HBV核苷（酸）類似物耐藥突變及其檢測技術的臨床應用

巢薇何寶玉

·綜述·

HBV核苷（酸）類似物耐藥突變及其檢測技術的臨床應用

巢薇★何寶玉

目前，可供臨床應用的抗慢性乙型肝炎（chronic hepatitis B，CHB）的核苷（酸）類似物［nucleos（t）ide analogs，NAs］包括拉米夫定（lamivudine，LAM）、替比夫定（telbivudine，LdT）、阿德福韋酯（adefovir，ADV）、恩替卡韋（entecavir，ETV）及替諾福韋酯（tenofovir，TDF），NAs作為病毒逆轉錄酶抑制劑，可抑制HBV DNA復制擴增。由于HBV屬于高基因變異率病毒，NAs長期治療后，選擇壓力下使耐藥病毒株成為優勢株，影響治療效果。因此，為防治CHB抗病毒治療中耐藥的發生，弄清楚其耐藥機制及變異的監測及診斷十分必要。本文總結了近年來發現的常見突變位點，并比較了幾種臨床應用的突變監控及檢測技術，對耐藥突變進行早期、快速檢測具有重要臨床意義，使慢性HBV感染的監測達到最優化。

核苷（酸）類似物；耐藥突變；乙型肝炎病毒；慢性乙型肝炎；常見耐藥變異；突變位點檢測

乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）是一種高危致病性病毒，慢性乙型肝炎（chronic hepatitis B，CHB）是HBV最常引起的一種慢性疾病，1/3以上的感染者在中國［1］。抗病毒治療是CHB的根本治療措施，核苷（酸）類似物［Nucleos（t）ide analogs，NAs］作為目前臨床抗病毒治療的主流藥物，主要包括拉米夫定（lamivudine，LAM）、替比夫定（telbivudine，LdT）、阿德福韋酯（adefovir，ADV）、恩替卡韋（entecavir，ETV）及替諾福韋酯（tenofovir，TDF）5種常用藥物，它們均可抑制病毒DNA復制［2］。但隨著應用時間的推移和應用群體的擴大，NAs耐藥問題日趨嚴重。啟動NAs抗病毒治療后，需定期監控評估NAs常見耐藥突變位點變異率，根據應答和耐藥情況調整藥物和療程［3］。這已成為CHB抗病毒治療中的重要監測措施。新突變位點的不斷發現及檢測方法的不斷更新和廣泛應用，將為提高CHB抗病毒的治療療效提供重要的理論和技術支持。本文綜述了近年來報道的基因多位點耐藥相關突變，這有助于臨床及時發現乙型肝炎患者是否存在HBV耐藥。同時，文章比較了幾種臨床應用的突變監控及檢測技術，結合其原理及技術發展，對耐藥檢測技術的現狀進行分析比較，為臨床動態監測HBV變異病毒株、指導合理用藥奠定了基礎。

1 HBV NAs的耐藥機制

HBV吸附脫殼感染肝細胞后，在HBV DNA聚合酶作用下，以負鏈DNA為模板修補延長正鏈，形成的共價閉合環狀的雙鏈DNA（covalently closed circular DNA，cccDNA）進入細胞核［4-5］。在核內以cccDNA為模板轉錄產生的mRNA，含有HBV全部遺傳信息，故稱為前基因組RNA。前基因組RNA出核后逆轉錄為負鏈DNA，繼續以負鏈為模板合成正鏈，雙鏈環化形成完整的HBV DNA［4，6］。NAs治療則通過抑制逆轉錄酶活性，阻止前基因組RNA逆轉錄形成新的病毒DNA，從而發揮抑制病毒復制的作用。HBV前基因組RNA是以HBV的cccDNA為模板合成的，即NAs的藥效靶點在cccDNA的下游，見圖1。所以NAs不能直接清除已經存在的cccDNA［7-8］，因此，為了維持HBV的低水平復制，NAs治療需很長時間。其次，由于HBV DNA復制過程必需的逆轉錄酶缺乏3′-5′外切活性，極易導致堿基錯配，病毒基因自發突變頻率高。因此，一旦病毒對長期服用的某種NAs藥物產生選擇壓力，此種藥物便失去了療效，從而導致耐藥的發生。

