胰蛋白酶制備鷹嘴豆抗氧化肽的條件優(yōu)化

施文衛(wèi)，王 偉，胡 冰，周 莉，曾曉雄，孫 怡，*

（1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，江蘇 南京 210095；2.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與藥學(xué)學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830052）

胰蛋白酶制備鷹嘴豆抗氧化肽的條件優(yōu)化

施文衛(wèi)1，王 偉2，胡 冰1，周 莉1，曾曉雄1，孫 怡1，*

（1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，江蘇 南京 210095；2.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與藥學(xué)學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830052）

以堿溶酸沉法制備的鷹嘴豆分離蛋白為酶解底物，以超氧陰離子自由基清除率為響應(yīng)值，采用響應(yīng)面法優(yōu)化胰蛋白酶制備鷹嘴豆抗氧化活性肽的條件。結(jié)果表明：在整個(gè)酶解過程中，所制備的鷹嘴豆抗氧化肽具有顯著的抗氧化活性，胰蛋白酶制備鷹嘴豆抗氧化肽的最佳酶解條件為：底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%、加酶量（［E］/［S］）1 800 U/g、溫度32 ℃、pH 7.0、時(shí)間35 min。此條件下所制備的鷹嘴豆抗氧化肽的超氧陰離子自由基清除率為67.59%。鷹嘴豆分離蛋白水解液經(jīng)超濾膜系統(tǒng)純化獲得了截留相對(duì)分子質(zhì)量1 kD以下的水解液，并通過液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析，發(fā)現(xiàn)了一種相對(duì)分子質(zhì)量為668.40、序列為RQLPR的親水性五肽。

鷹嘴豆分離蛋白；胰蛋白酶；抗氧化；響應(yīng)面法

施文衛(wèi)， 王偉， 胡冰， 等. 胰蛋白酶制備鷹嘴豆抗氧化肽的條件優(yōu)化［J］. 食品科學(xué)， 2016， 37（15）: 185-191. DOI:10.7506/ spkx1002-6630-201615031. http://www.spkx.net.cn

SHI Wenwei， WANG Wei， HU Bing， et al. Optimal preparation of antioxidant peptides by enzymatic hysrolysis of chickpea protein isolate with trypsin［J］. Food Science， 2016， 37（15）: 185-191. （in Chinese with English abstract） DOI:10.7506/ spkx1002-6630-201615031. http://www.spkx.net.cn

鷹嘴豆（chickpea），豆科鷹嘴豆屬（Cicer arietinum L.），一年生或多年生草本植物，耐干旱、貧瘠［1］，在我國(guó)主要種植于新疆、甘肅、青海等雨水量較少的地區(qū)［2］。鷹嘴豆外型獨(dú)特，形如鷹頭，在種臍附近有喙?fàn)钔黄鸲妹S吾爾族人稱其為奴乎特、諾胡提，別名雞豆、雞豌豆、腦豆子和桃豆等［3-4］。鷹嘴豆的消費(fèi)量居世界豆類第二，僅次于大豆，產(chǎn)量居世界豆類第三，僅次于大豆和豌豆［5］。

鷹嘴豆因其獨(dú)特的生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)和高營(yíng)養(yǎng)價(jià)值備受人們喜愛，國(guó)外研究較早。我國(guó)對(duì)于鷹嘴豆的科學(xué)研究大約始于20世紀(jì)80、90年代，且主要集中于栽培種植方面［6-7］。2005年以后，學(xué)者們逐漸把目光轉(zhuǎn)移到鷹嘴豆的營(yíng)養(yǎng)成分、功能性質(zhì)和開發(fā)利用等方面［8-11］，有關(guān)鷹嘴豆蛋白的報(bào)道也逐漸增多。鷹嘴豆種子中蛋白質(zhì)含量約為20%～25%，氨基酸組成均衡［12］，且蛋白功效比和凈蛋白利用率都高于大豆［13-14］。學(xué)者們通過酶解鷹嘴豆蛋白制備了多種生物活性肽［15-16］，其中以具有抗氧化活性的肽的研究報(bào)道較多。鷹嘴豆蛋白本身就具有一定的抗氧化活性，是抗氧化肽的潛在來源［17］。與鷹嘴豆蛋白相比，鷹嘴豆抗氧化肽不但具有更佳的清除自由基［18］、金屬螯合［19］、預(yù)防細(xì)胞氧化損傷［20］等功效，而且更易被人體吸收。可能由于考慮到蛋白的溶解性以及酶的高效水解性等問題，鷹嘴豆蛋白的水解多用堿性蛋白酶，而以促進(jìn)人體腸道消化和吸收的消化酶水解鷹嘴豆蛋白卻少有報(bào)道。因此，本研究擬以超氧陰離子自由基清除率為響應(yīng)值，采用響應(yīng)面分析法（response surface methodology，RSM）探尋以胰蛋白酶制備鷹嘴豆抗氧化肽的最佳條件，并對(duì)鷹嘴豆抗氧化肽的組成進(jìn)行分析和探討，為鷹嘴豆蛋白類功能產(chǎn)品的開發(fā)與鷹嘴豆精深加工提供一定的參考。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

