全自動化學(xué)發(fā)光分析儀及核酸擴(kuò)增儀檢測乙肝標(biāo)志物的應(yīng)用

李林臣 張懿暉 牛艷芬 李芙琴 謝桂芳

全自動化學(xué)發(fā)光分析儀及核酸擴(kuò)增儀檢測乙肝標(biāo)志物的應(yīng)用

李林臣①張懿暉①牛艷芬①李芙琴①謝桂芳①

目的：探討全自動化學(xué)發(fā)光分析儀及核酸擴(kuò)增儀檢測乙肝標(biāo)志物的臨床應(yīng)用。方法：選擇2235例住院及門診收治的肝功能異常病例，分別用化學(xué)發(fā)光方法檢測乙肝病毒表面抗原（HBsAg），用實(shí)時熒光聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（FQ-PCR）方法檢測乙肝病毒基因（HBV-DNA）含量，并對結(jié)果進(jìn)行分析。每位患者檢測HBsAg與HBV-DNA均采用同一份標(biāo)本。結(jié)果：全部受檢標(biāo)本中，化學(xué)發(fā)光方法檢測HBsAg陽性率為61.34%，顯著高于FQ-PCR方法檢測陽性率（48.59%），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（x2=73.41，P＜0.01）。將化學(xué)發(fā)光檢測HBsAg的結(jié)果分成強(qiáng)陽性、弱陽性和陰性3組，不同組間FQ-PCR檢測HBV-DNA的陽性率顯著不同，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（x2=1863.60，P＜0.01），強(qiáng)陽性組HBV-DNA陽性率為97.31%，顯著高于弱陽性組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（x2=966.90，P＜0.01）。結(jié)論：全自動化學(xué)發(fā)光分析儀所采用的化學(xué)發(fā)光方法對篩查乙肝病毒感染效果較好，而擴(kuò)增儀所采用的FQ-PCR方法對檢測乙肝病毒復(fù)制及療效的監(jiān)測效果更好，二者聯(lián)合檢測可提高乙肝患者的檢出率并可對乙肝患者的病情及療效作出準(zhǔn)確判斷。

全自動化學(xué)發(fā)光儀；聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)；擴(kuò)增儀；乙肝表面抗原；乙型肝炎病毒脫氧核糖核酸

［First-author’s address］ The Number One Hospital Department Laboratory， the Number One Hospital of Zhangjiakou，Hebei Province， 075000， China.

乙型肝炎是由乙型肝炎病毒引起的傳染性疾病，而我國是乙型肝炎的高流行區(qū)，慢性攜帶率約為10%。目前，臨床上檢測乙型肝炎標(biāo)志物常用方法主要有酶聯(lián)免疫吸附測定法（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）、化學(xué)發(fā)光法以及熒光定量-聚合酶鏈反應(yīng)（fluorescent quantitative polymerase chain reaction，F(xiàn)Q-PCR）法［1-2］。本研究將化學(xué)發(fā)光檢測乙型肝炎表面抗原（HBsAg）FQPCR檢測乙型肝炎病毒脫氧核糖核酸（hepatitis B virus-Deoxyribonucleic acid，HBV-DNA）的結(jié)果進(jìn)行比較，分析其在乙型肝炎篩查中的作用，以期更好的指導(dǎo)臨床應(yīng)用。

1 材料與方法

1.1 臨床資料

選取2013年1月至2014年8月在張家口市第一醫(yī)院消化科住院及門診收治肝功能異常的2235例患者，其中男性1057例，女性1178例；年齡19～87歲，平均年齡為45.6歲。所有患者血清天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）＞40 U/L、谷氨酸轉(zhuǎn)氨酶（ALT）＞40 UL及r-谷氨酰轉(zhuǎn)移酶（GGT）＞50 U/L。

1.2 納入與排除標(biāo)準(zhǔn)

