地中海貧血產前遺傳篩查流程簡化的風險評估

肖奇志 李戀湘 謝建紅 李磊 王格 張婧惟 龍若庭 周玉球

·論著·

地中海貧血產前遺傳篩查流程簡化的風險評估

肖奇志 李戀湘 謝建紅 李磊 王格 張婧惟 龍若庭 周玉球★

目的評估全血細胞分析（fullblood count，FBC）結合常見地中海貧血（簡稱地貧）基因檢測（簡稱兩步法）取代傳統的FBC結合血紅蛋白（hemoglobin，Hb）分析和地貧基因檢測（簡稱三步法）用于地貧產前遺傳篩查的可行性。方法采用回顧性分析的方法，對近2年（2014年1月1日至2015年12月31日）珠海市產前門診6 291名孕婦及其配偶FBC、Hb分析和地貧基因檢測的結果采用x2檢驗進行統計學分析，比較兩步法和三步法在產前地貧遺傳篩查中的可靠性及經濟性。結果以經典的三步法作為標準，兩步法對孕婦及其配偶地貧檢測的靈敏度、特異性、陰性預測值和陽性預測值以及總的診斷效率分別為98.25％、99.52％、85.98％、88.12％、91.23％，兩步法對血紅蛋白H（hemoglobin H，Hb H）病、輕型β-地貧、異常Hb和δβ-地貧/遺傳性持續性胎兒血紅蛋白綜合征（hereditary persistence of fetal hemoglobin，HPFH）的漏檢率分別為2.59％（2/77）、0.01％（2/1 695）、8.78％（13/148）和48.30％（43/89）。結論產前地貧遺傳篩查流程中采用三步法有其科學性，既可避免Hb H、異常Hb以及δβ-地貧/HPFH等個體的漏檢，還可為地貧DNA診斷指明方向。在未建立覆蓋中國人異常Hb病基因譜的分子篩查技術之前，兩步法暫不能取而代之。

地中海貧血；遺傳篩查；表型-基因型；血紅蛋白變異體

地中海貧血（簡稱地貧）是一組由于珠蛋白基因缺失或功能障礙導致珠蛋白鏈缺失或合成不足所引起的遺傳性溶血性血液病，為中國南方各區的常見病和多發病［1］，嚴重類型地貧可致死或致殘，該病易防難治，目前已成為熱帶和亞熱帶地區一個重大的公共衛生問題。為此，2013年2月珠海市啟動了免費地貧干預項目并在具有地貧研究基礎和大人群預防控制經驗［2］的珠海市婦幼保健院建立了市級地貧篩查管理辦公室和市級地貧診斷中心，負責協調、管理、督導全市產前地貧的遺傳篩查、接收和檢測珠海市其他36家醫療保健機構轉送的初篩陽性標本［平均紅細胞血紅蛋白（mean corpuscular hemoglobin，MCH）小于27 pg或/和平均紅細胞體積（mean corpuscular volume，MCV）小于82 fL］并負責嚴重類型地貧高風險胎兒的產前診斷和跟蹤隨訪。由于地貧遺傳篩查的網點多且分散，臨床實驗室的水平又參差不齊，加之標本轉運的環節多和時間長，經常出現送檢標本發生溶血現象，嚴重影響血紅蛋白（hemoglobin，Hb）分析的準確度。為此，本研究擬采用全血細胞計數（fullblood count，FBC）結合地貧基因診斷（簡稱“二步法”）替代世界地貧聯合會推薦的FBC結合Hb分析和地貧基因診斷［3-4］（簡稱“三步法”）以簡化地貧遺傳篩查技術流程，并以三步法作為標準，以評估其可行性和可能存在的技術風險。

1 材料與方法

1.1 標本來源

收集2014年1月1日至2015年12月31日珠海市37家產科服務機構送檢的地中海貧血篩查標本共6 291對，排除了僅檢測孕婦或配偶一方的未配對標本。所有標本均于抽血當天在全市37家產科服務醫療機構進行血細胞分析。夫妻雙方中只要一方紅細胞指數異常（MCV＜82 fL或/和MCH＜27 pg）即納入地貧初篩陽性夫妻，填寫相關資料并將夫妻雙方標本轉運至珠海市地貧診斷中心進行統一檢測。

1.2 血紅蛋白分析

采用美國Bio-Rad生產的儀器、配套試劑和質控品，按照說明書進行操作，并按照Hb各組分的洗脫時間初步進行異常血紅蛋白的鑒定。

1.3 常見α-地貧突變的檢測

所有標本采用單管多重PCR法和反向點雜交法［5］分別檢測中國人4種常見的缺失型（--SEA，-α4.2，-α3.7，--THAI）和3種非缺失型（αCS、αQS和αWS）α-地貧突變。α-地貧基因檢測試劑盒分別由深圳益生堂生物企業有限公司和亞能生物技術（深圳）有限公司生產，嚴格按照其提供的使用說明書進行操作、質量控制和結果判斷。PCR儀為Bio-Rad CFX96產品，分子雜交儀則由美國Robbin Scientific公司生產。