鷹嘴豆（卡布里型） 新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)。

胰蛋白酶 索萊寶生物科技有限公司。其他試劑均為分析純。

1.2儀器與設(shè)備

AY-120電子精密天平 日本Shimadzu公司；HH-6型數(shù)顯恒溫水浴鍋 上海國(guó)華電器有限公司；Avanti J-30I高效離心機(jī) 貝克曼庫爾特商貿(mào)有限公司；KJELTEC 2300型Foss全自動(dòng)凱氏定氮儀 丹麥Foss公司；DELTA 320 pH計(jì) 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；Telstar LYOBETA 3PS中試凍干機(jī) 泰事達(dá)科技公司；Synergy-2型酶標(biāo)儀 美國(guó)Biotek公司；Mini Pellicon膜過濾系統(tǒng) 密理博（中國(guó)）有限公司；LTQ Orbitrap XLTM液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（liquid chromatographymass spectrometry，LC-MS）儀 美國(guó)賽默飛世爾科技公司。

1.3方法

1.3.1常規(guī)指標(biāo)的測(cè)定

蛋白質(zhì)含量的測(cè)定方法按照GB 5009.5—2010《食品中蛋白質(zhì)的測(cè)定》；水分的測(cè)定方法按照GB 5009.3—2010《食品中水分的測(cè)定》；灰分的測(cè)定方法按照GB 5009.4—2010《食品中灰分的測(cè)定》；脂肪的測(cè)定方法按照GB/T 5009.6—2003《食品中脂肪的測(cè)定》；多糖含量的測(cè)定參照苯酚-硫酸法［21］。

1.3.2鷹嘴豆分離蛋白（chickpea protein isolates，CPI）的制備

根據(jù)Zhang Tao等［10］的方法略作改動(dòng)：選取籽粒飽滿、無蟲害、無缺失的鷹嘴豆種子，去皮，粉碎機(jī)粉碎，100 目尼龍網(wǎng)過篩，石油醚脫脂，得到鷹嘴豆粉。將豆粉與水按照1∶10（m/V）的料液比混合，0.5 mol/L NaOH調(diào)pH值至8.5，室溫?cái)嚢?～2 h，離心（3 000×g，20 min），殘?jiān)蒙鲜龇椒ㄔ偬嵋淮危喜⑸锨逡骸?.5 mol/L的HCl調(diào)pH值至鷹嘴豆分離蛋白等電點(diǎn)4.6，靜置30 min，離心（800×g，20 min），用pH 4.6的去離子水洗滌沉淀3 次。調(diào)沉淀的pH值至7.0，冷凍干燥，4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3CPI的酶解

根據(jù)Aarsen［22］的方法，略做改動(dòng)：稱取適量CPI溶于30 mL去離子水中，混勻。將溶液放置入酶解反應(yīng)器中，80 ℃預(yù)熱20 min，然后將混合液迅速調(diào)節(jié)到蛋白酶的最適溫度和最適pH值范圍內(nèi)，緩慢攪拌的同時(shí)加入適量胰蛋白酶，通過滴加0.5 mol/L的NaOH溶液來維持反應(yīng)液pH值不變。將制得酶解液放置于沸水中滅酶10 min，再放入冰浴中立即冷卻，離心（10 000×g，10 min），上清液凍干。

