槐角染料木素對哮喘小鼠的治療作用和機制

李 惠 盧洪梅 鄒立華 陳小丹

1.廣東省深圳市龍崗區人民醫院內科，廣東深圳518172；2.廣東醫學院第二臨床醫學院中醫學教研室，廣東東莞523808；3.廣東省深圳市龍崗區人民醫院中西醫結合科，廣東深圳518172

槐角染料木素對哮喘小鼠的治療作用和機制

李 惠1盧洪梅2鄒立華3陳小丹1

1.廣東省深圳市龍崗區人民醫院內科，廣東深圳518172；2.廣東醫學院第二臨床醫學院中醫學教研室，廣東東莞523808；3.廣東省深圳市龍崗區人民醫院中西醫結合科，廣東深圳518172

目的探討槐角染料木素對哮喘小鼠白介素-5（IL-5）、白介素-13（IL-13）含量的影響。方法32只BALB/c雌性小鼠隨機分為對照組（n=10）、模型組（n=11）和干預組（n=11）。模型組和干預組采用卵清蛋白（ovalbumin，OVA）腹腔注射致敏和霧化吸入激發，建立哮喘小鼠模型。干預組于激發前腹腔注射染料木素30 mg/kg。觀察小鼠哮喘癥狀的發生情況，檢測小鼠血清OVA特異性IgE水平。檢測肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid，BALF）中嗜酸性粒細胞（eosinophil，EOS）計數及其分類比值和細胞因子IL-5、IL-13含量。結果與模型組相比，干預組小鼠哮喘癥狀出現較遲，且癥狀較輕微。與對照組相比，模型組BALF中EOS計數及分類比值、IL-5和IL-13的含量及血清中OVA特異性IgE水平均明顯增加（均P＜0.01）。與模型組相比，干預組BALF中EOS計數及分類比值、IL-5和IL-13的含量及血清中OVA特異性IgE水平均明顯降低（均P＜0.01）。結論染料木素可緩解小鼠哮喘癥狀，可能與其降低哮喘小鼠IgE水平，降低IL-5及IL-13的含量，從而減輕氣道炎癥有關。

染料木素；哮喘；小鼠；白介素-5；白介素-13

支氣管哮喘（簡稱“哮喘”）是一種全球性多發病、常見病，各國患病率不等，其發病機制十分復雜，氣道慢性炎癥被認為是哮喘的本質［1］。Th1/Th2細胞亞群功能失衡及T細胞所分泌的細胞因子IL-4、IL-5、IL-13、IL-17、IL-21等功能紊亂是哮喘發病的重要基礎［2-5］。染料木素也稱染料木黃酮、金雀異黃酮，為特異性蛋白酪氨酸激酶（protein tyrosine kinase，PTK）抑制劑，在生物體內具有抗腫瘤、抗氧化、拮抗雌激素等生物學活性［6-7］。目前染料木素對呼吸系統疾病影響的研究主要集中在肺癌、肺纖維化及肺動脈高壓防治方面，而對哮喘防治的研究較少［8-10］。本研究旨在通過復制哮喘小鼠模型，觀察IL-5和IL-13在哮喘發生發展過程中的變化，并探討槐角染料木素對哮喘小鼠IL-5、IL-13的調控作用，初步了解染料木素控制哮喘的作用機制，為染料木素治療哮喘提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 主要儀器

JJ200電子秤，YLS-8A多功能誘咳引喘儀，Sysmex-XT 2000i全血細胞分析儀，Luminex200液相芯片分析系統，美國Bio-TEK ELx 508自動洗板機，美國Model 680伯樂酶標儀。

1.2 主要試劑

染料木素（大連美侖生物技術有限公司），卵清清蛋白OVA（Sigma，SLBB4340V），白細胞分類染液（Sysmex，A5005），血紅蛋白溶血素（Sysmex，A5005），嗜堿細胞溶血素（Sysmex，R5036），白細胞溶血素（Sysmex，R5019），PK-30L CELLPACK稀釋液（Sysmex，G5248），Mouse IL-5 simplex（eBioscience，117633009），Mouse IL-13 simplex（eBioscience，115826007），抗-OVA IgE試劑盒（eBioscience，102715）。