體內出現耐藥變異后，繼續維持相同NAs治療，野生敏感病毒株被抑制，變異株加快復制取代野生株成為優勢株，從而導致對NAs耐藥。隨著研究的深入，耐藥機制已由傳統的定性研究向精確的定量研究跨越，隨之而來的一系列問題需要研究者繼續去探索：變異株達到病毒群的多少百分比可以稱為優勢株？繼續使用NAs治療，變異株積累成優勢株，最后成為耐藥株的速率與不同NAs的服用劑量有何關系？優勢株占多少比例時會出現病毒學突破？在檢測到耐藥突變后，如何進一步明確患者體內變異株的比率或者變異株的拷貝數與臨床的關系？新突變位點的不斷發現及檢測方法的不斷更新，將對這些問題的深入研究和探討提供必要的保障與支持。

2 HBV NAs常見的耐藥突變位點

HBV耐藥基因突變發生于病毒逆轉錄酶基因序列區域。根據2001年提議的耐藥突變位點命名規則，將HBV耐藥變異統一從逆轉錄酶區（各基因型均為344個氨基酸）的第一個氨基酸數起并加前綴rt，分別為rt1～rt344（例如YMDD變異被命名為rtM 204V）［9］。

2.1 LAM和LdT耐藥變異位點

LAM是最早應用于臨床的核苷類似物，迄今仍有CHB患者使用LAM，因此，其耐藥突變位點最多，而且耐藥發生率以每年約30％的速率增加［10］。LAM耐藥突變主要發生在逆轉錄酶基因C區的保守序列YMDD區域，堿基發生置換時，第204位的蛋氨酸（M）變為亮氨酸（V）或異亮氨酸（I）即為rtM 204V/I/S。在rtM 204V/I出現后，若繼續維持LAM治療，則會出現耐藥性更強的突變—rtL180V/I/M［11-12］。rtM 204V/I和rtL180V/I/M的患者會進一步引發第3個常見的突變位點rt173L。近年來報道的LAM耐藥突變位點還包括rtA181T及rtQ215S。長期的LAM治療通常會導致許多組合型耐藥突變，rtL180M+rtM 204V、rtL180M+ rtM 204I、rtV173L+rtL180M+rtM 204V、rtM 204I是LAM耐藥變異的主要組合方式［13］。

LdT和LAM同屬于L-核苷，故二者具有交叉耐藥突變位點，包括M 240及L180［14］。由于存在交叉耐藥，故不可在出現LAM耐藥后繼續使用LdT治療［15］。因此，對于結構相似會出現交叉耐藥現象時，需綜合考慮耐藥位點及相關變異情況，適時進行耐藥監控，結合臨床癥狀，選擇正確的抗病毒治療藥物。

2.2 ADV耐藥變異位點

ADV耐藥突變率較LAM低，初治患者（指未用過NAs抗HBV藥物者）第1年未見耐藥，HBeAg陰性初治患者ADV治療的基因耐藥率前5年分別為0、3％、7％、8％、11％［11］。N236T氨基酸置換是ADV標志性耐藥變異位點，繼續ADV治療，引起YMDD臨近區域的耐藥變異rtA181V/T。常見的ADV耐藥突變還有C區的rtV214A、D區的rtQ215S、rtI233V及rtL217R等。ADV藥物結構與LAM不同，rtN236T變異不會改變LAM的敏感性，但rtA181V/T、rtV214A及rtQ215S變異株會與LAM出現交叉耐藥［16］。

2.3 ETV耐藥變異位點

ETV是鳥嘌呤核苷類似物，ETV的耐藥位點是在拉米夫定耐藥位點（rtL180M+rtM 204I/V/S）基礎上同時出現A區rtI169T、B區rtT184C/G、rtS202G/I和D區rtM 250V等突變。ETV對初治患者基本不發生耐藥，1～5年的耐藥突變率均為＜1％［17］。而發生拉米夫定耐藥患者中，ETV治療2年的累積基因耐藥率為16％，病毒學反彈超過10％，較初治患者明顯升高。ETV具有高基因屏障的特點，多位點突變才可能出現耐藥現象，這也是ETV耐藥發生率低的重要原因。