1.3.4水解度（degree of hydrolysis，DH）的測(cè)定

根據(jù)寧正祥［23］的方法測(cè)定胰蛋白酶降解鷹嘴豆分離蛋白的DH。

式中：ρi為甲醛滴定法測(cè)定的酶解產(chǎn)物中氨基氮含量/（mg/mL）；ρ1為甲醛滴定法測(cè)定的酶解前的溶液氨基氮含量/（mg/mL）；ρ0為凱氏定氮法測(cè)定的酶解液中蛋白質(zhì)的總氮含量/（mg/mL）。

1.3.5氨基氮含量的測(cè)定

采用甲醛滴定法［23］測(cè)定氨基氮含量：取5 mL蒸餾水加入2 mL樣品或蒸餾水（空白），添加中性甲醛溶液5 mL，滴入0.5%酚酞指示劑3～5 滴，用0.1 mol/L的NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定至微紅，記錄每次消耗的標(biāo)準(zhǔn)NaOH溶液的量。平均測(cè)定3 次，取平均值。

式中：V樣品為樣品所消耗NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積/mL；V空白為空白實(shí)驗(yàn)中所消耗NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積/mL。

1.3.6超氧陰離子自由基清除能力的測(cè)定

根據(jù)Wang Zhaojing等［24］的方法略做改動(dòng)：取2 mg/mL樣品溶液50 ?L，分別加入50 ?L氯化硝基四氮唑藍(lán)（nitrotetrazolium blue tetrazolium，NBT）溶液（156 ?mol/L）、50 ?L還原型輔酶Ⅰ（dihydronicotinamide adenine dinucleotide，NADH）溶液（468 ?mol/L）和50 ?L吩嗪硫酸甲酯（phenazine methosulfate，PMS）溶液（60 ?mol/L）。混勻反應(yīng)體系，25 ℃水浴5 min，用分光光度計(jì)于560 nm波長(zhǎng)處測(cè)吸光度。NBT溶液、NADH溶液和PMS溶液都是用0.1 mol/L pH 7.4的磷酸鹽緩沖液配制。以水代替樣品溶液、0.1 mol/L pH 7.4磷酸鹽緩沖液代替NBT溶液，作空白實(shí)驗(yàn)調(diào)零。按照下式計(jì)算超氧陰離子自由基（O2-·）清除率。

式中：A0為對(duì)照實(shí)驗(yàn)體系（水代替樣品溶液）的吸光度；A1為樣品實(shí)驗(yàn)體系的吸光度；A2為樣品干擾實(shí)驗(yàn)體系（0.1 mol/L pH 7.4 磷酸鹽緩沖液代替NBT溶液）的吸光度。

1.3.7酶解單因素對(duì)鷹嘴豆分離蛋白DH的影響

在酶促反應(yīng)過程中，諸多因素影響著反應(yīng)的進(jìn)程，其中以底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)、pH值、溫度、酶解時(shí)間和加酶量對(duì)反應(yīng)速率影響較大，因此首先采用單因素試驗(yàn)確定適當(dāng)?shù)膯我蛩孛附鈼l件。

1.3.8響應(yīng)面法優(yōu)化鷹嘴豆蛋白酶解條件

以X1加酶量（［E］/［S］）、X2酶解溫度和X3酶解時(shí)間為自變量，O2-·清除率為響應(yīng)值，采用Box-Behnken中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，設(shè)計(jì)了三因素三水平的RSM試驗(yàn)。試驗(yàn)以隨機(jī)次序進(jìn)行，重復(fù)2 次，獲得O2-·清除率的平均值，采用Design-Expert V8.0.6軟件中的RS（response surface）程序進(jìn)行分析，應(yīng)用Model Graph程序作響應(yīng)曲面圖和等高線圖。RSM試驗(yàn)因素及水平表見表1。