1.3 實驗動物及飼養

6～8周SPF級BALB/c雌性小鼠32只，購自廣東省醫學實驗動物中心，質量合格證：No.44007200022603。按照廣東省動物實驗監測所嚙齒類接收、適應及檢疫操作規程（VET-003）和實驗動物飼料、墊料和飲水的質量控制操作規程（LA-ADM006，LA-ADM007，LA-ADM008）操作。動物飼養于屏障動物實驗室，實驗動物使用許可證編號：SYXK（粵）2012-0122，IACUC審批編號：2015015。每日室溫控制為20～26℃，濕度控制為40%～70%。SPF級鼠飼料購自北京科澳協力飼料有限公司，飲用消毒純水，每日足量供給。

1.4 實驗方法

1.4.1 動物分組32只小鼠隨機分為對照組（10只）、哮喘模型組（簡稱“模型組”，11只）及染料木素給藥干預組（簡稱“干預組”，11只）。

1.4.2 動物致敏模型組和干預組分別于第1、15天致敏，每次每只小鼠腹腔注射致敏液0.2 mL（OVA溶液的配制：OVA 10 mg加生理鹽水10 mL，氫氧化鋁40 mg加生理鹽水10 mL，兩者等體積混勻，0.22 μm濾器過濾）。對照組于相同時間腹腔注射等量生理鹽水。

1.4.3 動物激發模型組和干預組小鼠于實驗第22天起，每日霧化吸入5%OVA激發液，每次30 min，連續14 d。干預組并于每次霧化前30 min給予腹腔內注射染料木素30 mg/kg。對照組于相同時間霧化吸入等量生理鹽水。

1.5 觀察指標

1.5.1 哮喘癥狀觀察觀察各組小鼠每次激發后癥狀及體征變化，如精神狀態、呼吸頻率、大小便失禁及抽搐等情況。并參照王力寧等［11］的方法，對小鼠哮喘癥狀進行評分，分值越高表示哮喘癥狀越重。見表1。

表1 哮喘癥狀計分

1.5.2 血清中Anti-OVA IgE水平檢測小鼠摘眼球取血200 μL，離心后取血清，用ELISA法檢測Anti-OVA IgE水平，操作嚴格按說明書進行。

1.5.3 支氣管肺泡灌洗液中嗜酸性粒細胞計數及其分類比值分析和IL-5、IL-13含量檢測小鼠處死后，行氣管插管，在右主支氣管處結扎右肺，用0.3 mL冰PBS分3次灌洗左肺并回收支氣管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid，BALF），采用Sysmex-XT2000i全血細胞分析儀分析BALF中嗜酸性粒細胞（eosinophil，EOS）計數及其分類比值，Luminex200檢測BALF中IL-5、IL-13的含量。

1.6 統計學方法

采用SPSS 13.0統計學軟件進行數據分析，計量資料數據用均數±標準差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK-Q檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 哮喘癥狀觀察

對照組小鼠整個激發過程呼吸平順，活動正常，無大小便失禁及煩躁不安現象。模型組小鼠在激發第5天起，出現呼吸深快、鼻翼煽動、煩躁不安、大小便失禁現象。干預組小鼠在激發第7天出現呼吸深快、煩躁不安現象，但癥狀較模型組相對較輕，未出現大小便失禁現象。三組小鼠均未出現抽搐現象。三組小鼠哮喘癥狀評分比較，差異有高度統計學意義（P＜0.01）；與對照組比較，模型組及干預組小數哮喘癥狀評分均升高（P＜0.01），干預組評分低于模型組（P＜0.01）。見表2。

表2 三組小鼠激發過程中哮喘癥狀評分比較（分，±s）

表2 三組小鼠激發過程中哮喘癥狀評分比較（分，±s）

注：與對照組比較，**P＜0.01；與模型組比較，##P＜0.01

組別只數激發7 d后激發14 d后對照組模型組干預組F值P值10 11 11 0.80±0.63 6.00±1.52**4.55±0.93**##66.909 0.000 0.90±0.74 6.27±1.53**3.73±0.85**##86.784 0.000

2.2 三組小鼠BALF中EOS計數及分類比值比較

三組小鼠BALF中EOS計數及分類比值比較，差異有高度統計學意義（P＜0.01）；與對照組相比，模型組和干預組小鼠BALF中EOS計數及分類比值均明顯升高，差異有高度統計學意義（均P＜0.01）；與模型組相比，干預組小鼠BALF中EOS計數及分類比值均明顯降低，差異有高度統計學意義（均P＜0.01）。見表3。

