子宮內膜不典型增生患者內膜組織中錯配修復蛋白的表達情況

劉彩虹 陳志強

1.河北省承德市婦幼保健院病理科，河北承德067000，2.河北省承德市中心醫院泌尿外科，河北承德067000

子宮內膜不典型增生患者內膜組織中錯配修復蛋白的表達情況

劉彩虹1陳志強2

1.河北省承德市婦幼保健院病理科，河北承德067000，2.河北省承德市中心醫院泌尿外科，河北承德067000

目的探討子宮內膜不典型增生患者子宮內膜組織中錯配修復（MMR）蛋白的表達情況及微衛星序列的不穩定性（MSI）。方法選取承德市中心醫院2005年10月～2015年6月存檔的200例患者的子宮內膜增生組織為研究對象，按增生類型分為單純性增生組（n=50）、復雜性增生組（n=50）、單純性非典型增生組（n=50）及復雜性非典型增生組（n=50）四組，采用免疫組織化學法檢測四組內膜組織中MMR蛋白（MLH1、MSH2、PMS2、MSH6）的表達情況，比較四組的MMR失表達率，觀察非典型增生患者的MSI［低度微衛星不穩定（MSI-L）、高度微衛星不穩定（MSI-H）］和MSS表型與年齡的關系。結果復雜性非典型增生組的MLH1、MSH2、PMS2及MSH6的失表達率高于其他三組，且單純性非典型增生組、復雜性增生組、單純性增生組的MMR失表達率逐漸降低，四組患者的MLH1、MSH2、PMS2失表達率比較，差異均有統計學意義（P＜0.05），但四組MSH6失表達率比較差異無統計學意義（P＞0.05）；MSI-H、MSI-L和MSS表型在單純性增生組、復雜性增生組、單純性非典型增生組及復雜性非典型增生組中的表型比較，差異均有統計學意義（P＜0.05）；在單純性非典型增生組和復雜性非典型增生組中，MSI-H、MSI-L及MSS表型在年齡≤50歲和＞50歲患者間的差異均有統計學意義（P＜0.05）。結論MMR蛋白的失表達及微衛星不穩定性可能是子宮內膜不典型增生患者的重要分子事件。

子宮內膜不典型增生；錯配修復蛋白；微衛星不穩定性；免疫組織化學

子宮內膜增生（Endometsial hyperplasia，EH）是婦女的常見病、多發病。其中子宮內膜不典型增生是子宮內膜癌的一種癌前病變［1］，子宮內膜癌的發病通常經歷復雜型增生、不典型增生到癌的發展過程。DNA錯配修復（Mismatch repair，MMR）系統由一系列酶分子組成，主要包括MLH1、MSH2、PMS2和MSH6等，能夠特異性識別并糾正DNA復制時出現的錯配堿基，對避免基因變異，保持基因在人體細胞中的穩定性和完整性具有極為關鍵的作用［2］。若MMR基因功能出現缺陷，細胞的修復錯配功能下降則會導致遺傳信息傳遞錯誤從而引發腫瘤［3］。有研究表明［4］，微衛星序列不穩定性（Micro satellite instability，MSI）作為一種腫瘤形成機制，是MMR出現缺陷的細胞因糾正錯誤堿基的能力下降從而引起的復制錯誤。目前，國內外關于子宮內膜非典型增生患者中MMR蛋白的表達變化的研究甚少。本研究探討了子宮內膜不典型增生患者中MMR蛋白的表達情況，明確MSI的存在與否，旨在提高對子宮內膜增生的認識和防治，為子宮內膜非典型增生和子宮內膜樣型子宮內膜癌的預防和早期診斷提供有效途徑，現報道如下：

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取承德市中心醫院2005年10月～2015年6月存檔的子宮內膜增生患者的病理切片，由兩位資深病理醫師復審，嚴格按照WHO診斷標準，選取200例符合條件者進入研究。按增生類型分為單純性增生組（n=50）、復雜性增生組（n=50）、單純性非典型增生組（n=50）及復雜性非典型增生組（n=50）四組，其中單純性增生組年齡26～72歲，平均（42.2±1.4）歲；復雜性增生組年齡24～73歲，平均（43.5±1.2）歲；單純性非典型增生組年齡28～72歲，平均（45.5±1.6）歲；復雜性非典型增生組年齡29～74歲，平均（46.2±2.1）歲。四組患者年齡比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。

