北京地區犬貓弓形蟲和新孢子蟲感染的檢測與分析

于珊珊，錢偉鋒，2，許建海，劉　　群

（1.中國農業大學動物醫學院，北京 海淀 100193；2.河南科技大學，河南 洛陽 471023）

北京地區犬貓弓形蟲和新孢子蟲感染的檢測與分析

于珊珊1，錢偉鋒1，2，許建海1，劉群1

（1.中國農業大學動物醫學院，北京 海淀 100193；2.河南科技大學，河南 洛陽 471023）

了解犬、貓弓形蟲和新孢子蟲感染情況，應用SPA-ELISA和ICT對2008-2011年間收集的北京地區137份流浪貓、186份寵物貓和763份寵物犬及其他部分省市的57份鄉村犬進行血清抗體檢測；同時，提取貓及部分犬的血樣DNA，分別擴增弓形蟲和新孢子蟲特異性基因片段。結果顯示，流浪貓和寵物貓弓形蟲抗體陽性率分別為24.1%（33/ 137）和13.4%（25/186），寵物犬和鄉村犬分別為14.5%（111/763）和24.6%（14/57），不同來源的犬或貓抗體陽性率差異顯著（P＜0.05）；流浪貓和寵物貓的新孢子蟲抗體陽性率分別為7.30%（10/137）和6.45%（12/186），寵物犬和鄉村犬分別為6.06%（8/132）和10.5%（6/57），差異均不顯著（P＞0.05）。寵物貓和流浪貓基因檢測的陽性率分別為3.65%和2.15%，差異不顯著（χ2=0.22，P＞0.05）；132份寵物犬和29份鄉村犬基因檢測陽性率分別為18.2%和6.90%，差異顯著（P＜0.05）。血液中蟲體特異性基因檢出率低于血清抗體檢出率。寵物犬和寵物貓弓形蟲和新孢子蟲感染隨著年齡增加呈上升趨勢，但各年齡段差異不顯著（P＞0.05）。

犬；貓；弓形蟲；新孢子蟲；抗體；DNA

龔地弓形蟲（Toxoplasma gondii，簡稱弓形蟲）是能夠寄生于多種動物與人有核細胞的頂復亞門原蟲。貓既是弓形蟲的終末宿主又是中間宿主，犬、家畜、家禽、野生動物、海洋哺乳動物和人都是弓形蟲的中間宿主。犬新孢子蟲（Neospora caninum，簡稱新孢子蟲）是與弓形蟲極其相似的多種動物共患原蟲，犬既是終末宿主又是中間宿主，貓、家畜、禽類、野生動物等均為中間宿主。弓形蟲和新孢子蟲都是機會性病原，均可寄生于宿主的全身有核細胞，危害形式多樣，健康犬和貓感染后較少表現臨床癥狀，多呈隱性感染長期帶蟲。免疫力低下動物感染弓形蟲后可呈現全身性熱性疾病，新孢子蟲的主要危害是引起感染動物的神經肌肉功能障礙，幼犬可表現為跛行和皮膚潰瘍。二者共同的臨床表現為懷孕動物流產、死胎、木乃伊胎等繁殖障礙。

近年來，寵物犬和貓飼養量不斷增多，流浪犬和貓的數量也隨之升高，犬貓感染弓形蟲和新孢子蟲的危害及其對人類的潛在威脅逐漸被關注。國內外已有多篇關于犬、貓弓形蟲和新孢子蟲感染的報道［1-5］。不同報道中犬貓弓形蟲和新孢子蟲的感染率存在明顯差異，感染情況與動物的養殖方式、品種、機體狀況以及氣候等諸多因素有關，所用檢測方法也一定程度影響檢測結果。

為了進一步了解北京地區犬、貓弓形蟲和新孢子蟲的感染狀況，我們分別檢測北京地區的寵物犬、貓及流浪貓及鄉村犬的血清抗體和血液DNA，為犬貓的弓形蟲和新孢子蟲感染及進一步的防控研究提供數據和資料。