表3 三組小鼠BALF中EOS計數及分類比值比較（±s）

表3 三組小鼠BALF中EOS計數及分類比值比較（±s）

注：與對照組比較，**P＜0.01；與模型組比較，##P＜0.01；EOS：嗜酸性粒細胞

組別只數EOS計數（×109/mL）EOS分類比值（%）對照組模型組干預組F值P值10 11 11 0.014±0.008 0.409±0.096**0.165±0.042**##111.112 0.000 0.005±0.004 14.428±2.589**4.319±2.166**##148.336 0.000

2.3 三組小鼠血清中Anti-OVA IgE水平比較

三組小鼠血清中Anti-OVA IgE水平比較，差異有高度統計學意義（P＜0.01）；對照組血清中Anti-OVA IgE水平最低，干預組次之，分別為（14.161±2.266）ng/mL和（128.414±45.608）ng/mL，模型組小鼠血清中Anti-OVA IgE水平為（315.225±71.167）ng/mL，顯著高于對照組和干預組，差異有高度統計學意義（P＜0.01）；而干預組血清中IgE水平亦顯著高于對照組（P＜0.01）。

2.4 三組小鼠BALF中IL-5、IL-13含量比較

三組小鼠BALF中IL-5、IL-13含量比較，差異有高度統計學意義（P＜0.01）；模型組和干預組BALF中IL-5及IL-13含量均較對照組升高，差異有高度統計學意義（均P＜0.01）；干預組BALF中IL-5及IL-13含量均較模型組降低，差異有高度統計學意義（均P＜0.01）。見表4。

3 討論

Th1/Th2細胞功能失調、Th2活化與細胞因子分泌亢進是哮喘發生發展的重要基礎［12］。細胞因子是炎癥細胞釋放的肽類炎性介質，有調控細胞的生長、增殖和分化功能，其中，白細胞介素（interleukin，IL）是重要的一類細胞因子［13］。IL-5是由Azuma等于1986年克隆成功的一種具有多種生物學功能的淋巴因子。IL-5由Th2細胞產生，是一種含有N-乙酰氨基半乳糖殘基的弱酸性糖蛋白，分子量為12 300，呈完全疏水性。IL-5可調節嗜酸粒細胞的分化、增殖、啟動及活化，并影響其黏附力及細胞受體的表達，對趨化作用及介質的合成也有輔助作用［14］。研究發現，哮喘患者發作期靜脈血IL-5水平明顯高于對照組及穩定期患者，且與血管內皮生長因子、堿性成纖維細胞生長因子及轉化生長因子β1水平呈正相關，推測IL-5水平的升高參與細胞外基質的產生，促使炎癥細胞浸潤，使氣道纖維化及氣道重構進程加劇，在哮喘的呼吸道炎癥及呼吸道重塑中起重要作用［15］。IL-13是近年來新克隆的Th2型細胞因子，可通過募集、歸巢、激活炎性細胞介導EOS的聚集，而在哮喘的發生中起重要作用。IL-13還可不依賴于其他Th2型細胞因子及嗜酸粒細胞IgE介導的途徑而單獨誘發哮喘的所有癥狀，是哮喘病理發生中的關鍵細胞因子。IL-13也可增加支氣管的高反應性，促進支氣管上皮細胞成熟和黏液分泌及細胞外基質的合成，并增強呼吸道平滑肌細胞的收縮力，參與呼吸道炎癥與呼吸道重塑過程［16-17］。程靜等［18］通過對IL-4、IL-12、IL-13在哮喘小鼠模型致敏和激發不同時期濃度變化中發現，哮喘小鼠BALF中IL-13水平從致敏第5天開始顯著增高，隨著過敏原繼續刺激而呈現不斷升高趨勢，并伴隨炎癥細胞在肺部浸潤增多，最終導致哮喘的一系列氣道病變。

本研究發現，與模型組小鼠相比，給予染料木素的干預組小鼠哮喘癥狀出現較遲，且癥狀較輕微。與對照組小鼠相比，模型組小鼠BALF中EOS計數及分類比值明顯增加（均P＜0.01），IL-5、IL-13的含量也明顯增加（均P＜0.01），血清中OVA特異性IgE水平明顯升高（P＜0.01）；染料木素可顯著降低哮喘小鼠BALF中EOS計數及分類比值（P＜0.01）和IL-5、IL-13含量（P＜0.01），并明顯降低血清中OVA特異性IgE水平（P＜0.01）。

