降膽固醇乳酸桿菌的篩選及對小鼠血清膽固醇的影響

丁盼盼，丁 軻，，*，余祖華，李 旺，李元曉，劉一塵，何萬領，趙戰(zhàn)勤，王玉琴，3，程相朝，張春杰

（1.河南科技大學宏翔發(fā)酵飼料實驗室，河南 洛陽 471003；2.河南省動物疫病與公共衛(wèi)生重點實驗室，

河南 洛陽 471003；3.河南省肉羊繁育工程技術研究中心，河南 洛陽 471003）

降膽固醇乳酸桿菌的篩選及對小鼠血清膽固醇的影響

丁盼盼1，丁 軻1，2，*，余祖華2，李 旺1，李元曉1，劉一塵1，何萬領1，趙戰(zhàn)勤2，王玉琴1，3，程相朝2，張春杰2

（1.河南科技大學宏翔發(fā)酵飼料實驗室，河南 洛陽 471003；2.河南省動物疫病與公共衛(wèi)生重點實驗室，

河南 洛陽 471003；3.河南省肉羊繁育工程技術研究中心，河南 洛陽 471003）

目的：從羊新鮮糞便中分離篩選具有降膽固醇能力的乳酸桿菌，探討其對小鼠血清 膽固醇含量的影響。方法：以碳酸鈣-MRS培養(yǎng)基和膽固 醇-MRS培養(yǎng)基篩選具有高效降膽固醇能力的乳酸桿菌；利用形態(tài)特征、生理生化特性和16S rDNA序列分析鑒定分離菌株L-3。為了驗證其效果，將40 只8 周齡雄性BALB/c小鼠隨機分為基礎飼料組（A）、高脂模型組（B）、高脂模型+生理鹽水組（C）、高脂模型+菌株L-3組（D）。分別飼喂第15、30天，采血，測定總膽固醇（total cholesterol，TC）、總甘油三酯（triglyceride，TG）和高密度脂蛋白膽 固醇（high density lipoprotein-cholesterol，HDL-C）的含量。結果：篩選得到一株能夠高效降解膽固醇的菌株L-3，膽固醇降解率達到（35.93±0.43）%，經鑒定為植物乳桿菌。飼喂第15天，成功構建出高脂血癥小鼠模型。灌胃第 30天，與B組相比，D組TC、TG、動脈硬化指數(shù)水平均極顯著降低（P＜0.01），HDL-C水平顯著升高（P＜0.05），HDL-C/TC水平極顯著升高（P＜0.01），而對照組幾乎無降膽固醇效果（P＞0.05）。結論：實驗獲得了1株在體內外均具有高效降膽固醇能力的植物乳桿菌Lactobacillus plantarum L-3，為進一步開發(fā)其為功能性微生態(tài)制劑提供了可能。

乳酸桿菌；降膽固醇；小鼠；篩選

丁盼盼， 丁軻， 余祖華， 等. 降膽固醇乳酸桿菌的篩選及對小鼠血清膽固醇的影響［J］. 食品科學， 2016， 37（15）: 192-197. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201615032. http://www.spkx.net.cn

DING Panpan， DING Ke， YU Zuhua， et al. Screening of Lactobacillus with cholesterol-degrading property and its effect on serum cholesterol in mice［J］. Food Science， 2016， 37（15）: 192-197. （in Chinese with English abstract） DOI:10.7506/ spkx1002-6630-201615032. http://www.spkx.net.cn