1.4 常見β-地貧點突變的檢測

采用反向點雜交法和探針熔解曲線法分別檢測中國人常見的17種和23種β-地貧突變［6］，試劑盒分別由深圳益生堂生物企業有限公司和廈門致善生物科技有限公司生產。所用設備同上。

1.5 少見類型地貧和異常血紅蛋白基因檢測

對于地貧表型陽性和/或有異常血紅蛋白表型但未檢出常見地貧型，δβ-地貧和遺傳性持續性胎兒血紅蛋白（hereditary persistence of fetal hemoglobin，HPFH）綜合征的孕婦及其配偶，則將其標本送至深圳華大基因公司做進一步DNA測序法以明確診斷。

1.6 統計學分析

采用SPSS 17.0統計軟件進行統計學分析。對于試驗診斷評價指標，以三步法作為標準，分別計算二步法的靈感度、特異度、陰性預測值和陽性預測值和總的診斷效率，并采用x2檢驗比較兩組間各診斷指標之差異，以α=0.05為水準，P＜0.05有統計學意義。

2 結果

2.1 Hb分析的結果

從上述所送檢的標本中，Hb分析檢測陽性特征性結果中有：快泳帶；慢泳帶；血紅蛋白A2（Hb A2）≥3.5％（β-地貧特征）；血紅蛋白F（Hb F）升高（≥2.0％）等，分類詳見表1。

表1 Hb分析的結果Table 1 The results of hemoglobin analysis

2.2 兩步法與三步法檢測結果的比較

由于檢測和內容方式一樣，二步法和三步法對于疑為α-地貧特征和紅細胞指數正常個體的診斷效率均完全相同，但在檢測如下3類標本時，則容易出現漏檢：Hb變異體時（包括Hb快泳帶和慢泳帶）；（Hb F≥2.0％但Hb A2＜3.5％）即表型為δβ-地貧/HPFH和少見類型β-地貧特征，具體結果詳見表2。

表2 二步與三步檢測法結果的比較Table 2 The results of two-step method compared with that of three-step method

2.3 兩步法與三步法檢測結果對篩出嚴重類型高風險胎兒的影響

在上述6 291對孕婦及配偶中，二步法和三步法均篩出146個α-地貧高風險胎兒，但二步法只檢出47個高風險重型β-地貧胎兒中的46個（97.87％）（χ2=1.01，P=0.314），二步法漏檢了其中一對夫妻，其中一方為輕型β-地貧，另一方為HbQ病，為穩妥起見，建議進行產前診斷。

2.4 兩步法與三步檢測法的成本和時間分析

兩步法與三步法相比，省略了Hb分析這一步驟，需要對所有小紅細胞癥進行α-和β-地貧基因診斷，增加β-地貧基因診斷數量，整體費用和耗費時間詳見表3。

3 討論

產前篩查地貧一般遵循三步法原則：FBC是地貧初篩的第一關，Hb分析用于地貧表型初步分類和檢測異常Hb區帶［包括血紅蛋白H（Hb H）］，而地貧基因診斷是對Hb分析后的標本進行有針對性地確定診斷或排除診斷，這也是經典的遺傳病診斷模式。地貧僅屬于血紅蛋白病的一種，還包括異常Hb病和δβ-地貧及HPFH等，這些突變也影響血紅蛋白的合成速率或質量，其某些類型與地貧復合也可能造成比較嚴重的影響，在臨床實驗室已經引起廣泛關注［1，7］。

表3 兩步法與三步法篩查的總費用與耗費時間比較Table 3 The total costand time of two-stepmethod compared with thatof three-stepmethod

在產前地貧篩查中三步法與兩步法的區別在于是否進行Hb分析，它能定量分析Hb A2，Hb F，Hb H和異常Hb等成分，對進一步明確基因診斷方法，確定表型有指示作用。從12 582份標本來看，有陽性表征（FBC+Hb分析）的占58.89％（7 410/12 582），Hb分析有特征性陽性表征占16.04％（2 019/12 582），它能鑒定的主要特征性有：β-地貧、Hb H病、中間型β-地貧、異常Hb病和δβ-地貧/HPFH特征，各占比為13.49％、0.67％、0.01％、1.18％和0.70％。按兩步法不進行Hb分析，漏檢HbH病中的一種少見或罕見突變，漏檢率為2.44％；漏檢全部異常Hb病（包括單純性Hb和合并地貧的異常Hb）；漏檢全部HPFH及δβ-地貧；上述3種表型漏檢總和占比為1.90％，總漏檢率較低。由于地貧基因型檢測為相同方法和技術，所以兩步法與三步法差別在于漏檢了2例HbH病中的一種少見或罕見突變和2例β-地貧特征者，導致最終判斷不同。