表1　RSM試驗(yàn)因素水平Table 1 Independent variables and levels used for RSM

1.3.9鷹嘴豆抗氧化肽的LC-MS分析

大量研究表明［16，25-26］，抗氧化肽的分子質(zhì)量一般在1 kD以下，因此將CPI的水解液過1 kD的聚砜超濾膜，截留1 kD以下的鷹嘴豆小肽，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，上Waters Sep-Pak?Vac 6cc C18固相萃取小柱，用2～3 倍柱體積的超純水洗去鹽分，60%乙腈洗下鷹嘴豆小肽，旋蒸濃縮，凍干，純化后的樣品進(jìn)行LC-MS分析。檢測(cè)波長(zhǎng)為280 nm，柱溫為30 ℃，流速為0.2 mL/mi n，進(jìn)樣量20 ?L。色譜柱：ACQUITYUPLC TM BEH C18色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）；流動(dòng)相A：H2O（含0.1%甲酸），流動(dòng)相B：100%乙腈（含0.1%甲酸）；梯度洗脫程序：0～2 min 5% B，2～18 min 5%～95% B，18～22 min 95% B；陽離子檢測(cè)模式電噴霧質(zhì)譜，噴霧電壓為 4.5 kV，霧化氣為N2，掃描范圍為m/z 300～1 000，通過在線二級(jí)串聯(lián)質(zhì)譜鑒定分子序列。

1.4數(shù)據(jù)處理

響應(yīng)面試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Design-Expert V8.0.6軟件中的RS程序進(jìn)行分析，應(yīng)用Model Graph程序作響應(yīng)曲面圖和等高線圖，對(duì)LC-MS分析圖譜采用Peaks Studio 7.5軟件分析鷹嘴豆抗氧化肽的組成及氨基酸序列。

2　結(jié)果與分析

2.1鷹嘴豆分離蛋白的化學(xué)成分

鷹嘴豆種子中脂肪含量約為4%～6%［13］，一定量的鷹嘴豆經(jīng)篩選、去皮和磨粉后，需經(jīng)石油醚反復(fù)浸泡脫脂。脫脂豆粉經(jīng)堿液溶解并離心，去除淀粉等不溶性雜質(zhì)，再經(jīng)酸調(diào)節(jié)pH值至鷹嘴豆蛋白的等電點(diǎn)使蛋白析出，離心棄上清，除去糖類和酚類物質(zhì)。而此時(shí)蛋白沉淀中仍殘留一定的糖類和酚類，需要用pH 4.6的去離子水反復(fù)洗滌，同時(shí)保持鷹嘴豆蛋白的含量不受影響，最終制備的CPI純度較高，經(jīng)凱氏定氮法檢測(cè)所制備的CPI中蛋白含量為93.29%（表2）。

表2　鷹嘴豆分離蛋白的化學(xué)成分組成Table 2 Chemical components of chickpea protein isolate

2.2單因素對(duì)胰蛋白酶水解CPI的影響

2.2.1底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)胰蛋白酶水解CPI的影響

在溫度37 ℃、pH 7.0、加酶量2 000 U/g的條件下，測(cè)定不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)底物對(duì)CPI水解液DH的影響，由圖1可知，隨著酶解的進(jìn)行，DH的總趨勢(shì)為逐漸增加，但同一酶解時(shí)間時(shí)，底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%和2%的體系的DH相對(duì)高于對(duì)其他兩體系。這可能是由于酶被底物飽和后，隨著底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加，水解速率基本保持穩(wěn)定。當(dāng)?shù)孜镔|(zhì)量分?jǐn)?shù)過高時(shí)，體系流動(dòng)性差，不利于酶與底物的接觸，因此其水解速率反而下降［27］。綜合考慮底物利用率和產(chǎn)物得率，選擇底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%。

圖1　底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)胰蛋白酶水解鷹嘴豆分離蛋白的影響Fig. 1 Effect of substrate concentration on the hydrolysis degree of chickpea protein isolate by trypsin

2.2.2pH值對(duì)胰蛋白酶水解CPI的影響

胰蛋白酶的最適pH值范圍為7.0～8.0，選擇pH 6.0～9.0的條件進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果如圖2所示。胰蛋白酶在不同pH值條件下水解CPI，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，DH總趨勢(shì)為逐漸增加。CPI酶解液的DH在不同pH值條件下差異較大，其中pH 7.0時(shí)效果最佳。pH值低于7時(shí)，推測(cè)由于pH值向鷹嘴豆蛋白等電點(diǎn)偏移，蛋白溶解度降低，降低了底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)；pH值高于7時(shí)，同一水解時(shí)間，pH值高的體系DH反而低。因此，選擇pH值為7.0。