高膽固醇血癥是引起冠心病、高血壓、動脈粥樣硬化等心血管疾病的最主要因素之一，已成為威脅人類健康的首要因素，患病率和死亡率呈逐年上升趨勢［1］。研究表明人體血清膽固醇每高出正常水平1 mmol，心血管疾病的患病風險增加35%，血清總膽固醇每降低1%，發(fā)生冠心病的危險性可減少2%～3%［2］。因此，降低血清膽固醇，可有效防止心血管疾病的發(fā)生。目前臨床上主要是靠藥物降解血清膽固醇，雖然快速有效，但具有一定的副作用，而且價格昂貴［3］。所以通過非藥物途徑降解血清膽固醇已成為當前研究熱點之一。已有研究證明，乳酸菌及其發(fā)酵乳制品可有效降低血清膽固醇水平［4］。Mann［5］發(fā)現(xiàn)非洲MASAI部落因長期飲用乳酸菌發(fā)酵的乳制品，血清膽固醇呈較低水平。Harrison等［6］用嗜酸乳桿菌發(fā)酵的酸奶喂養(yǎng)嬰兒后發(fā)現(xiàn)嬰兒血清膽固醇水平明顯降低。這些結果引起了國內外營養(yǎng)學、微生物學等各界人士的普遍關注，從而掀起了微生物降膽固醇作用的研究熱 潮。目前，降膽固醇包括乳酸桿菌在內的乳酸菌研究并不多，而相對于其他乳酸菌，乳酸桿菌應用更為普遍。據報道，羊肉與其他畜禽肉相比，膽固醇含量相對較少，考慮到是否腸道微生物在起調節(jié)作用，所以選擇從羊體內分離。因此本實驗旨在從羊新鮮糞便中分離篩選高效降解膽固醇的乳酸桿菌，通過飼喂高血脂動物模型小鼠，檢測分離菌對小鼠血清膽固醇的降解情況，以期尋找有效降膽固醇的乳酸桿菌菌種，對于開發(fā)新型微生態(tài)制劑和功能性健康食品具有重要意義。

1　材料與方法

1.1材料、試劑與培養(yǎng)基

采自洛陽地區(qū)不同羊場羊的新鮮糞便20 份。

實驗動物及飼料：40 只雄性健康的BALB/c小鼠（8 周齡），體質量約為27～30 g，購自河南科技大學實驗牧場。

膽固醇（分析純）、鄰苯二甲醛、正己烷（分析純） 北京澳博星生物技術有限公司；總膽固醇（total cholesterol，TC）試劑盒、高密度脂蛋白膽固醇（high density lipoprotein-cholesterol，HDL-C）試劑盒、甘油三酯（triglyceride，TG）試劑盒 南京建成生物工程研究所；細菌全基因組DNA提取試劑盒 天根生化科技（北京）有限公司；Tks Gflexx DNA Polymerase、DNA Marker、dNTP、10×PCR Buffer 日本TaKaRa公司；高脂飼料（豬油10%、蔗糖5%、膽固醇1%、膽鹽0.3%、基礎飼料83.7%）。

MRS培養(yǎng)基：蛋白胨1 g、牛肉膏0.5 g、酵母浸粉0.5 g、吐溫-80 0.1 mL、葡萄糖2.0 g、磷酸氫二鉀0.2 g、檸檬酸二銨0.2 g、乙酸鈉0.5 g、硫酸鎂0.058 g、硫酸錳0.025 g，加蒸餾水定容至100 mL；碳酸鈣-MRS培養(yǎng)基：在MRS培養(yǎng)基中加入0.2 g/100 mL的CaCO3；降膽固醇篩選培養(yǎng)基（MRS-CHOL-THIO）：在MRS培養(yǎng)基中加入0.2 g/100 mL的巰基乙酸鈉、0.3 g/100 mL膽鹽，加熱溶解，121 ℃滅菌20 min后按體積分數(shù)1%加入10 mg/mL膽固醇。

1.2儀器與設備

ND100-1型氮氣吹掃儀 杭州瑞誠儀器有限公司；UV-1200紫外分光光度計 上海翱藝儀器有限公司；LDZX-50KBS立式壓力蒸汽滅菌器 上海申安醫(yī)療器械廠；電熱恒溫培養(yǎng)箱 上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司；SW-CJIFD型單人單面凈化工作臺 蘇州凈化設備有限公司；Thermo 4 ℃離心機 中國賽默飛世爾科技有限公司。

1.3方法

1.3.1降膽固醇菌株的初篩

每個糞便樣品稱取約1.0 g，分別加入裝有9.0 mL無菌生理鹽水的錐形瓶中，漩渦振蕩5 min。靜止片刻后吸取0.2 mL上清液涂布于碳酸鈣-MRS瓊脂平板，37 ℃厭氧培養(yǎng)48 h。挑取有溶鈣圈的菌落，在MRS瓊脂平板上劃線純化，連續(xù)劃線純化3 次，觀察菌落形態(tài)，采用革蘭氏染色法對菌株進行染色，光學顯微鏡下觀察菌體形態(tài)。挑選革蘭氏陽性無芽孢的桿狀菌株，-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2降膽固醇菌株的復篩