2.4 TDF耐藥變異位點

TDF與ADV結構相似，兩者具有類似的抗病毒活性。研究顯示，TDF治療3年后并未出現明確的TDF耐藥，有報道第194位丙氨酸至蘇氨酸的替換（rtA194T）與TDF耐藥相關，但出現該耐藥后仍對ETV敏感［18］。體外實驗發現，rtA181/T或rtN236T ADV耐藥株對TDF的敏感性下降3～4倍，推測可能是TDF潛在突變位點［19］。

耐藥位點的提出與確立是一個長期的、需要重復驗證的過程。在驗證過程中，由于表型耐藥檢測體系的差別可能會出現結果的不一致。單個變異位點的確定需要結合HBV基因型、全基因組序列及患者的臨床指標等各方面因素［20-21］。此外，我們需要深入了解耐藥變異與臨床耐藥的關系，結合臨床癥狀及個體化因素，綜合分析耐藥變異引起的臨床改變，從而確定準確可靠耐藥變異位點。隨著研究的不斷深入，越來越多的突變位點被發現，表1總結了近幾年發現報道的NAs常見的耐藥突變位點，可目前應用于臨床指導藥物選擇的位點有限。因此，我們需要在探索新位點的同時，建立更加成熟的突變檢測技術，制定合理的抗病毒治療方案，對患者服用藥物的相關耐藥突變位點實時監控，及時調整治療方案。

3 HBV NAs的耐藥突變檢測

建立準確、靈敏和經濟可行的耐藥突變檢測方法對于慢性HBV感染抗病毒治療中耐藥性的監測和確定具有重要意義。目前已報道的HBV耐藥突變的檢測方法根據原理的不同大致可分為測序法、反向雜交法及PCR相關技術方法等，這些方法各有利弊。隨著臨床耐藥形勢日漸嚴峻，發展并推廣特異性強、靈敏度高及價格適中的檢測手段成為當務之急。

3.1 測序法

表1 HBV NAs常見的耐藥突變位點Table 1 Common drug resistance mutations of NAs against HBV

測序法主要包括經典直接測序法、克隆測序法、焦磷酸測序法、SNaPshot技術等。隨著生物科學的迅猛發展，作為最準確的耐藥檢測方法，測序法不斷發展完善。與其他耐藥檢測方法相比，測序法精準度和特異性都較高，且能對多個位點同時進行檢測。測序法與其他檢測手段進行比較，可作為檢測功效的衡量標準。

3.1.1 直接測序法（direct sequencing，DS）與SNaPshot單核苷酸多態性檢測法

DNA直接測序法一直被認為是檢測基因突變的金標準，研究者曾利用DS檢測出HBV YMDD和rtA181T/V位點變異［22］。DS最大的優勢是可檢測新發突變位點，DS的檢測結果通常與還可與其他突變檢測技術比較，作為檢測功效的衡量標準。由于DS要求將目標序列進行擴增并連接到載體再行檢測，因此無法滿足HBV快速診斷和大規模檢測的要求。另外，對于多種基因型同時存在的病毒群，DS只能檢測DNA含量高的優勢病毒株。而對于病毒含量低標本，DS靈敏度不高，可能會漏檢低比例（＜1％）耐藥突變［23］。

SNapshot單核苷酸多態性檢測法，即微測序法，是在DNA直接測序基礎上發展出來的一種新的檢測方法。該技術依據待檢測序列設計特異性引物，在反應體系中加入熒光標記的ddNTP，依據峰的顏色確定樣本的基因型，依據峰的位置確定延伸產物對應的SNP位點。Salpini等［24］利用SNaPshot技術對204例CHB患者血清檢測耐藥位點檢測，結果與測序結果一致，證實了SNaPshot技術高度的準確性。與直接測序法相比該技術操作簡便，經濟快速。但是此類方法對引物的要求較高，并且一般只可以檢測已知突變位點。