（1）納入標(biāo)準(zhǔn)：①無其他傳染病或者感染別的病毒的患者；②在采血前未對乙型肝炎進(jìn)行治療的患者。

（2）排除標(biāo)準(zhǔn)：患有對實(shí)驗結(jié)果具有重大影響的疾病如：嚴(yán)重腎臟疾病、嚴(yán)重免疫性疾病及嚴(yán)重的營養(yǎng)不良等疾病患者。

1.3 儀器與試劑

全自動化學(xué)發(fā)光儀CHEMCLIN 600及其原裝試劑均購自北京科美生物有限公司，LightCycler 480實(shí)時熒光定量PCR核酸擴(kuò)增儀購自羅氏公司（瑞士），乙型肝炎病毒核酸定量檢測試劑盒由凱杰生物工程有限公司（深圳）提供。

1.4 檢測方法

對患者進(jìn)行空腹采集靜脈血，并離心分離血清，使用全自動化學(xué)發(fā)光分析儀，采用化學(xué)發(fā)光方法檢測患者血清中的HBsAg。嚴(yán)格按照儀器和試劑說明書及醫(yī)院標(biāo)準(zhǔn)作業(yè)程序（SOP）文件進(jìn)行操作；血清中HBsAg≥0.5 ng/ml為陽性，其中≥30 ng/ml為強(qiáng)陽性，30 ng/ml＞HBsAg≥0.5 ng/ml為弱陽性。使用核酸擴(kuò)增儀，采用FQ-PCR法檢測患者血清中HBV-DNA含量；拷貝數(shù)＞500 copies/ml為陽性。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，采用x2檢驗對兩種方法的檢測結(jié)果進(jìn)行比較，四格表中不同組間兩兩比較采用x2分割法，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩種方法檢測結(jié)果比較

在2235例患者標(biāo)本中，采用化學(xué)發(fā)光檢測HBsAg與FQ-PCR檢測HBV-DNA的陽性率不同，化學(xué)發(fā)光的陽性率為61.34%，高于FQ-PCR檢測HBV-DNA的陽性率（48.59%），其差異有統(tǒng)計學(xué)意義（x2=73.41，P＜0.01）。

表1 2235例標(biāo)本HBsAg陽性率與HBV-DNA含量結(jié)果的比較(例)

2.2 不同HBsAg檢測結(jié)果下HBV-DNA的檢測結(jié)果分析

根據(jù)化學(xué)發(fā)光檢測HBsAg的結(jié)果，將2235例病例分成強(qiáng)陽性、弱陽性和陰性3組，不同組間FQPCR檢測HBV-DNA的陽性率不同（x2=1863.60，P＜0.01）。不同組間兩兩比較HBV-DNA的陽性率均有統(tǒng)計學(xué)意義（x2=966.90，x2=1703.94，x2=66.93；P＜0.01），強(qiáng)陽性組DNA陽性率為97.31%，顯著高于弱陽性組，見表2。

表2 不同組間HBsAg與HBV-DNA的檢測結(jié)果比較(例)

3 討論

乙型肝炎病毒具有抵抗力強(qiáng)、嗜肝性、變異性以及致癌性等特點(diǎn)，且乙型肝炎病毒對人群普遍易感，其感染后，往往呈隱性感染，轉(zhuǎn)變?yōu)槁砸倚透窝祝?］。而慢性乙型肝炎可以引起肝臟炎癥和纖維化，如不及時治療，部分患者可發(fā)展為肝硬化，失代償期肝硬化預(yù)后較差，且容易進(jìn)展為肝細(xì)胞癌［5-6］。部分乙型肝炎病毒感染也可以出現(xiàn)急性肝炎，嚴(yán)重者可以發(fā)展為爆發(fā)性肝炎甚至肝細(xì)胞癌，對人體健康造成嚴(yán)重影響［7］。HBsAg、乙型肝炎病毒表面抗體（HBsAb）、乙型肝炎病毒e抗原（HBeAg）、乙型肝炎病毒e抗體（HBeAb）以及乙型肝炎病毒核心抗體（HBcAb）作為最經(jīng)典的診斷乙型肝炎病毒感染的標(biāo)志物得到臨床的認(rèn)可和廣泛應(yīng)用［8］。而早期檢測乙肝免疫標(biāo)志物的方法常采用酶聯(lián)免疫吸附法進(jìn)行檢驗，不僅價廉迅速，而且操作簡便，能夠用于大批量篩查，但是靈敏度、特異度不是很好，且誤診率較高［9］。血清HBsAg僅標(biāo)志HBV感染，不反應(yīng)病毒復(fù)制強(qiáng)度，HBsAg陰性也不能夠完全排除HBV感染的存在，可能是由于病毒被迅速清除或表達(dá)水平低，也可能是檢測試劑的局限性（包被抗體的結(jié)合位點(diǎn)發(fā)生變異等）所致［10］。所以僅僅檢測乙型肝炎免疫標(biāo)志物已遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足臨床的需要。近年來，乙型肝炎患者血清前S1抗原檢測已被應(yīng)用于臨床，作為乙型肝炎感染診斷的輔助指標(biāo)，在降低乙型肝炎感染診斷假陰性率中表現(xiàn)出較好的效果［11］。