將初篩分離的菌株接種到MRS培養(yǎng)基中活化后，按體積分數(shù)2%的接種量接種于10 mL降膽固醇篩選培養(yǎng)基中，37 ℃厭氧靜止培養(yǎng)，每隔12 h搖勻1 次，培養(yǎng)48 h后，吸取混勻的菌液1 mL，5 000 r/min離心10 min，參照文獻［7］采用鄰苯二甲醛（o-phthalaldehyde，OPA）比色法測定膽固醇含量。

標準曲線的繪制：取1 mg/mL的膽固醇標準液，分別配制成5 個不同質量濃度（20、40、60、80、100 μg/mL）的工作液，然后各取1 mL工作液進行實驗，空白為1 mL無水乙醇，實驗平行3 次，測定方法同上。膽固醇溶液標準曲線y=0.006 0x-0.012 1（R2=0.990 0），回歸方程擬合后相關性較好，說明用此法測定膽固醇含量是可行的。

式中：ρ0為未接種菌株培養(yǎng)上清液550 nm波長處吸光度在標準曲線中對應的膽固醇質量濃度；ρ1為分離菌株發(fā)酵后培養(yǎng)上清液550 nm波長處吸光度在標準曲線中對應的膽固醇質量濃度。

1.3.3菌種鑒定

生理生化鑒定：對菌株按照《常用細菌系統(tǒng)鑒定手冊》［8］和《伯杰細菌鑒定手冊》［9］進行部分生理生化指標測定，包括明膠液化、過氧化氫酶實驗、硝酸鹽還原實驗、吲哚實驗、蘋果酸產氣實驗、硫化氫實驗、葡萄糖產氣、運動性、溫度實驗（15、45 ℃）、7 g/100 mL NaCl、糖發(fā)酵產酸實驗（葡萄糖、麥芽糖、核糖、蜜二糖、木糖、松三糖、阿拉伯糖、果糖、半乳糖、乳糖、蔗糖、甘露糖、鼠李糖、纖維二糖）。

16S rDNA分子鑒定：利用細菌全基因組DNA提取劑盒抽提分離菌株的全基因組DNA，并以此為模板，采用桿菌科16S rDNA基因的通用引物［10］P1（5’-AACTGAAGAGTTTGATCCTGGCTC-3’），P2（5’-TACGGTTACCTTGTTACGACTT-3’）進行聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）擴增。PCR反應體系（25 ?L）為：10×PCR Buffer 2.5 ?L，dNTP mixture 2 ?L，Tks Gflexx DNA Polymerase 0.5 ?L，P1、P2各0.5 ?L，模板1 ?L，加ddH2O至25 ?L。PCR擴增程序為：94 ℃預變性5 min，94 ℃變性30 s，53 ℃退火45 s，72 ℃延伸90 s，進行35個循環(huán)，72 ℃延伸10 min，最后4 ℃保存。取4 ?L PCR產物經1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測后，送生工生物工程（上海）股份有限公司測序。將測序結果通過美國國立生物技術信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）的BLAST程序在GenBank基因庫中進行比對，選取相似性較高菌株的16S rDNA序列，利用MEGA5.0軟件進行系統(tǒng)進化樹分析。

1.3.4小鼠分組及飼喂方式

取培養(yǎng)后的Lactobacillus plantarum L-3，用生理鹽水洗滌2 次，將菌體濃度調整到1.0×109CFU/mL，用于小鼠灌胃實驗。將40 只8 周齡BALB/c小鼠按各組間平均體質量無顯著差異重新分為4 組：A組飼喂基礎飼料，B組飼喂高脂飼料，C組飼喂高脂飼料+生理鹽水，D組飼喂高脂飼料+菌株L-3，每組10 只。每只小鼠灌胃1 mL/次，連續(xù)灌胃30 d。

1.3.5血清中TC、TG、HDL-C含量的測定

在實驗第15、30天分別采血（采血前禁食12 h），分離血清，2 500 r/min離心10 min取血清。分別參照試劑盒說明，采用酶標儀測定血清中TC、TG和HDL-C的含量并對比各組間血清指標的差異，計算動脈粥樣硬化指數(shù)（arteriosclerosis index，AI）［11］。

1.4數(shù)據處理

采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件，用方差分析檢驗顯著性，多重比較用最小顯著性差異法（least significant difference，LSD）檢驗，P＜0.01為極顯著性差異，P＜0.05為顯著性差異。