1.2 子宮內膜增生類型診斷標準

①單純性增生：腺體數目增多，輕度擁擠，但未達到背靠背擁擠的程度；腺體大小不一，部分腺腔擴張，形成不小不等的囊性變；無細胞的非典型改變。②復雜性增生：增生腺體外形不規則，腺體密集、擁擠、背靠背，結構明顯復雜，無細胞的非典型改變。③單純性非典型增生：單純性增生的病變伴有細胞的非典型性。④復雜性非典型增生：復雜擁擠的腺體伴有細胞的非典型性。

1.3 檢測方法

采用免疫組化En Vision法對MMR蛋白MLH1、MSH2、PMS2和MSH6的表達進行檢測。試劑包括：單克隆鼠源性抗體MSH6（1∶200）、MSH2（1∶100）、PMS2（1∶40）、MLH1（1∶80）、EnVision免疫組化二步法試劑盒及二氨基聯苯胺（DAB）顯色劑，均購自北京中杉橋生物公司。方法：把選取的石蠟標本切成厚4 μm的連續切片，常規脫蠟、水化后，采用煮沸熱修復法修復抗原，將pH 6.0的濃度為0.01 mol/L的枸緣酸鈉緩沖溶液在水浴鍋中加熱至95℃左右，放入切片加熱10 min后用0.01 mol/L的磷酸鹽緩沖液沖洗切片，放入3% H2O2溶液10 min。洗滌后加入一抗，37℃下孵育60 min，再用0.01 mol/L的磷酸鹽緩沖液沖洗后加入二抗，37℃下孵育40 min，洗滌后DAB控制顯色。沖洗、蘇木精復染、脫水、封片。陽性對照采用已知的陽性片，陰性對照采用磷酸鹽緩沖液代替一抗。

1.4 觀察指標

觀察指標包括MMR蛋白MLH1、MSH2、PMS2和MSH6的表達情況及微衛星序列的不穩定性。其中MMR蛋白正常表達在細胞質和細胞核均可著色。每個切片均于400倍鏡下選擇10個視野，統計陽性細胞數，陽性細胞數小于10%為陰性標本，大于或等于10%為陽性標本。陽性細胞判斷標準：細胞質和細胞核均出現棕黃色顆粒，病變區域細胞核和細胞質均無著色為陰性。MSI結果判定標準：微衛星穩定（MSS）：4個MMR蛋白均為陽性；低度微衛星不穩定（MSI-L）：只有1個MMR蛋白表達缺失；高度微衛星不穩定（MSI-H）：MMR系中出現2個或3個MMR蛋白表達缺失。

1.5 統計學方法

采用SPSS 19.0統計學軟件進行數據分析，計量資料數據用均數±標準差（±s）表示，兩組間比較采用t檢驗；計數資料用率表示，組間比較采用χ2檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 四組MMR系MLH1、MSH2、PMS2和MSH6蛋白表達情況比較

復雜性非典型增生組患者的MLH1、MSH2、PMS2失表達率明顯高于其他三組，且四組患者的MLH1、MSH2、PMS2失表達率比較，差異均有統計學意義（P＜0.05），但四組MSH6失表達率比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。見表1。

表1 四組MMR系蛋白MLH1、MSH2、PMS2和MSH6失表達率比較［n（%）］

2.2四組MSI（MSI-L、MSI-H）和MSS表型比較

MSI-H、MSI-L和MSS在單純性增生組、復雜性增生組、單純性非典型增生組及復雜性非典型增生組中的表型分布比較，差異均有統計學意義（P＜0.05）。見表2。

表2 四組MSI（MSI-L、MSI-H）和MSS表型比較［n（%）］

表3 非典型增生患者的MSI和MSS表型與年齡的關系［n（%）］

2.3 非典型增生患者的MSI（MSI-L、MSI-H）和MSS表型與年齡的關系

在單純性非典型增生組和復雜性非典型增生組中，年齡≤50的患者的MSI-H及MSS表型明顯高于年齡＞50歲患者，MSI-L表現明顯低于年齡＞50歲患者，差異均有統計學意義（P＜0.05）。見表3。