在臨床上用于診斷乙型肝炎感染的指標(biāo)中除了乙型肝炎免疫標(biāo)志物外，應(yīng)用最廣泛的就是用實(shí)時熒光聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)檢測HBV-DNA。HBV-DNA 主要反映患者體內(nèi)的HBV感染及復(fù)制情況，也可作為判斷乙型肝炎病毒傳染性強(qiáng)弱的金標(biāo)準(zhǔn)［12］。并且HBV-DNA定量分析在監(jiān)測抗病毒藥物療效上有重要的指導(dǎo)作用和臨床意義［13］。而長期以來，臨床一直是以HBeAg和HBVDNA定量分析來作為診斷和治療的金標(biāo)準(zhǔn)，但是約有30%的患者在HBeAg轉(zhuǎn)陰后，病毒仍在體內(nèi)復(fù)制，其中部分可以發(fā)展為肝硬化或肝癌［14-15］。

本研究用全自動化學(xué)發(fā)光分析儀所采用的化學(xué)發(fā)光方法和LightCycler480核酸擴(kuò)增儀所采用的實(shí)時熒光PCR方法對HBsAg和HBV-DNA進(jìn)行檢測，并對兩種方法的陽性率進(jìn)行比較分析。全自動化學(xué)發(fā)光分析儀所采用的化學(xué)發(fā)光技術(shù)利用化學(xué)反應(yīng)釋放的能激發(fā)中間體，使其由激發(fā)態(tài)回到基態(tài)，當(dāng)中間體從激發(fā)態(tài)回到基態(tài)時會釋放等能級光子，對光子進(jìn)行測定而進(jìn)行定量分析，具有和放射免疫分析相似的靈敏度和特異性［16］。LightCycler480核酸擴(kuò)增儀所采用的FQPCR技術(shù)是模擬病毒天然復(fù)制過程進(jìn)行檢測的一項技術(shù)，具有高特異性、高靈敏度的特點(diǎn)，而且能夠直接檢測患者體血清中的HBV-DNA含量［17］。同時還能夠區(qū)別患者是否為早期的乙型肝炎病毒感染，還是現(xiàn)癥感染及恢復(fù)期感染，也可以對乙型肝炎病毒出現(xiàn)突變株予以診斷［6］。

本研究選擇用肝功能異常（AST＞40 U/L、ALT＞40 UL、GGT＞50 U/L）作為標(biāo)本納入標(biāo)準(zhǔn)是因為肝功能指標(biāo)的增高與肝臟炎癥程度有密切關(guān)系［18］。