2　結果與分析

2.1 乳酸桿菌的初篩結果

從碳酸鈣-MRS瓊脂平板挑取菌落周圍有明顯溶鈣圈，邊緣整齊，正面凸起，乳白色，不透明，表面濕潤光滑的單菌落，MRS瓊脂平板劃線純化后，且革蘭氏染色陽性，不能形成芽孢，菌體呈直或彎的桿狀，單個、成對或呈鏈狀。初步共挑選35 株疑似菌株，部分菌株顯微形態(tài)見圖1。

圖1　部分分離菌株的革蘭氏染色形態(tài)（1 000×）Fig. 1 Morphology of isolated strains by Gram-staining （1 000 ×）

2.2菌株的膽固醇降解率

菌株體外降膽固醇能力是以菌體在含膽固醇的培養(yǎng)基中培養(yǎng)前后的膽固醇量的變化差值來評價的，以不接種的培養(yǎng)基作為空白對照。經篩選得到35 株菌株中14 株具有降膽固醇能力，菌株對膽固醇降解率從17.50%～35.93%不等，結果見表1，其中菌株L-3的體外膽固醇降解率最高可達35.93%，因此，將該菌株用于下一步實驗。

表1　分離菌株降解膽固醇能力Table 1 Cholesterol-reducing capacity of the screened bacteria

表1　分離菌株降解膽固醇能力Table 1 Cholesterol-reducing capacity of the screened bacteria

菌株膽固醇降解率/%菌株膽固醇降解率/% L-117.50±0.54 L-822.86±0.11 L-220.92±0.42L-921.13±0.21 L-335.93±0.43L-1027.42±0.23 L-425.41±0.27L-1730.43±0.17 L-519.92±0.34L-1832.87±0.45 L-618.65±0.28L-1930.86±0.58 L-717.93±0.22L-2018.92±0.34

2.3菌株鑒定

2.3.1生理生化鑒定

菌株L-3過氧化氫酶實驗、硝酸鹽還原實驗、吲哚實驗均為陰性，不液化明膠，不產生硫化氫氣體，無運動性，可以在15 ℃和7 g/100 mL NaCl環(huán)境中生長，但不能在45 ℃環(huán)境中生長，并且可以利用葡萄糖、麥芽糖、核糖、蜜二糖、木糖、松三糖、阿拉伯糖、果糖、半乳糖、乳糖、蔗糖產酸，但不能利用纖維二糖、甘露糖、鼠李糖產酸。與《伯杰細菌鑒定手冊》［9］中植物乳桿菌的生理生化特性基本相符，因此初步鑒定菌株L-3為植物乳桿菌（L. plantarum）。

2.3.2菌株的16S rDNA鑒定結果

圖2　分離菌株L-3 16S rDNA瓊脂糖凝膠電泳結果Fig. 2 Agarose gel electrophoresis of 16S rDNA fragment from strain L-3

以菌株L-3基因組DNA為模板，經PCR擴增后，產物在1%的瓊脂糖凝膠上電泳，如圖2所示，在約1 500 bp處有一條特異性條帶，與預期大小相符。經測序獲得該序列大小為1 487 bp（GenBank登錄號為KR824936），利用NCBI上的BLAST程序與GenBank數(shù)據庫中的序列進行比對，發(fā)現(xiàn)菌株L-3和植物乳桿菌的相似性超過99%，挑選出與該菌株親緣性較近的序列，通過MEGA5.0軟件中的“鄰接法（neighbor-joining，N-J）”模塊對該序列進行系統(tǒng)進化樹分析。由圖3可知，菌株L. plantarum L-3與植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum ATCC 14917）在進化樹上處于同一個分支，親緣關系最近，因此，可確定菌株L-3為植物乳桿菌。

圖3　基于分離菌株L-3分子系統(tǒng)進化樹Fig. 3 Phylogenetic tree derived from the 16S rDNA sequence of Lactobacillus plantarum L-3

2.4菌株L-3對高血脂癥小鼠血脂的影響

表2　植物乳桿菌L-3對小鼠血清TC、TG和HDL-C含量的影響Table 2 Effect of Lactobacillus plantaarruumm L-3 on serum TC， TG and HDLL--CCmmol/L

表2　植物乳桿菌L-3對小鼠血清TC、TG和HDL-C含量的影響Table 2 Effect of Lactobacillus plantaarruumm L-3 on serum TC， TG and HDLL--CCmmol/L