表4 三組小鼠BALF中IL-5、IL-13含量比較（pg/mL，±s）

表4 三組小鼠BALF中IL-5、IL-13含量比較（pg/mL，±s）

注：與對照組比較，**P＜0.01；與模型組比較，##P＜0.01；IL-5：白介素-5；IL-13：白介素-13

組別只數IL-5IL-13對照組模型組干預組F值P值10 11 11 2.27±0.77 14.54±4.49**7.85±5.04**##29.567 0.000 4.20±1.63 35.19±17.26**19.70±5.96**##21.750 0.000

槐角又稱槐實，為豆科植物槐（SophorajaponicaL.）的果實，有涼血止血、清肝明目的作用。槐角含有多種化學成分，主要為黃酮類化合物，還有三砧皂昔、生物堿、磷脂、氨基酸以及多糖等。槐角染料木素是從槐角中分到的異黃酮，可抑制細胞外調節蛋白激酶（extracellular regulated protein kinases，ERK）1/2的磷酸化，抑制肥大細胞的活化，減輕過敏性炎性反應［19］。在食物中增加染料木素可以減輕哮喘患者的癥狀，提高一秒用力呼氣容積，改善患者肺功能，減少哮喘控制不良事件的發生［20］。推測染料木素產品很可能能抑制哮喘的發生和發展，具有樂觀的臨床開發前景。

綜上所述，染料木素可緩解小鼠哮喘癥狀，可能與其降低哮喘小鼠IgE水平，降低IL-5及IL-13的含量，減輕氣道炎癥有關，但其具體的機制有待進一步深入研究。

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Therapeutic effect and mechanism of genistein of fructus sophorae on mice with asthma

LI Hui1LU Hongmei2ZOU Lihua3CHEN Xiaodan1
1.Department of Internal Medicine，Longgang People＇s Hospital of Shenzhen，Guangdong Province，Shenzhen518172，China；2.Department of Traditional Chinese Medicine，the Second Clinical Medical School，Guangdong Medical College，Guangdong Province，Dongguan523808，China；3.Department of Integrated Traditional and Western Medicine，Longgang People＇s Hospital of Shenzhen，Guangdong Province，Shenzhen518172，China

Objective To investigate the effect of genistein of fructus sophorae on the contents of interleukin-5（IL-5）and interleukin-13（IL-13）in mice with asthma.Methods 32 BALB/c female mice were divided into the control group（n=10），model group（n=11）and intervention group（n=11）randomly.Model group and intervention group were sensitized by intraperitoneal injection with ovalbumin（OVA）and excited by aerosol inhalation with OVA.The intervention group was given intraperitoneal injection with 30 mg/kg genistein before excitation.The asthma symptoms of mice were observed.The serum levels of anti-OVA IgE，the counts and classification ratios of eosinophils（EOS），the contents of IL-5 and IL-13 in bronchoalveolar lavage fluid（BALF）were detected.Results Compared with the model group，the asthma symptoms of the intervention group were appeared late and mildly.Compared with the control group，the counts and classification ratios of EOS，the contents of IL-5 and IL-13 in BALF，the serum levels of anti-OVA IgE in the model group were significantly increased（all P＜0.01）.Compared with the model group，the counts and classification ratios of EOS，the contents of IL-5 and IL-13 in BALF，the serum levels of anti-OVA IgE in the intervention group were reduced significantly（all P＜0.01）.Conclusion Genistein can relieve the symptoms of asthma，may concern with it＇s reduction the levels of IgE，the contents of IL-5 and IL-13，and inhibition airway inflammation.

Genistein；Asthma；Mice；Interleukin-5；Interleukin-13

R562.25

A

1673-7210（2016）07（b）-0012-04

2016-04-12本文編輯：程銘）

廣東省深圳市科技研發資金知識創新計劃項目（JCYJ20140414123607244）；廣東省深圳市龍崗區科技計劃扶持項目（PT2015092）。

李惠（1979.10-），女，碩士研究生，副主任醫師；研究方向：內科疾病的防治。