1　材料與方法

1.1材料流浪貓137份，采自北京生活小區及部分收容所。寵物貓186份和寵物犬763份，采自中國農業大學動物醫院的門診病例。鄉村犬57份，采自北京周邊的鄉村散養犬。采集靜脈血，分離血清-20℃冰箱保存備用；提取血液有型成分DNA保存備用。

1.2主要儀器分別使用Bio-rad公司的酶標儀model680、德國Eppendorf公司的Centrifuge5810R臺式高速冷凍離心機和移液器、德國Biometra公司的PCR儀和 Alpha Innotech公司 Alphalmager 2200凝膠成像系統。

1.3主要試劑包被緩沖液（0.05mol/L pH值9.6的碳酸鹽緩沖液）；20×濃縮洗滌液（pH值6.0-6.2的PBST溶液）；封閉液（5%馬血清和1%BSA的PBS）；血清樣本稀釋液（1%BSA的PBS，pH值7.4）；酶標記物SPA-HRP稀釋液（1%BSA的PBS，pH值7.4）；酶標記物工作液（1∶12 000）；終止液（2 mol/L H2SO4）。酚∶氯仿∶異戊醇（25∶24∶1）。分離緩沖液：按照pH值7.4 Tris·Cl（10 mol/L），NaCl（10 mol/L），pH值8.0 EDTA-Na2（25 mol/L），SDS（1%），蛋白酶K（100 μg/mL）的終濃度在蒸餾水中加入適量上述液體，混勻。1%氯金酸和1%檸檬酸三鈉。

1.4試驗方法

1.4.1血清弓形蟲抗體檢測應用本課題組研制的SPA-ELISA試劑盒。

1.4.2血清新孢子蟲抗體檢測應用本課題組建立的膠體金試紙條（ICT）。

1.4.3血液DNA提取常規方法提取全血沉淀的DNA，-20℃保存備用。

1.4.4巢氏PCR擴增弓形蟲特異性DNA片段根據弓形蟲的SAG1基因設計、合成兩對引物，外引物對Tg1（GCGAATTCATGTCAGATCCCCCTCT）和Tg2（GCGGATTCTCACGCAGGCGACACAAGCT），內引物對Tg3（CGACAGCCGCGGTCATTCTC）和Tg4（GCAACCAGTCAGCGTCGTCC），擴增片段大小為522 bp。

PCR反應體系為每25 μL體系中加入2×Easy Taq PCR Supper Mix 12.5 μL，上下游引物各1 μL（20 pm），模板DNA 1 μL，分別以超純水和弓形蟲RH株DNA為陰、陽性對照。

反應程序：94℃變性4 min；94℃變性20 s，58℃退火20 s，72℃延伸10 s，共30個循環；72℃延伸10 min。循環結束后取0.1 μL第一輪產物作為模板，重復如上擴增循環。

PCR產物經1%瓊脂糖電泳，將擴增的特異性條帶回收后送公司測序，與Gen Bank中的基因序列進行比對。

1.4.5巢氏PCR擴增新孢子蟲特異性DNA根據新孢子蟲Nc-5基因設計、合成兩對引物，其中外引物為Np6（CTCGCAGTCAACCTACGTCTTCT）和Np21（CCCAGTGCGTCCAATCCTGTAAC），內引物為 Np9（GTTGCTCTGCTGACGTGTCGTTG）和Np10（CTCAACACAGAACACTGAACTCTCG），擴增片段大小為224 bp。

反應程序：94℃變性5 min；94℃變性30 s，63℃退火30 s，72℃延伸30 s，共35個循環；72℃延伸10 min。循環結束后取0.1 μL第一輪產物作為模板，重復如上擴增循環。

PCR產物經1%瓊脂糖電泳鑒定，將擴增的特異性條帶回收后送公司測序，與Gen Bank中的基因序列進行比對。

2　結果

2.1貓的血清弓形蟲抗體與特異性DNA檢測

137份流浪貓和186份寵物貓血清的弓形蟲抗體經SPA-ELISA檢測，結果見表1，陽性率分別為24.1%和13.4%，經卡方統計分析表明二者差異顯著（χ2=6.07，P＜0.05）。流浪貓血液弓形蟲DNA檢出率為10.2%，寵物貓為17.2%，差異不顯著（χ2= 0.67，P＞0.05）。PCR擴增后的產物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，陽性擴增片段大小為522 bp（圖1），序列與弓形蟲RH株的序列相似性達98%。