注：同列小寫字母不同表示差異顯著（P＜0.05）；同列大寫字母不同表示差異極顯著（P＜0.01）。下同。

組別TCTGHDL-C 15 d30 d15 d30 d15 d30 d A組1.75±0.17cB1.82±0.15cB1.20±0.09bBC1.28±0.07cB1.45±0.14aA1.56±0.17acAB組3.38±0.26aA3.71±0.24aA1.64±0.13aA1.81±0.11aA1.61±0.11aA1.37±0.07bcAC組3.24±0.23abA3.50±0.29aA1.60±0.14aAC1.65±0.09abAC1.53±0.17aA1.47±0.11acAD組2.72±0.22bA2.55±0.08bB1.57±0.11aAC1.44±0.10bcBC1.49±0.17aA1.75±0.11aA

由表2可知，小鼠飼喂高脂飼料第15天，與A組相比，B、C、D組小鼠血清TC水平均極顯著升高（P＜0.01），D組較B組TC水平顯著降低（P＜0.05），B組TG水平較A組極顯著升高（P＜0.01），C、D組TG水平顯著升高（P＜0.05）。實驗第30天，與A組相比，B、C組小鼠血清中TC和TG含量均極顯著升高（P＜0.0 1），D組T C和T G水平分別顯著升高（P＜0.05）和無顯著差異（P＞0.05）；B、C、D組HDL-C水平無顯著差異（P＞0.05）；與B組相比，C組TC、TG、HDL-C水平均無顯著差異（P＞0.05），D組TC、TG水平均極顯著降低（P＜0.01），HDL-C水平顯著升高（P＜0.05）；與C組相比，D組TC水平極顯著降低（P＜0.01），TG、HDL-C水平均無顯著差異（P＞0.05）。

2.5小鼠體質量、AI及HDL-C/TC變化

表3　植物乳桿菌L-3對小鼠體質量、AI及HDL-C/TC的影響Table 3 Effect of Lactobacillus plantarruumm L-3 on body weight and atherogenic indeex （x

表3　植物乳桿菌L-3對小鼠體質量、AI及HDL-C/TC的影響Table 3 Effect of Lactobacillus plantarruumm L-3 on body weight and atherogenic indeex （x

組別體質量/gAIHDL-C/TC 15 d30 d15 d30 d15 d30 d A組30.94±1.14aA41.73±0.81aA0.22±0.05bB0.22±0.07bB0.83±0.33aA0.84±0.04aAB組31.00±1.38aA45.06±2.40aA1.14±0.13aA1.98±0.86aA0.49±0.04bB0.38±0.02cCC組31.32±1.89aA43.43±1.39aA1.26±0.24aA1.48±0.25aA0.48±0.05bB0.44±0.04cCD組29.52±1.16aA39.60±2.65aA0.94±0.20aA0.62±0.11bB0.56±0.05bB0.68±0.32bB

由表3可知，各組小鼠體質量在實驗期間無顯著差異（P＞0.05）。第15天，與A組相比，B、C、D組AI均極顯著升高（P＜0.01），HDL-C/TC值均極顯著降低（P＜0.01）。第30天，與A組相比，B、C組AI值均極顯著升高（P＜0.01），B、C、D組HDL-C/TC值均極顯著降低（P＜0.01）；與B組相比，C組AI和HDL-C/TC值變化不明顯（P＞0.05），D組AI和HDL-C/TC值分別極顯著降低和升高（P＜0.01）；與C組相比，D組AI值極顯著降低（P＜0.01）。

3　討 論

乳酸菌源具有多樣性，降膽固醇乳酸菌主要是從乳制品、發(fā)酵制品中篩選［12-13］。與文獻報道比較，本實驗成功從新鮮羊糞中篩選出一株體外膽固醇降解率達到35.93%的菌株，經鑒定為植物乳桿菌，是相關報道來源于羊糞不多見的菌株。與已報道的菌株相比，菌株的降膽固醇能力之間存在一定差異。王今雨等［14］從酸奶中分離篩選出Lactobacillus plantarum NDC75017，其體外膽固醇降解率達到16.43%。Yildiz等［15］從嬰兒糞便中分離篩選的Lactobacillus plantarum GD2、Lactobacillus rhamnosus LP1、Lactobacillus rhamnosus E3和Lactobacillus rhamnosus E9膽固醇降解率分別為42.3%、30.3%、16.3%和30.8%。這種差異可能與菌株［15］、測定方法或者膽固醇源有一定的關系［16-17］。同時，本實驗將分離出的菌株應用到動物模型中進行了驗證，結果進一步證明了菌株L. plantarum L-3具有降膽固醇功能。