3 討論

MMR系統最早發現于大腸桿菌中，是人體細胞控制基因變異、維持基因穩定的重要基因。MMR系蛋白能夠特異性地識別并糾正DNA堿基的錯誤配對，減少基因的自發性突變，維持遺傳穩定性和完整性。MSH6和MSH2蛋白在DNA復制過程中結合形成一種雜合的蛋白質二聚體復合物（MutS-a），其進入到DNA堿基錯配區域，與二聚體MutL-a（由MLH1和 PMS2形成，能夠識別新生DNA鏈中的錯誤配對堿基）結合，MutL-a和MutS-a結合到錯配位點后，修復反應則立即啟動［5］。在連接酶、聚合酶、內切酶、及DNA解旋酶的作用下，堿基錯配區域的DNA片段被切除且重新合成并鏈接正確的DNA序列，從而產生修復錯配堿基的作用。由于子宮內膜細胞的DNA復制頻繁，有著較高的堿基錯配率，因此MMR基因的突變率也較高［6］。MMR基因突變會導致機體中MMR系統的修復功能障礙，MMR系蛋白失表達，無法修復細胞在DNA復制過程中的缺失與錯誤摻入，出現“滑鏈錯配”、復制錯誤、染色體交換不均等現象，從而導致微衛星DNA長度改變，發生MSI，正常細胞的增殖調控受到影響，出現廣泛的腫瘤易感，同時快速積累某些抑癌基因及癌基因中的突變，進而引發腫瘤形成［7-9］。

MSI是在子宮內膜樣腺癌患者中發生的分子事件，近年來，其作為腫瘤患者早期診斷、病情發展及預后評價的重要手段已成為學者們的研究熱點。MSI作為一種腫瘤形成機制，是繼抑癌基因和癌基因之后的又一重大進展［4］。相關研究發現，功能蛋白的缺陷及MMR基因的突變多出現在MSI表型的腫瘤患者細胞中，MMR基因產生修復功能障礙，從而無法修復在DNA復制過程中出現的堿基缺失或錯配，表現出MSI-H［10-11］。目前，有關MSI的檢測已作為鑒別MMR基因突變腫瘤的重要方法。受到多種刺激因素的作用，子宮內膜發生增生活躍現象，細胞中的DNA頻繁復制，從而增加了堿基的錯配率，MMR基因突變繼而引發蛋白缺陷，發生MSI。有研究指出，癌癥腫瘤中MSI-H表型的預后及生物學行為顯著不同于MSI-L及MSS表型的腫瘤［12-13］。目前，研究普遍認為子宮內膜癌的發病通常經歷子宮內膜復雜型增生到不典型增生再到癌的發展過程。若不進行治療，則有20%～52%的子宮內膜不典型增生患者可能發展為子宮內膜癌［1］。

有研究發現，合并MLH1突變的PTEN突變子宮內膜不典型增生小鼠在短期內就會發生癌變，表明MLH1的突變促進了子宮內膜癌的形成［14］。本研究比較了四組患者的MLH1、MSH2、PMS2及MSH6蛋白的失表達率，結果顯示，復雜性非典型增生組患者的MLH1、MSH2、PMS2的失表達率分別為20.0%、24.0%和16.0%，明顯高于其他三組，MLH1、MSH2、PMS2的失表達率在單純性增生組、復雜性增生組、單純性不典型增生組及復雜性不典型增生組中逐漸升高，且差異均有統計學意義（P＜0.05），但四組MSH6的表達差異無統計學意義（P＞0.05）。說明隨著病變發展，MMR蛋白的修復功能逐漸喪失。在正常的子宮內膜中，MMR蛋能夠糾正堿基錯配，而在不典型增生組織的細胞中，MMR蛋白有不同程度的失表達，說明子宮內膜出現增生異常時，細胞的MMR功能會降低甚至喪失，從而提高腫瘤發生的可能性［15］。