表1　貓弓形蟲抗體與DNA檢測

對背景資料清晰的113份貓（46份寵物貓，67份流浪貓）的檢測結果分析，發現公貓血清抗體陽性率為20.0%，母貓為22.4%；DNA檢測為公貓陽性率16.4%，母貓10.3%。卡方統計分析表明不同性別的貓血清抗體及血液DNA陽性率差異均不顯著（P＞0.05）。對年齡資料清晰貓的檢測結果進行分析，顯示寵物貓弓形蟲感染率隨年齡增長呈上升趨勢，其中7歲以上的寵物貓抗體陽性率達21.7%，但各個年齡段血清抗體和DNA陽性率差異均不顯著（P＞0.05）。

圖1　貓血液弓形蟲DNA擴增產物電泳

2.2犬弓形蟲血清抗體和血液DNA檢測應用SPA-ELISA對763份寵物犬和57份鄉村犬的弓形蟲的血清抗體檢測結果見表2，其中鄉村犬血清抗體陽性率（24.6%）明顯高于寵物犬（14.5%），二者差異顯著（P＜0.05）。對其中的132份寵物犬和29份鄉村犬血液DNA的PCR擴增，二者的陽性率分別為18.2%和6.90%，差異顯著（P＜0.05）。擴增的DNA片段測序結果為529 bp，同弓形蟲SAG1基因序列相似性均達99%。

表2　犬弓形蟲抗體與DNA檢測

對背景資料清晰的132份寵物犬和29份鄉村犬進行性別與弓形蟲陽性率關系分析發現，公犬抗體陽性率為24.1%，母犬為28.2%；血液DNA檢測公犬陽性率為13.3%，母犬為19.2%。不同性別犬的弓形蟲抗體和DNA檢測陽性率差異均不顯著（P＞0.05）。

對132份年齡清晰的寵物犬分析發現，犬的抗體和基因檢測陽性率隨年齡增加呈上升趨勢，但不同年齡段的犬差異不顯著（P＞0.05）。

2.3貓新孢子蟲血清抗體和血液DNA檢測應用ICT檢測了流浪貓和寵物貓血清新孢子蟲抗體，流浪貓的抗體陽性率為7.30%，寵物貓為6.45%，見表3，卡方統計分析二者的差異不顯著（χ2=0.09，P＞0.05）。新孢子蟲特異性Nc-5基因的陽性率分別為3.65%和2.15%，也無顯著差異（χ2= 0.22，P＞0.05）。DNA擴增片段大小為224 bp左右，序列與新孢子蟲Nc1株的Nc-5基因相似性為99%。

表3　貓新孢子蟲抗體與DNA檢測

圖2

對背景資料清晰的113份貓血清（67份流浪貓和46份寵物貓）進行性別與抗體及DNA陽性率相關性分析，發現性別與新孢子蟲感染率無顯著相關性。

表4　犬的新孢子蟲血清抗體與DNA檢測

2.4犬的新孢子蟲血清抗體與血液DNA檢測對犬新孢子蟲抗體檢測結果見表4，寵物犬的陽性率為6.06%，鄉村犬為10.5%，二者差異不顯著（χ2=0.60，P＞0.05）。巢氏PCR擴增血液DNA，寵物犬和鄉村犬血液DNA陽性率分別為9.85%和6.90%，二者無顯著差異（χ2=0.02，P＞0.05）。擴增的DNA片段大小均為224 bp，與NC1株的Nc-5基因的相似性達99%。不同性別和不同年齡寵物犬的新孢子蟲抗體與DNA陽性率差異不顯著（P＞0.05）。