圖2　pH值對(duì)胰蛋白酶水解鷹嘴豆分離蛋白的影響Fig. 2 Effect of pH on the hydrolysis degree of chickpea protein isolate by trypsin

2.2.3［E］/［S］對(duì)胰蛋白酶水解CPI的影響

當(dāng)［E］＜＜［S］時(shí)，可以認(rèn)為酶反應(yīng)速率與［E］成正比。因此固定底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.0%，考察不同［E］/［S］對(duì)DH的影響。由圖3可知，［E］/［S］越高，酶解越徹底，然而根據(jù)前期蛋白酶的篩選結(jié)果以及文獻(xiàn)［18］報(bào)道，其O2-·清除活性的峰值在1 h以內(nèi)，而在1 h以內(nèi)，［E］/［S］為3 000 U/g較2 000 U/g時(shí)對(duì)DH的提高并不明顯，從節(jié)約成本的角度考慮，選擇［E］/［S］為2 000 U/g比較適宜。

圖3　［ 3 E］/［/S］對(duì)胰蛋白酶酶解鷹嘴豆分離蛋白的影響Fig. 3 Effect of ［E］/［S］ ratio on the hydrolysis degree of chickpea protein isolate by trypsin

2.2.4酶解溫度對(duì)胰蛋白酶酶解CPI的影響

胰蛋白酶對(duì)底物的最適作用溫度一般為37 ℃，試驗(yàn)中選擇30、37、50 ℃ 3 個(gè)條件，CPI的酶解曲線見圖4。30 ℃時(shí)，胰蛋白酶對(duì)CPI的酶解效果最差，可能是由于在低溫條件下胰蛋白酶的活性受到抑制；37 ℃與50 ℃條件下的水解曲線較接近，考慮到長(zhǎng)期高溫會(huì)影響酶的活性，最終選擇37 ℃為宜。

圖4　酶解溫度對(duì)胰蛋白酶酶解鷹嘴豆分離蛋白的影響Fig. 4 Effect of temperature on the hydrolysis degree of chickpea protein isolate by trypsin

綜合以上單因素試驗(yàn)結(jié)果，初步確定胰蛋白酶水解CPI的參數(shù)為：底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%、pH 7.0、［E］/［S］ 2 000 U/g、酶解溫度37 ℃，并以此設(shè)計(jì)響應(yīng)面進(jìn)行最適水解條件的優(yōu)化。

2.3響應(yīng)面法優(yōu)化CPI酶解條件

2.3.1響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

為了獲得具有較強(qiáng)抗氧化能力的CPI酶解物，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以O(shè)2-·清除率為響應(yīng)值，采用Box-Behnken設(shè)計(jì)方法進(jìn)行最適酶解條件的優(yōu)化，試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見表3。［E］/［S］、酶解溫度和酶解時(shí)間3 個(gè)因素分別以X1、X2、X3表示，并以+1、0、-1 分別代表自變量的高、中、低水平，按方程xi=（Xi-X0）/X對(duì)自變量進(jìn)行編碼，其中xi為自變量的編碼值，Xi為自變量的真實(shí)值，X0為試驗(yàn)中心點(diǎn)處自變量的真實(shí)值，X為自變量的變化步長(zhǎng)。

表3　響應(yīng)面設(shè)計(jì)方案與結(jié)果Tabl e 3 Experimental design and results of RSM

2.3.2響應(yīng)面及等高線分析

三維響應(yīng)面圖可以顯示響應(yīng)面的變化趨勢(shì)和最大值點(diǎn)。在等高線圖中，可以預(yù)測(cè)到最大值點(diǎn)，它位于最小曲線中。圖5為［E］/［S］和酶解溫度的交互作用對(duì)O2-·清除活性的影響，在試驗(yàn)范圍內(nèi)，隨著［E］/［S］的增大和酶解溫度的升高，酶解液的清除活性先增加后急劇下降。圖6為酶解時(shí)間和［E］/［S］的交互作用對(duì)清除活性的影響，在試驗(yàn)范圍內(nèi)，隨著［E］/［S］的增大，酶解液的清除活性先增加后降低，趨勢(shì)明顯，而隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng)，清除活性亦先升高后降低，但幅度較小。圖7為酶解時(shí)間和溫度的交互作用對(duì)清除活性的影響，隨著時(shí)間和溫度的上升，酶解液活性先增加后降低，40 ℃以后，溫度越高活性明顯降低。對(duì)比圖5～7結(jié)果，［E］/［S］和酶解溫度的交互作用對(duì)清除活性的影響最顯著。