在地貧遺傳中夫妻雙方同等重要，所以漏檢分情況來看：如果漏檢個體其配偶FBC正常，也排除攜帶常見地貧突變類型，即使有漏檢情況發生，不產生嚴重后果，無需產前診斷，在地貧防控中不影響效果，本研究中占比為93.33％；如果漏檢個體其配偶為地貧，特別是β-地貧，考慮到胎兒有機會攜帶β-地貧復合異常Hb病或復合HPFH及δβ-地貧，進行產前診斷較為穩妥，在本次研究中占6.67％。，當然除血紅蛋白E（Hb E）外的其它異常血紅蛋白病，在中國人群中的攜帶率很低，絕大多數合并地貧后很少加重臨床表現，僅有一些個案報道［8-9］。總的來說2種方式的防控效果基本一致。

需要注意的是：無論是三步法還是二步法，均無法對表2中的146例疑似α-地貧標本進行突變的有效檢出，在排除缺鐵性貧血等其它導致小細胞低色素疾病的情況下，對存在地貧表型的標本進行更進一步檢測，特別是夫妻一方為已知地貧，另一方有小細胞低色素癥但未檢測出已知突變，更要特別留意。

地貧防控作為公共衛生問題，財政的支付能力也需要考慮，如果三步法改為兩步法，減少了Hb分析，但需對所有小細胞低色素的個體需要進行常見β-地貧基因突變檢測，一方面增加了基因檢測量，另一方也能最大限度避免β-地貧合并α-地貧個體的漏檢。改變后整個預防控制費用下降10.54％，從李兵等［10-11］比較篩查的不同組合形式看，無論對α-地貧還是β-地貧地貧的篩查方案，傳統三步法的費用都處于較高水平。另嚴重溶血標本對Hb分析有影響，而對基因檢測沒有影響。減少Hb分析，整個操作流程更暢通，預計整個檢測時長下降25％，這對臨床檢測也工作非常重要。

臨床上常見類型地貧基因檢測技術經過多年的發展，在方法、技術、儀器和流程上都取得長足進步的時候，建立了許多高通量、全自動、快速、準確的實用臨床應用技術，將異常Hb病和δβ地貧及HPFH相關基因整合到地貧相關基因突變譜中進行檢測是可行的［12-13］。自動化核酸提取儀的應用助推分子診斷朝快速、高通量、高效的方向發展。

隨著對地貧的認識進一步深入、地貧基因檢測技術發展和覆蓋突變譜的提升、核酸提取儀的廣泛使用、高通量基因分析儀的推廣和分子診斷試劑價格下降，為在地貧預防控制與診斷中全面采用分子診斷技術創造了有利條件。中山地區也采用了兩步法進行試驗［14］，香港地區的經驗也驗證了這一模式的有效性［15-16］。所以未來在大人群防控體系中采用二步法代替三步法是一種節約資源、加快速度、不影響效果的做法。

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The risk assessment of prenatal genetic screening procedure simplified for thalassemias

XIAO Qizhi，LI Lianxiang，XIE Jianhong，LI Lei，WANG Ge，ZHANG Jingwei，LONG Ruoting，ZHOU Yuqiu★
（Zhuhai Institute of Medical Genetics＆amp;Department of Clinical Laboratory，Zhuhai Municipal Maternity and Child Healthc are Hospital，Zhuhai，Guangdong，China，519001）

Objectives To evaluate the feasibility of prenatal genetic screening for thalassemias by full blood cell analysis（full blood count，FBC）combined with thalassemia gene detection（hereinafter referred to as the two-step method）instead of the FBC combined with hemoglobin（Hb）analysis and thalassemia gene detection（hereinafter referred to as the three-step method）.Methods The results of FBC and Hb analysis as well as molecular diagnosis of thalassemias of 6 291 pregnant women and their spouses from January 1，2014 to December 31，2015，atantenatal clinics of ZhuhaiCity were analyzed retrospectively byχ2test.The reliability and economic viability of the two-step method were compared with the three-step method of prenatal genetic screening for thalassemias.Results Taking the classic three-step method as a standard，the sensitivity，specificity，negative predictive value and positive predictive value，and accuracy of the two-step method were 98.25％，99.52％，85.98％，88.12％，91.23％，respectively.The rate of missed diagnosis of the two-step method to HbH disease，β-thalassemia trait，Hb variants and δβ thalassemia/hereditary persistence of fetal hemoglobin（HPFH）were 2.59％（2/77），0.01％（2/1 695），8.78％（13/148），and 48.30％（43/89）respectively.Conclusions Prenatal genetic screening process of thalassemia with three-step method has its adavantages.It can avoidfailure of detection of not just HbH disease and Hb variants but alsoδβ-thalassemias/HPFH，and what's more point to clear direction for DNA diagnosis of thalassemias.The three-step method tentatively can't be replaced by the two-step method.

Thalassemia；Genetic screening；Phenotype-genotype；Hemoglobin（Hb）variants

廣東省科技計劃項目（2009A030301002）；珠海市衛生和計劃生育局醫學科研項目（2014062）

珠海市婦幼保健院檢驗科＆amp;珠海市醫學遺傳研究所，廣東，珠海519001

★通迅作者：周玉球，E-mail：zhzhouyq@126.com