人們通常認為血清中高濃度的TC是引起心血管疾病的主要因素之一，降低高膽固醇人群的TC及低密度脂蛋白膽固醇（low density lipoprotein-cholesterol，LDL-C）濃度或升高HDL-C濃度可以減少心血管疾病的發(fā)病率。近年來，越來越多的學者開始將目光聚集到降膽固醇乳酸菌體內效果評價上［18-21］。本實驗通過灌胃L. plantarum L-3，15 d后，成功構建高血脂癥小鼠動物模型。與A組相比，各組小鼠血清TC、AI、TG和HDL-C/TC水平均顯著升高，HDL-C水平變化不明顯。通過灌胃L. plantarum L-3，30 d后，與高膽固醇模型B組相比，陰性對照C組TC、TG、HDL-C、AI水平均無顯著差異，D組TC、TG、AI水平均極顯著降低，分別降低了31.3%、20.44%和68.7%，D組HDL-C和HDL-C/TC水平分別升高了27.7%、44.11%，這與已報道的研究結果相似。Wang Yanping等［22］將Lactobacillus plantarum MA2飼喂大鼠35 d后，與對照組相比，實驗組TG 、TC和HDL-C含量最高分別降低了25.03%、25.14%和14.11%。Huang Ying等［23］以大鼠為模型，將植物乳桿菌LP27以109CFU/d的劑量喂食小鼠28 d后，與對照組相比，小鼠血清中的TC和TG含量分別下降了37.2%和53.8%。Nguyen等［24］以小鼠為模型，將Lactobacillus plantarum PH04以107CFU/只的劑量喂食小鼠14 d后，與對照組相比，小鼠血清中的TC和TG含量僅分別下降了7%和10%。然而也有報道稱乳酸菌無降低血清脂質的作用，F(xiàn)ak等［25］在研究羅伊乳酸桿菌對Apoe-/-小鼠代謝綜合征影響時發(fā)現(xiàn)該菌沒有降低小鼠TC和TG的作用。這可能是因為膽固醇生物降解雖然機理是多方面的，但是對于菌株本身來說是特異性的，如菌株要降解膽固醇，其本身可能產生膽鹽水解酶，或者菌體本身對膽固醇具有吸附作用，或與菌株的劑量、飼料中膽固醇的含量，同時與動物對菌株的攝取量和實驗周期等相關［22］。

本實驗結果表明經體外篩選到L. plantarum L-3對患有高脂血癥的小鼠具有顯著的降血脂作用，為進一步開發(fā)其為功能性微生態(tài)飼料添加劑奠定了理論基礎，為生產低膽固醇肉、蛋、奶等高品質畜產品提供了可能，但是其降膽固醇的機制還有待進一步研究。

［1］ XI Bo， LIU Fangchao， HAO Yongchen， et al. The growing burden of cardiovascular diseases in China［J］. International Journal of Cardiology， 2014， 174（3）: 736-737. DOI:10.1016/j.ijcard.2014.04.098.

［2］ HANSEN G， JELSING J， VRANG N. Effects of liraglutide and sibutramine on food intake， palatability， body weight and glucose tolerance in the gubra DIO-rats［J］. Acta Pharmacologica Sinica， 2012，33（2）: 194-200. DOI:10.1038/aps.2015.74.

［3］ ANANDHARAJ M， SIVASANKARI B. Isolation of potential probiotic Lactobacillus oris HMI68 from mother’s milk with cholesterol-reducing property［J］. Journal of Bioscience and Bioengineering， 2014， 118（2）: 153-159. DOI:10.1016/ j.jbiosc.2014.01.015.

［4］ LYE H S， RUSUL G， LIONG M T. Removal of cholesterol by lactobacilli via incorporation and conversion to coprostanol［J］. Journal of Dairy Science， 2010， 93（4）: 1383-1392. DOI:10.3168/jds.2009-2574.

［5］ MANN G V. Studies of a surfactant and cholesteremia in the Maasai［J］. American Journal of Clinical Nutrition， 1974， 27（5）: 464-469.