圖5　［ 5 E］/［/S］和酶解溫度的交互作用對(duì)OO2-·清除活性的響應(yīng)面及等高線Fig. 5 Response surface and contour plots for the effect of ［E］/［S］ ratio and temperature on superoxide radical scavenging activity

圖6　酶解時(shí)間和［E］//［S］的交互作用對(duì)清除活性的響應(yīng)面及等高線Fig. 6 Response surface and contour plots for the effect of ［E］//［S］ ratio and hydrolysis time on superoxide radical scavenging activity

圖7　酶解時(shí)間和溫度的交互作用對(duì)清除活性的響應(yīng)面及等高線Fig. 7 Response surface and contour plots for the effect of hydrolysis time and temperature on superoxide radical scavenging activity

2.3.3回歸方程的建立與分析

試驗(yàn)結(jié)果釆用Design-Expert V8.0.6軟件中的RS程序進(jìn)行二次回歸分析，計(jì)算回歸方程中各系數(shù)，各因素回歸擬合后，選擇對(duì)響應(yīng)值顯著的各項(xiàng)，剔除不顯著因子，得到鷹嘴豆抗氧化肽的清除率Y對(duì)自變量（X1、X2、X3）的二次多項(xiàng)回歸方程為Y=65.40-1.82X1-3.15X2-1.13X3-1.39X1X2-0.77X1X3-0.92X2X3--1.37X22。

表4　響應(yīng)面二次模型方差分析Table 4 Analysis of variance for response surface quadratic model

由表4可知，對(duì)回歸方程進(jìn)行方差分析，發(fā)現(xiàn)回歸方程極顯著，失擬檢驗(yàn)為0.255 2（不顯著），這說明此回歸模型很理想，用方程擬合3 個(gè)因素與酶解產(chǎn)物的清除率之間的關(guān)系是可行的。試驗(yàn)誤差小，故可用該回歸模型代替試驗(yàn)真實(shí)點(diǎn)對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行預(yù)測(cè)。一次項(xiàng)X1、X2、X3均對(duì)CPI酶解物的清除率有極顯著影響，影響順序?yàn)閄1＞X2＞X3；二次項(xiàng)、以及交互項(xiàng)中的X1X2項(xiàng)也對(duì)清除率有極顯著影響，交互項(xiàng)X1X3和X2X3影響顯著，表明各因素對(duì)清除率的影響成二次關(guān)系，各因素間交互影響。李瑩等［28］在優(yōu)化泥鰍蛋白酶法制備血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制肽的工藝時(shí)，發(fā)現(xiàn)pH值、溫度、底物濃度以及酶的添加量等因素與血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制率之間不存在線性關(guān)系，只有在特定的DH時(shí)，其活性最佳，與本試驗(yàn)結(jié)果一致。

2.4最佳酶解條件的驗(yàn)證

對(duì)回歸模型進(jìn)行優(yōu)化后，得到最大響應(yīng)值對(duì)應(yīng)的最佳酶解條件為：底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%、［E］/［S］ 1 800 U/g、酶解溫度32 ℃、pH 7.0、酶解時(shí)間35 min，代入方程得清除率為67.02%。在該條件下重復(fù)3 次實(shí)驗(yàn)，測(cè)得清除率為67.59%，與理論預(yù)測(cè)值的相對(duì)誤差在±1%以內(nèi)，說明建立的模型預(yù)測(cè)性能好，具有實(shí)際指導(dǎo)意義。此條件下所得CPI水解液的DH為4.23%。

2.5鷹嘴豆抗氧化肽的組成及序列

對(duì)CPI酶解液進(jìn)行超濾處理，截留1 kD以下的酶解液，經(jīng)LC-MS分析，發(fā)現(xiàn)其成分較為復(fù)雜（圖8），美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心（National Center of Biotechnology Information，NCBI）數(shù)據(jù)庫中共匹配出175 種肽段，主要來自于鷹嘴豆谷蛋白和球蛋白，而絕大部分親水性短肽在前5 min已出峰。其中，在保留時(shí)間為3.77 min處的峰較為純凈，且含量相對(duì)較高，是一種親水性五肽。由圖8B、C可知，該肽的氨基酸序列為RQLPR，相對(duì)分子質(zhì)量為668.40，與理論計(jì)算結(jié)果一致。