Sherman等［16］研究指出，子宮內膜樣腺癌和子宮內膜不典型增生的分子生物學改變十分相似，28%的不典型增生和子宮內膜樣腺癌會出現MSI。Taina等［17］分析不同子宮內膜組織中的MSI表型，結果指出對于子宮內膜復雜性增生，其作為癌前病變伴或不伴非典型增生同樣重要。本研究中，從正單純性增生、復雜性增生、單純性非典型增生到復雜性非典型增生，其MSI表型的比率逐漸上升，差異有統計學意義（P＜0.05）。其中復雜性不典型增生組中的MSI-H、MSI-L表型分別占18.0%和24.0%，單純性不典型增生組中分別占12.0%和20.0%。說明MSI不僅僅是發生在子宮內膜癌中的分子事件，可能在癌前病變中已經存在。相關研究表明，子宮內膜非典型增生與子宮內膜癌屬同一譜系，MSI表型的子宮內膜非典型增生更可能發展為癌［18］。

發病年齡是臨床腫瘤研究中的一個重要方面，通過在高危發病年齡人群中選出MMR基因突變患者，有利于腫瘤的早期診斷及預防。研究指出，子宮內膜非典型增生患者多處于圍絕經期，平均年齡為（50± 11）歲，本研究中單純性非典型增生患者的平均年齡為（45.5±1.6）歲，復雜性非典型增生組的平均年齡為（46.2±2.1）歲。本研究進一步探討了非典型增生患者的MSI（MSI-L、MSI-H）和MSS表型與年齡的關系，結果顯示無論在單純性非典型增生組還是在復雜性非典型增生組中，MSS和MSI-H表型在年齡≤50歲的患者中所占比例明顯高于年齡＞50歲的患者，而MSI-L表型在年齡＞50歲患者中所占比例顯著高于≤50歲患者，差異均有統計學意義（P＜0.05）。目前，MSI-H表型被視為一個獨立群體，在低分化腫瘤中有著較高的比例。本研究結果提示，患者的年齡與非典型增生中MSI-H表型存在相關性。但由于目前醫學上對MSI-L的定義尚未明確，其在病變中所占比例及特點尚未清楚，有待進一步研究探討。

綜上所述，MMR蛋白的失表達及MSI是在子宮內膜非典型增生病變中就已發生的分子事件，檢測高危人群MMR蛋白的失表達，確定MSI存在與否對病變的早期預防及診斷具有重要意義。

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Expression of mismatch repair protein in endometrial hyperplasia tissues of patients with atypical hyperplasia of endometrium

LIU Caihong1CHEN Zhiqiang2
1.Department of Pathology，Maternity and Child Care Centers of Chengde City，Hebei Province，Chengde067000，China；2.Department of Urology，Central Hospital of Chengde City，Hebei Province，Chengde067000，China

Objective To explore the expression of mismatch repair（MMR）gene proteins and microsatellite instability（MSI）in atypical endometrial hyperplasia.Methods 200 endometrial hyperplasia tissues from October 2005 to June 2015 in the Central Hospital of Chengde City were selected，and they were divided into the simple hyperplasia group（50 cases），complexity hyperplasia group（50 cases），simple atypical hyperplasia group（50 cases）and complexity atypical hyperplasia group（50 cases）according to hyperplasia type.Immunohistochemical method was used to detect the expressions of DNA mismatch repair proteins（MLH1，MSH2，PMS2 and MSH6）in four groups；the non-expression rate of MMR were compared between four groups；the relationships between MSI（MSI-L，MSI-H）and age of atypical hyperplasia group was also observed.Results The non-expression rate of MLH 1，MSH2，PMS2 and MSH6 were the highest in the complexity atypical hyperplasia group，and non-expression rate of MLH1，MSH2，PMS2 in the simple atypical hyperplasia group，complexity hyperplasia group and simple hyperplasia group were decreased progressively，the differences were statistically significant（P＜0.05）；while there was no statistically significant difference in the non-expression rate of MSH6 in the four groups（P＞0.05）.There were statistically significant differences in phenotypes of MSIH，MSI-L and MSS in the four groups（P＜0.05）.There were statistical significance in the expression of MSI-H，MSIL and MSS between patients who age≤50 years and＞50 years in the atypical hyperplasia group（P＜0.05）.Conclusion MSI and the negative expression of MMR proteins may be one of the important molecular events of patients with atypical endometrial hyperplasia.

Atypical endometrial hyperplasia；Mismatch repair gene；Microsatellite instability；Immunohistochemistry

R735.2

A

1673-7210（2016）07（b）-0080-04

2016-04-02本文編輯：任念）

河北省醫學科學研究重點課題計劃項目（2016 0289）。