［6］ HARRISON V C， PEAT G. Serum-cholesterol and bowel flora in the newborn［J］. American Journal of Clinical Nutrition， 1975， 28（12）: 1351-1355.

［7］ RUDEL L L， MORRIS M D. Determination of cholesterol using o-phthalaldehyde［J］. Journal of Lipid Research， 1973， 14（3）: 364-366.

［8］ 東秀珠， 蔡妙英. 常用細菌系統(tǒng)鑒定手冊［M］. 北京: 科學出版社，2001: 267-295.

［9］ BUCHANAN R E， GIBBONS N E. 伯杰細菌鑒定手冊［M］. 中國農科院微生物研究所《伯杰細菌鑒定手冊》翻譯組， 譯. 8版. 北京:科學出版社， 1984: 797-822. DOI:10.3109/08923973.2010.518617.

［10］ 曾小群， 潘道東， 楊瑤， 等. 一株高效降解膽固醇乳酸菌的篩選鑒定及其益生潛能初探［J］. 食品科學， 2009， 30（21）: 241-245. DOI:10.3321/j.issn:1002-6630.2009.21.057.

［11］ 李婷婷. 降膽固醇益生乳酸菌的篩選及其在大鼠體內的應用研究［D］.哈爾濱: 東北農業(yè)大學， 2013: 20.

［12］ KUDA T， YAZAKI T， ONO M， et al. In vitro cholesterol-lowering properties of Lactobacillus plantarum AN6 isolated from ajinarezushi［J］. Letters in Applied Microbiology， 2013， 57（3）: 187-192. DOI:10.1111/lam.12094.

［13］ 汪曉輝， 于平， 勵建榮. 泡菜、傳統(tǒng)臘腸中降膽固醇乳酸菌的篩選及鑒定［J］. 微生物學報， 2009， 49（11）: 1438-1444. DOI:10.3321/ j.issn:0001-6209.2009.11.005.

［14］ 王今雨， 滿朝新， 楊相宜， 等. 植物乳桿菌NDC 75017的降膽固醇作用［J］. 食品科學， 2013， 34（3）: 243-247.

［15］ YILDIZ G G， OZTURK M， ASLIM B. Identification of Lactobacillus strains from breast-fed infant and investigation of their cholesterolreducing effects［J］. World Journal of Microbiology and Biotechnology，2011， 27（10）: 2397-2406. DOI:10.1007/s11274-011-0710-x.

［16］ 居華， 劉書亮， 敖靈， 等. 降膽固醇乳酸菌的篩選，鑒定及生長特性［J］. 中國乳品工業(yè)， 2007， 35（8）: 7-10. DOI:10.3969/ j.issn.1001-2230.2007.08.002.

［17］ 吳超， 李潤航， 于中英， 等. 雞蛋膽固醇含量測定方法比較研究［J］. 家畜生態(tài)學報， 2013， 34（11）: 57-60. DOI:10.3969/ j.issn.1673-1182.2013.11.014.

［18］ FUENTES M C， LAJO T， CARRIO J M， et al. Cholesterol-lowering efficacy of Lactobacillus plantarum CECT 7527， 7528 and 7529 in hypercholesterolaemic adults［J］. British Journal of Nutrition， 2013，109（10）: 1866-1872. DOI:10.1017/S000711451200373X.

［19］ ZHANG Li， ZHANG Xue， LIU Chunhong， et al. Manufacture of cheddar cheese using probiotic Lactobacillus plantarum K25 and its cholesterol-lowering effects in a mice model［J］. World Journal of Microbiology and Biotechnology， 2013， 29（1）: 127-135. DOI:10.1007/ s11274-012-1165-4.

［20］ JEUN J， KIM S， CHO S Y， et al. Hypocholesterolemic effects of Lactobacillus plantarum KCTC3928 by increased bile acid excretion in C57BL/6 mice［J］. Nutrition， 2010， 26（3）: 321-330. DOI:10.1016/ j.nut.2009.04.011.

［21］ OOI L G， AHMAD R， YUEN K H， et al. Lactobacillus acidophilus CHO-220 and inulin reduced plasma total cholesterol and low-density lipoprotein cholesterol via alteration of lipid transporters［J］. Journal of Dairy Science， 2010， 93（11）: 5048-5058. DOI:10.3168/jds.2010-3311.

