C12單酯的NA液體培養基中，37 ℃、180 r/min進行培養，以不含C12單酯的甲醇溶液為對照組，每隔2 h測定600 nm波長處的吸光度。采用下式計算t時刻的抑菌率。

式中：A0，ck、At，ck分別為對照組在0、t時刻的吸光度；A0，i、At，i分別為實驗組在0、t時刻的吸光度。

1.4.5pH值對抑菌穩定性的影響

用氫氧化鈉或鹽酸調節固體培養基的pH值，配制成pH值分別為5、6、7、8、9的營養瓊脂固體培養基，用平板菌落計數法，制成含1×MIC C12單酯的不同pH值環境的微生物培養平板，凝固后置于恒溫培養箱中培養，以相同pH值的不含C12單酯的微生物平板為對照，37 ℃恒溫培養24 h后觀察平板中菌落的生長情況并計數，分別測定抑菌率。

式中：N1為對照組的菌落數；N2為實驗組的菌落數。

1.4.6溫度對抑菌穩定性的影響

將C12單酯分裝在5 個無菌樣品瓶中，經40、60、80、100 ℃處理20 min，冷卻后待用。采用平板菌落計數法，制成含1×MIC C12單酯的微生物培養平板，以甲醇溶液做對照實驗。37 ℃恒溫培養24 h后，觀察平板中菌落的生長情況并計數，按公式（2）分別測定抑菌率。

1.4.7紫外線照射對抑菌穩定性的影響

將不同質量濃度的樣液置于40 W的紫外燈下，距離25 cm，照射5、10、15、20、25、30 min，以未經處理的相同質量濃度的C12單酯作對照，以大腸桿菌和蠟樣芽孢桿菌作指示菌，測定抑菌率，比較紫外線照射前后的抑菌活性。

1.4.8NaCl質量分數對抑菌穩定性的影響

以大腸桿菌和蠟樣芽孢桿菌為供試菌株，分別向培養基中添加0%、1%、2%、4%、8%的NaCl，配制成含不同質量分數NaCl的微生物培養平板，在每一組相同的NaCl質量分數條件下，設置空白對照組，以等體積甲醇代替C12單酯溶液作為空白對照組，37 ℃恒溫培養24 h后，觀察平板中菌落的生長情況并計數，測定抑菌率。

1.5數據統計分析

2　結果與分析

2.1 半乳糖基甘油與C12單酯的抑菌活性

國內外有很多的對酶法合成脂肪酸糖酯及其抑菌活性的報道，根據報道，糖酯對微生物具有較廣泛的抑制作用［20-23］。C12單酯對食品中幾種腐敗菌的抑制效果見表1。底物半乳糖基甘油沒有抑菌活性，C12單酯對革蘭氏陽性菌和陰性菌均具有抑菌活性，并且抑菌效果較好，而在黃曲霉、黑曲霉和釀酒酵母等真菌培養基上無明顯抑菌圈出現，表明對其抑制效果不明顯或無抑制性。這也與劉巧瑜等［14］報道的質量分數0.09%的麥芽糖月桂酸單酯和蔗糖月桂酸單酯均可有效地抑制蠟狀芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、大腸桿菌和金黃色葡萄球菌等多種細菌的生長，而麥芽糖單酯、蔗糖單酯和P1570對黑曲霉、青霉和釀酒酵母和葡萄酒酵母菌均無明顯抑制效果的實驗結果一致。

表1　C12單酯的抑菌譜Table 1 Antimicrobial spectrum of galactosyl monolaurin

2.2C12單酯的MIC

分別以熒光假單胞菌、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、蠟樣芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌為指示菌，二倍稀釋法測定C12單酯的MIC，由表2可知，C12單酯能夠有效抑制幾種供試菌的生長，且其抑菌能力隨著質量濃度的增加而增強。C12單酯對熒光假單胞菌的MIC為0.078 mg/mL，對大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、蠟樣芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌的MIC均為0.156 mg/mL。張希［6］研究發現中鏈脂肪酸糖單酯對金黃色葡萄球菌具有較強的抑菌作用，對E. coli O157:H7和白色念珠菌的抑菌活性較弱，其中甲基葡萄糖苷月桂酸單酯、蔗糖月桂酸單酯和麥芽糖月桂酸單酯對金黃色葡萄球菌的MIC

表2　C12單酯對不同細菌的最小抑菌濃度Table 2 MICs of galactosyl monolaurin against indicator bacteria