表1中化學(xué)發(fā)光的陽性率高于FQ-PCR，表明化學(xué)發(fā)光定量檢測HBsAg具有更高靈敏度，因此臨床研究多將其作為參考方法［19］。在表2中，根據(jù)化學(xué)發(fā)光檢測HBsAg的結(jié)果分成強(qiáng)陽性、弱陽性和陰性3組，強(qiáng)陽性組HBV-DNA陽性率顯著高于弱陽性組。本研究認(rèn)為其原因有兩種情況：①在弱陽性組中有很大部分乙型肝炎患者為非活動性HBsAg攜帶者，病毒復(fù)制處于靜止期，此類患者血清HBsAg呈陽性，而HBVDNA為陰性或低于檢測下限，因此化學(xué)發(fā)光方法檢測HBsAg因其靈敏度高且特異性好，可以有效的提高篩查陽性率減少假陰性率，所以對乙肝患者的篩查很有意義［17，20］；②在弱陽性組中由于患者體內(nèi)抗原具有滯后性，因此當(dāng)患者體內(nèi)的HBV-DNA消失后一段時間內(nèi)，其抗原成份HBsAg還存在而被檢查出來，導(dǎo)致陽性率降低。在表2的HBsAg陰性組中有HBV-DNA陽性患者，表明檢測HBV-DNA來診斷乙型肝炎病毒感染的窗口期要比檢測HBsAg診斷乙型肝炎病毒感染的窗口期短。而且用FQ-PCR方法檢測HBV-DNA含量，對其乙型肝炎病情監(jiān)測、療效評估更有意義，兩種方法各有優(yōu)勢。故二者聯(lián)合檢測不但可以在篩查乙型肝炎患者中有效的提高陽性率并且縮短窗口期，而且在臨床上可以及早作出診斷并對患者病情及治療情況作出準(zhǔn)確判斷評估。

4 結(jié)語

在臨床上，使用全自動化學(xué)發(fā)光分析儀與實(shí)時熒光定量PCR核酸擴(kuò)增儀聯(lián)合檢測乙型肝炎標(biāo)志物，既可提高乙型肝炎患者的檢出率縮短窗口期，又可以對乙型肝炎患者的病情及療效進(jìn)行準(zhǔn)確判斷及評估。

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Comparison of Chemiluminescence immunoassay and real-time PCR of in HBV markers detection

LI Lin-chen， ZHANG Yi-hui， NIU Yan-fen， et al// China Medical Equipment，2016，13（4）：41-44.

Objective： To investigate the clinical applications of chemiluminescence immunoassay and real-time PCR in HBV markers. Methods： We select 2235 inpatients and outpatients of GI Medicine in our hospital from 2013 to 2014. Detect surface antigen of hepatitis B virus （HBsAg） and Hepatitis B virus gene （HBV-DNA） of every sample by chemiluminescence immunoassay and real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction（FQ-PCR），respectively. And analyze the results. The same specimen was used to detect the surface antigen of hepatitis B virus and HBV-DNA in each patient. Results： In 2235 case， the positive rate of chemiluminescence immunoassay detecting HBsAg was 61.34%， which was higher than the positive rate of FQ-PCR（48.59%， x2=73.41， P＜0.01）. Grouping the results of chemiluminescence immunoassay into strong positive， weak positive and negative. There were statistical difference（x2=1863.60， P＜0.01） among the positive rate of FQ-PCR detecting HBV-DNA. The statistical difference（x2=966.90，P＜0.01） of HBV-DNA’s positive rate was found between strong positive group （97.31%） and weak positive group （15.41%）. Conclusion： It is better to screen HBV infected persons by chemiluminescence immunoassay， while it is better to detect the replication of hepatitis B virus and the efficacy by FQ-PCR. Combined utilization can improve the detection rate and make accurate judgments of the condition of patients and treatment effects.

Fully automatic chemiluminescence analyzer； Real-time fluorescence quantitative PCR； HBsAg； Hepatitis B virus-Deoxyribonucleic acid

10.3969/J.ISSN.1672-8270.2016.04.013

1672-8270（2016）04-0041-04

R197.39

A

2015-07-03

①張家口市第一醫(yī)院檢驗科 河北 張家口 075000

李林臣，男，（1981- ），本科學(xué)歷，主管技師。張家口市第一醫(yī)院檢驗科，研究方向：乙型肝炎的免疫學(xué)診斷。