3.1.2 焦磷酸深度測序

焦磷酸深度測序技術（pyro-sequencing，PyroS）是近年來臨床應用較廣的一種實時DNA序列分析技術。該技術敏感度較高，最少可檢測0.1％比例的耐藥突變，因此可作為耐藥變異的早期檢測方法。Ciftci等［25］運用該技術對42位CHB患者的耐藥位點進行掃描，發現了rtL180I、rtQ215P、rtI233Y、rtN238D和rtM 250S 5個獨立的耐藥突變位點，作者進一步研究發現rtI266G突變會與LAM耐藥有關，推測可能是LAM潛在的耐藥變異位點。目前，以高靈敏度及特異性為特點的焦磷酸深度測序已超越經典普通測序方法，尤其是在早期監控及檢測階段，發揮了重要的作用。

3.2 雜交法

雜交法是使樣本的擴增產物與熒光標記探針特異性結合，通過對鑒別不同熒光檢測突變位點的方法。由于擴增產物可同時與多個探針結合，故雜交法可一次性檢測多個突變模式。

3.2.1 線性探針技術

線性探針技術用于檢測HBV耐多藥，具有成本低、特異性高等特點，為耐多藥突變的早發現、早治療提供了診斷依據。Yoshida等［26］針對HBV野生型和已知位點（rtM 204V/I）的耐藥型毒株基因序列分別設計探針，固定于PVDF膜，將待檢測樣本經PCR擴增后雜交，結果在109名CHB患者中，檢出了90名rtM 204V/I突變，檢出率為88.2％。線性探針技術的缺點是只可檢測已知突變。近年來，以線性探針為基礎發展起來的交聯擴增技術（ligation amplification assay，LigAmp）在YMDD變異檢測時具有較高敏感度，可在LAM耐藥突變進行早期監控［27］。

3.2.2 基因芯片技術

基因芯片突變檢測技術是將特定的基因片段或寡核苷片段以特定順序密集排列于某種固相載體上（如硅片或玻片），形成基因芯片，與熒光標記樣本雜交，通過激光共聚焦系統檢測雜交信號強度，讀取樣本的數量和序列信息。已有研究顯示，芯片檢測法準確率達96％，敏感性達95％，特異性為100％，對比傳統的DNA序列分析法（準確率87％，敏感性82％，特異性100％），該技術有較高的檢測靈敏度與準確率［28］。基因芯片技術與傳統雜交技術相比，具有檢測效率高、系統微型化、能夠同時對多個位點同步檢測的優勢，符合現代分子生物醫學發展的趨勢，但HBV的高突變率縮短了寡核苷探針的使用壽命，偏差的出現導致一定比例的假陰性，制約了該技術的發展及應用［29］。

3.3 PCR相關技術

3.3.1 實時熒光定量PCR（realtime fluorescence quantitative PCR，RTFQ-PCR）熔解曲線分析法

RTFQ-PCR技術利用熒光信號實時積累監控整個PCR過程，SYBR GreenⅠ非特異性地嵌入DNA雙鏈間，發出強烈熒光信號，若存在其他雙鏈寡核苷酸，便會產生假陽性信號，降低了檢測的精確性［30］。Zeng等［31］利用實時熒光PCR技術檢測HBV YIDD耐藥突變，與市售優秀HBV耐藥突變測序檢測試劑盒檢測結果的完全一致率91.2％（93/102），部分一致率8.8％（9/102），未發現完全不一致（0/102），兩法一致性好（Kappa=0.676，P= 0.000）。克隆測序檢結果與RTFQ-PCR完全一致。RTFQ-PCR檢測技術可通過Ct數值確定變異病毒含量及其與野生毒株的比值，具有重復性好、靈敏度高、無擴增后處理等優點，是臨床應用時間最長、最成熟的一種分子檢測技術，目前已成為臨床實驗室普遍采用的檢測技術。但該方法也有其局限性，如HBV的高突變性導致探針和引物設計出現偏差，出現假陰性。

3.3.2 聚合酶鏈式反應微板核酸雜交-酶聯免疫吸附法（PCRmicroplate nucleic acid hybridization-enzyme linked immunosorbent assay，PCRmnh-ELISA）