值分別為0.188、0.25、0.25 mg/mL，甲基葡萄糖月桂酸單酯對E. coli O157:H7的MIC為0.188 mg/mL。本研究結果與之不符，說明C12單酯的抑菌活性與糖基有關，糖基不同，抑菌活性也不同。李更更［24］在對不同親水基團的脂肪酸酯的抑制效果的研究中也發現麥芽糖月桂酸單酯和蔗糖月桂酸單酯對大腸桿菌、沙門氏菌、枯草芽孢桿菌、酵母菌和霉菌都有一定的抑制作用，而N-乙酰氨基葡萄糖月桂酸單酯對大腸桿菌、沙門氏菌、金黃色葡萄糖球菌和白色葡萄糖球菌有一定的抑制作用，而對酵母菌和霉菌則無抑制作用，說明不同糖基的脂肪酸酯的抑菌效果存在明顯差異。

2.3C12單酯的抑菌時效

圖1　C12單酯對大腸桿菌和蠟樣芽孢桿菌的抑菌時效Fig. 1 Antibacterial activity-time curves of galactosyl monolaurin against Escherichia coli and Bacillus cereus

采用比濁法測定C12單酯對大腸桿菌和蠟樣芽孢桿菌的抑菌活性，結果如圖1所示。隨著培養時間的延長，C12單酯對大腸桿菌的抑菌率呈現急劇下降的趨勢，72 h左右時，其對大腸桿菌幾乎沒有抑菌作用。而C12單酯對蠟樣芽孢桿菌的抑菌率在前36 h基本不變，維持在90%以上，36 h以后抑菌率急劇下降。隨著時間的延長，C12單酯對大腸桿菌和蠟樣芽孢桿菌的抑菌率呈下降的趨勢，這可能是因為大腸桿菌和蠟樣芽孢桿菌酶系降解了C12單酯，解除其對細胞的生理代謝的干擾的結果。本實驗與羅春燕［25］研究單中碳鏈脂肪酸甘油酯對大腸桿菌和蠟樣芽孢桿菌的抑制效果一致。

2.4pH值對C12單酯抑菌活性的影響

表3　pH值對C12單酯抑菌活性的影響Table 3 Effect of pH on antibacterial activity of galactosyl monolaurin

以大腸桿菌和蠟樣芽孢桿菌為供試菌，測定不同pH值條件下C12單酯的抑菌活性，評價其酸堿穩定性。由表3可知，在不同pH值條件下，C12單酯對大腸桿菌和蠟樣芽孢桿菌仍保持較強的抑菌活性。在pH 5～8的范圍內，C12單酯對大腸桿菌和蠟樣芽孢桿菌的抑菌活性無顯著變化；在pH 9時，C12單酯對兩種菌的抑菌活性顯著下降，但其抑菌率仍在93%以上，說明C12單酯具有良好的酸堿穩定性。本實驗與劉燕［26］和趙存洋［27］的研究結果一致。

劉燕［26］對單中碳鏈脂肪酸甘油酯抑菌活性的研究發現其對細菌、霉菌和酵母菌的MIC沒有變化，表明在中性至微堿的環境下，單中碳鏈脂肪酸甘油酯的抑菌性能不受pH值的影響。趙存洋［27］的研究表明pH值從3升高到9，單月桂酸甘油酯對大腸桿菌、枯草芽孢桿菌等6 種食品腐敗菌的MIC均未發生變化，表明單月桂酸甘油酯在酸性至堿性環境中具有良好的抑菌活性。

2.5溫度對C12單酯抑菌活性的影響

表4　溫度對C12單酯抑菌活性的影響Table 4 Effect of temperature on antibacterial activity of galactosyl monolaurinaurin

以大腸桿菌和蠟樣芽孢桿菌為供試菌，測定不同溫度條件下C12單酯的抑菌活性，評價其熱穩定性。由表4可知，溫度對C12單酯的抑菌活性有較大影響。當溫度低于60 ℃時，隨著溫度的升高，C12單酯對蠟樣芽孢桿菌的抑菌活性的變化不大；當溫度高于60 ℃時，其對蠟樣芽孢桿菌的抑菌活性隨溫度的升高而顯著下降。當溫度低于40 ℃時，隨著溫度的升高，C12單酯對大腸桿菌的抑菌活性無顯著變化；當溫度高于40 ℃時，其對大腸桿菌的抑菌活性隨溫度的升高而顯著下降。然而C12單酯經100 ℃處理20 min后，其對兩種供試菌的抑菌率仍在85%以上，說明C12單酯具有較好的熱穩定性。

2.6紫外線照射時間對C12單酯抑菌活性的影響以大腸桿菌和蠟樣芽孢桿菌為供試菌，測定紫外線照射不同時間后C12單酯的抑菌活性，由表5可知，經紫外線照射不同時間后，C12單酯對兩種供試菌的抑菌活性基本保持不變，即紫外線照射對C12單酯的抑菌活性無顯著影響，由此可見半乳糖基甘油月桂酸單對紫外光具有極高的穩定性。