3　討論與分析

犬、貓的弓形蟲感染在我國北京、上海、深圳、新疆等地［4，6-8］均有報道，弓形蟲感染普遍存在，但不同地區感染率存在一定差異。Dubey等［4］檢測了廣州的34份貓血清弓形蟲抗體，陽性率高達79.4%，Zhang等［8］的報道廣州地區犬的弓形蟲抗體陽性率為33.3%。在巴西，犬和貓弓形蟲感染率高達85%以上［9-10］。新孢子蟲在世界各地的牛、犬、貓及各種野生動物新孢子蟲感染的報道，血清抗體陽性率從0%-100%不等［3］，我國對犬和貓新孢子蟲感染報道較少。

我們前期建立了SPA-ELISA可檢測多種動物的血清弓形蟲抗體，將其應用于對犬、貓血清弓形蟲抗體的檢測，流浪貓和鄉村犬血清抗體陽性率分別為24.1%和24.6%，明顯高于寵物貓（13.4%）和寵物犬（14.5%），原因可能是流浪貓和鄉村犬生活環境及食物來源混雜，食入含有弓形蟲包囊的嚙齒動物及生肉機會較多。在特立尼達和多巴哥，250只犬中流浪犬弓形蟲陽性率最高為60.5%，獵犬為30.5%，寵物犬為25.5%。在匈牙利，鄉村貓（61.3%）的感染率也明顯高于寵物貓（22.4%）和城市周邊地區貓（50%）［11］。在我國廣州地區進行的檢測也顯示，流浪犬（33.3%）和流浪貓（30.77%）弓形蟲抗體陽性率明顯高于寵物犬（17.5%）和寵物貓（17.98%）［6］。

在本次檢測中，對背景資料清晰的犬、貓血液DNA檢測，其中流浪貓和寵物貓的DNA陽性率分別為10.4%和17.4%，寵物犬和鄉村犬分別為18.2%和6.90%，不同來源的犬或貓DNA陽性率差異均不顯著（P＞0.05）。存在的問題是，抗體檢測和DNA檢測結果并不一致，主要原因應該是血液中出現可檢出蟲體DNA和血清抗體的時機并不一致，檢出抗體或蟲體特異性DNA均可判定動物感染。

對犬、貓血清新孢子蟲的檢測發現，流浪貓和寵物貓抗體陽性率分別為7.30%和6.45%，鄉村犬和寵物犬分別為10.5%和6.06%，不同來源的犬或貓抗體陽性率差異不顯著。關于犬和貓新孢子蟲的感染率，不同報道的結果差異較大，流浪犬和流浪貓新孢子蟲抗體陽性率明顯高于寵物犬和寵物貓，分析原因應該與犬貓的生活環境密切相關。

犬、貓弓形蟲和新孢子蟲感染隨年齡增長呈升高的趨勢，不同性別間也有一定差異，但犬和貓的年齡和性別對其感染率的相關性差異均不顯著。

弓形蟲和新孢子蟲的宿主范圍非常相似，本次檢測也發現犬、貓也存在著一定程度的弓形蟲和新孢子蟲共同感染。已有多篇報道兩種病原的共同感染，如Azevedo等［5］曾報道過犬新孢子蟲和弓形蟲共感染率為14%，Bresciani等［12］報道貓弓形蟲和新孢子蟲共同感染率為10.3%。

對北京地區不同來源犬、貓血清弓形蟲和新孢子蟲抗體及血液DNA的檢測，再次證明犬和貓的弓形蟲和新孢子蟲感染較為普遍，且流浪犬和貓的感染程度明顯高于寵物犬貓，提醒管理部門應該高度關注流浪動物，及時收容流浪犬和貓，防控流浪動物傳播疾病，尤其是人獸共患病的傳播。

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S829.292，S858.293

A

0529-6005（2016）09-0031-04

2015-07-10

國家重點基礎研究發展計劃（973計劃）（2015-CB150300）；國家自然科學基金（31372424，30871861）

于珊珊（1985-），女，碩士，研究方向為預防獸醫學，E-mail：yumengsha123@163.com

劉群，E-mail：qunliu@cau.edu.cn