堿性氨基酸能夠通過側(cè)鏈的氨基螯合金屬離子從而起到抗氧化作用，而本研究所得到的五肽具有兩個(gè)堿性氨基酸（精氨酸）。此外，肽鏈中的亮氨酸和脯氨酸都是疏水性氨基酸，為其與疏水性自由基的結(jié)合提供了有利條件［29］。由于谷氨酰胺含有兩個(gè)氨基，與其形成的酰胺鍵的類型未知，得到的五肽的空間結(jié)構(gòu)還有待進(jìn)一步確認(rèn)。

圖8　鷹嘴豆抗氧化肽的LC圖（A）、3.77 min處峰的MS圖（B）和氨基酸序列圖譜（C）CFig. 8 LC spectra of chickpea antioxidant peptides （A）， and mass spectrum of the peak at 3.77 min （B） and amino acid sequence （C）

3　結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)以堿溶酸沉法制備了CPI，其蛋白質(zhì)含量為93.29%；采用響應(yīng)面法優(yōu)化了得到了胰蛋白酶解制備鷹嘴豆抗氧化活性的最優(yōu)酶解條件為：底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%、［E］/［S］ 1 800 U/g、酶解溫度32 ℃、pH 7.0、酶解時(shí)間35 min。此條件下所制備的CPI水解液的清除率為67.59%，與理論預(yù)測(cè)值的相對(duì)誤 差在±1%以內(nèi)，說明建立的模型預(yù)測(cè)性能好，具有實(shí)際指導(dǎo)意義。1 kD以下的CPI水解液經(jīng)LC-MS分析共檢測(cè)出175 種肽，主要來自于鷹嘴豆谷蛋白和球蛋白，其中發(fā)現(xiàn)一種相對(duì)分子質(zhì)量為668.40、序列為RQLPR的親水性五肽。

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Optimal Preparation of Antioxidant Peptides by Enzymatic Hysrolysis of Chickpea Protein Isolate with Trypsin

SHI Wenwei1， WANG Wei2， HU Bing1， ZHOU Li1， ZENG Xiaoxiong1， SUN Yi1，*
（1. College of Food Science and Technology， Nanjing Agricultural University， Nanjing 210095， China；2. College of Food Science and Pharmacy， Xinjiang Agricultural University， ?rümqi 830052， China）

Response surface methodology was employed to optimize the preparation conditions of antioxidant peptides by enzymatic hydrolysis of chickpea protein isolate （CPI）， prepared by alkaline extraction and acid precipitation from chickpea seeds， with trypsin. The response variable was the percentage scavenging of superoxide anion radical. The results showed that all samples collected throughout the hydrolysis process had significant antioxidant activity and the optimal conditions were determined as substrate concentration 2%， enzyme/substrate （［E］/［S］） ratio 1 800 U/g， reaction time 35 min， temperature 32 ℃ and pH 7.0. Under these conditions， the percentage scavenging of superoxide anion radical by chickpea antioxidant peptides was 67.59%. Chickpea peptide fractions with molecular weight cut-off of 1 kD from chickpea protein hydrolysates by ultrafiltration were analyzed by liquid chromatography-mass spectroscopy （LC-MS）. A pentapeptide with molecular weight of 668.40 in chickpea peptide fractions was achieved， whose amino acid sequence was determined to be RQLPR.

chickpea protein isolate； trypsin； antioxidant activity； response surface methodology

10.7506/spkx1002-6630-201615031

TS201.2

A

1002-6630（2016）15-0185-07

2015-10-01

江蘇高校優(yōu)勢(shì)學(xué)科建設(shè)工程資助項(xiàng)目

施文衛(wèi)（1990—），男，碩士研究生，研究方向?yàn)槭称飞锛夹g(shù)。E-mail：2013108029@njau.edu.cn

孫怡（1966—），女，高級(jí)實(shí)驗(yàn)師，博士，研究方向?yàn)槭称窢I(yíng)養(yǎng)與化學(xué)。E-mail：sunyi01@njau.edu.cn

引文格式：