表5　紫外線照射時間對C12單酯抑菌活性的影響Table 5 Effect of UV irradiation on antibacterial activity of galactosyl monolaurinaurin

2.7NaCl質量分數對C12單酯抑菌活性的影響

表6　NaCl質量分數對C12單酯抑菌活性的影響Table 6 Effect of NaCl concentration on antibacterial activity of galactosyl monolaurin

以大腸桿菌和蠟樣芽孢桿菌為供試菌，測定不同NaCl質量分數下C12單酯的抑菌活性。由表6可知，NaCl質量分數對C12單酯的抑菌活性有較大影響。NaCl質量分數在1%～8%范圍內，隨著鹽離子強度的增加，C12單酯對兩種供試菌的抑菌活性呈現出顯著下降的趨勢。一般情況下認為抑菌物質與細菌相互作用的過程中，抑菌物質通過靜電引力的方式吸附到細胞膜上后與之結合，實驗中鹽離子濃度的增加可能影響到C12單酯與細菌細胞膜的結合，從而影響了C12單酯抑菌活性的發揮［28］。

3　結 論

C12單酯對大腸桿菌、熒光假單胞菌、枯草芽孢桿菌、蠟樣芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌均具有較好的抑菌活性，而對黃曲霉、黑曲霉和釀酒酵母等真菌的抑制效果不明顯或無抑制性。對C12單酯的抑菌穩定性研究結果顯示：C12單酯對pH值、溫度和紫外線照射有較強的穩定性，但對NaCl不穩定。這可能是因為C12單酯是一種非離子表面活性劑，生物表面活性劑的主要特性就是耐酸、熱及離子強度、低毒性和生物可降解性等［29-30］。已有研究表明甘油單脂肪酸酯類對細菌、酵母菌和霉菌的生長都有較好的抑制作用，且其抑菌活性不受環境pH值的影響，被美國食品藥品監督管理局批準為一般公認安全類食品添加劑［31］，這都說明C12單酯有成為一種高效、安全、適用性廣的新型甘油糖酯類食品防腐保鮮劑的潛力。關于糖酯抑菌機理的研究，目前國內外的相關報道較少［32］。一般認為防腐劑是通過影響細胞亞結構的正常生理功能來實現其抑菌作用的［27］。C12單酯是一種非離子型表面活性劑，具有疏水特性，可能會以細胞膜為作用靶點，破壞細胞膜結構的完整性，從而改變細胞膜的通透性，抑制細菌的生長。后續將繼續研究C12單酯對大腸桿菌和蠟樣芽孢桿菌的抑菌機理，為C12單酯的進一步應用提供理論依據。

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Antimicrobial Properties and Stability of Galactosyl Monolaurin

DIAO Mingming， QI Danping， ZHANG Chong， BIE Xiaomei， L? Fengxia， LU Zhaoxin， ZHAO Haizhen*
（College of Food Science and Technology， Nanjing Agricultural University， Nanjing 210095， China）

Antimicrobial properties and stability of galactosyl monolaurin were investigated in this study. The minimum inhibitory concentration （MIC） of galactosyl monolaurin against five bacteria and three fungi from foods were determined by doubling dilution method. Escherichia coli and Bacillus cereus were used as indicator bacteria to investigate the effects of temperature， pH， UV irradiation and salt concentration on the stability of galactosyl monolaurin. Results showed that galactosyl monolaurin could inhibit five tested bacteria and had little or no effect on the growth of three tested fungi. The MIC of galactosyl monolaurin against Pseudomouas fluorescens was 0.078 mg/mL， and the same MIC value of 0.156 mg/mL was observed against Escherichia coli， Bacillus subtilis， Bacillus cereus and Staphylococcus aureus. In the pH range of 5 to 8， the antibacterial activity of galactosyl monolaurin was stable. Temperature and UV irradiation showed little effect on the antimicrobial activity of galactosyl monolaurin. With increasing NaCl concentration， this antimicrobial activity decreased significantly.

galactosyl monolaurin； antimicrobial activity； stability

10.7506/spkx1002-6630-201615001

TS202.3

A

1002-6630（2016）15-0001-06

10.7506/spkx1002-6630-201615001. http://www.spkx.net.cn

2015-11-11

國家自然科學基金青年科學基金項目（31301558）；中央高校基本科研業務費專項資金項目（KJQN201427）

刁明明（1991—），女，碩士研究生，研究方向為食品生物技術。E-mail：2013108058@njau.edu.cn

趙海珍（1975—），女，副教授，博士，研究方向為食品生物技術。E-mail：zhaohz@njau.edu.cn

引文格式：