［22］ WANG Yanping， XU Nu， XI Aodeng， et al. Effects of Lactobacillus plantarum MA2 isolated from Tibet kefir on lipid metabolism and intestinal microflora of rats fed on high-cholesterol diet［J］. Applied Microbiology and Biotechnology， 2009， 84（2）: 341-347. DOI:10.1007/ s00253-009-2012-x.

［23］ HUANG Ying， WU Fei， WANG Xiaojun， et al. Characterization of Lactobacillus plantarum Lp27 isolated from Tibetan kefir grains: a potential probiotic bacterium with cholesterol-lowering effects［J］. Journal of Dairy Science， 2013， 96（5）: 2816-2825. DOI:10.3168/ jds.2012-6371.

［24］ NGUYEN T D， KANG J H， LEE M S. Characterization of Lactobacillus plantarum PH04， a potential probiotic bacterium with cholesterol-lowering effects［J］. International Journal of Food Microbiology， 2007， 113（3）: 358-361. DOI:10.1016/ j.ijfoodmicro.2006.08.015.

［25］ FAK F， BACKHED F. Lactobacillus reuteri prevents diet-induced obesity， but not atherosclerosis， in a strain dependent fashion in Apoe-/-mice［J］. PLoS ONE， 2012， 7（10）: e46837. DOI:10.1371/journal. pone.0046837.

Screening of Lactobacillus with Cholesterol-Degrading Property and Its Effect on Serum Cholesterol in Mice

DING Panpan1， DING Ke1，2，*， YU Zuhua2， LI Wang1， LI Yuanxiao1， LIU Yichen1， HE Wanling1， ZHAO Zhanqin2， WANG Yuqin1，3，CHENG Xiangchao2， ZHANG Chunjie2
（1. Hongxiang Biological Feed Laboratory， Henan University of Science and Technology， Luoyang 471003， China；2. Key Laboratory of Animal Disease and Public Health of Henan Province， Luoyang 471003， China；3. Research Center of Breeding Engineering Technology for Meat Sheep of Henan Province， Luoya ng 471003， China）

Objective: To screen Lactobacillus with high cholesterol-degrading capacity from fresh sheep feces and explore the effect of the screened strain on serum cholesterol level in hypercholesterolemic mice. Methods: We screened Lactobacillus with high cholesterol-reducing capacity using Calcium Carbonate-Man-Rogosa-Sharp （MRS） medium and cholesterol-MRS medium. The screened strain， named as L-3， was identified by colony morphology， physiological and biochemical tests and 16S rDNA sequencing. A feeding experiment was conducted on forty Kunming male mice（eight weeks old）. The mice were randomly divided 4 groups: A， B， C and D， which were fed with normal diet， high fat diet （HFD）， HFD plus normal saline and HFD plus strain L-3， respectively. The serum levels of total cholesterol（TC）， triglyceride （TG）， and high density lipoprotein-cholesterol （HDL-C） were determined on the 15thand 30thday of the experiment. Results: This selected strain was identifie d as Lactobacillus plantarum L-3 and the degradation rate of cholesterol by the stain could reach up to （35.93 ± 0.43）%. A hypercholesterolemic mice model was successfully constructed after feeding a high-cholesterol diet for 15 days. Compared with group B， serum TC， TG and AI levels were extremely significantly decreased in group D after 30 days of oral administration of strain L-3 （P ＜ 0.01）， HDL-C levels of group D was significantly increased （P ＜ 0.05）， and HDL-C/TC levels were extremely significantly increased（P ＜ 0.01）. However， the negative control group did not show cholesterol degradation （P ＞ 0.05）. Conclusion: L. plantarum L-3 has probiotic potential as indicated by its hypocholesterolemic effect both in vivo and in vitro.

Lactobacillus； cholesterol degradation； mice； screening

2015-09-25

河南省科技廳科技攻關項目（162102110064）；河南省教育廳科學技術研究重點項目（14B230002）

丁盼盼（1987—），女，碩士研究生，主要從事動物微生態(tài)學研究。E-mail：dpl1021@163.com

丁軻（1977—），男，副教授，博士，主要從事動物微生態(tài)與動物傳染病學研究。E-mail：keding19@163.com

10.7506/spkx1002-6630-201615032

Q939.99

A

1002-6630（2016）15-0192-06

引文格式：