PCRmnh-ELISA檢測技術將基因擴增、核酸雜交和酶聯顯色3種診斷技術結合，通過設計特定的組合引物將突變基因和正常基因分辨出來。PCR-mnh增強了核酸雜交的特異性，而與ELISA技術結合后則提高了檢測方法的靈敏度。PCRmnh-ELISA可以檢測出已知變異的基因序列，可同時從1 000個正常基因序列中檢測出1個變異位點，且檢測結果不受正常基因序列干擾。但體系中的非特異性探針雜交及過度敏感的信號放大系統均會導致假陽性的產生。此外，此法操作復雜，需在開放環境中進行，可能會對實驗室造成污染。目前該技術僅用于科學研究，臨床普及難度大。

3.4 其他檢測方法

變性高效液相色譜（denaturing high performance liquid chromatography，DHPLC），也稱為溫度調節的雜合雙鏈分析技術，是近年來發展起來的一項新的分析技術。該技術利用部分變性條件下同源—異源雙鏈靶DNA解鏈特征的差異性進行突變位點檢測。該檢測方法具有快速、高特異性、高靈敏、高通量、廉價省時及操作簡單等優點。但是，該技術對待檢樣本的PCR技術要求很高，對PCR引物設計、體系優化及最適擴增片斷等都有較高要求，還需保證PCR產物具有較高的含量和質量。當PCR片段擴增特異性較差時，可能會導致結果假陽性，以致檢測結果不準確。

4 展望

隨著對NAs耐藥機制研究的不斷深入，耐藥管理的觀念也在不斷更新。在整個用藥期間對病患定期隨訪、精確監控耐藥位點以便第一時間診斷出病毒耐藥成為臨床最行之有效的耐藥管理方案，精確嚴謹的實驗室檢測則是上述方案取得成功的有力保證。

隨著生物醫學的快速發展，越來越多的新技術開始應用于HBV耐藥突變的檢測。敏感性和特異性越來越高、可檢測位點（尤其是未知變異位點）越來越多、樣本量越來越大、操作簡化、成本低廉，這些特點都是NAs耐藥突變檢測新技術的發展趨勢。經典的直接測序法特異性強、敏感度高，可檢測未知變異位點，一直被視為變異位點檢測的金標準；熒光定量PCR技術靈敏度較高，而且熒光定量分析儀目前也已普及，價格相對適中，因此目前認為該方法在臨床上應用前景最為廣泛，適合大標本量檢測；以焦磷酸測序技術和SNaPshot為代表的第三代測序技術兼顧了高敏感性、高特異性等特點，高通量的檢測又可大幅度降低成本，SNaPshot技術更可直觀地檢測基因片段堿基序列，但技術尚未成熟，且對引物和實驗條件要求較高，臨床普及開展難度大，相信未來會有所改善。

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Hepatitis B virus nucleos（t）ide analogues drug resistance mutations and the clinical application of variation loci detection

CHAOWei★，HEBaoyu
（Medical Clinical Laboratory，The Fourth Hospital Affiliated to Guangxi Medical University，Liuzhou，Guangxi，China，545005）

At present，nucleos（t）ide analogues（NAs）available for clinical application of Chronic hepatitis B（CHB）include lamivudine（LAM），telbivudine（LdT），adefovir（ADV），entecavir（ETV），and tenofovir（TDF）.As virus reverse transcriptase inhibitors，NAs can inhibit HBV DNA replication.Because of the highmutation rate of HBV，long-term treatment with NAs resulting in drug-resistant strains will reduce the effect of NA treatments.Therefore，in order to control the occurrence of drug resistance in CHB antiviral treatment，figuring out the resistance mechanism and monitoring and diagnosis of variation is essential.In this paper，we summarized common mutations discovered in recent years，and compared the clinical application of several technologies monitoring and detecting drug-resistant mutations，which is important for early and rapid mutation detection and optimizing the monitoring of chronic HBV infection.

Nucleos（t）ide analogues；Drug resistance mutations；Hepatitis B virus；Chronic hepatitis B；Common drug-resistance variation；Variation loci detection

國家自然科學基金（81160269）；柳州市腫瘤疾病防治重點實驗室建設（2014G020403）

廣西醫科大學第四附屬醫院醫學檢驗科，廣西，柳州545005

★通訊作者：巢薇，E-mail：2312969581@qq.com