MICA基因多態(tài)性與結(jié)直腸癌的易感關(guān)聯(lián)性研究

陳 恩，鄒學(xué)森，聶德魁，王春陽，呂賽平，陳 慧，陳純靜，林 琳

（1、江西省腫瘤醫(yī)院檢驗科，江西南昌330029；2、豐城市婦幼保健計劃生育服務(wù)中心，江西豐城331100；3、中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)系，湖南長沙410008；4、廈門醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)部，福建廈門361008）

MICA基因多態(tài)性與結(jié)直腸癌的易感關(guān)聯(lián)性研究

陳 恩1，鄒學(xué)森1，聶德魁2，王春陽1，呂賽平1，陳 慧1，陳純靜3，林 琳4

（1、江西省腫瘤醫(yī)院檢驗科，江西南昌330029；2、豐城市婦幼保健計劃生育服務(wù)中心，江西豐城331100；3、中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)系，湖南長沙410008；4、廈門醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)部，福建廈門361008）

目的研究MICA等位基因多態(tài)性與結(jié)直腸癌易感性之間的關(guān)聯(lián)性。方法采用PCR-SSP和PCR-SBT方法對樣本MICA等位基因的多態(tài)性進(jìn)行檢測。結(jié)果結(jié)直腸癌患者中檢出7種MICA等位基因；和對照組相比較，結(jié)直腸癌患者組中MICA*010等位基因分布頻率更高，可能是結(jié)直腸癌的易感基因（30.0%vs 6.2%，OR=6.43，95%CI：3.51-11.76，Pc＜0.05），MICA*008和MICA*045等位基因分布頻率更低，可能是保護(hù)基因（MICA*008：14%vs 25.4%，OR=0.48，95%CI：0.29-0.78，Pc＜0.05；MICA*045：2%vs 12.9%，OR=0.14，95%CI：0.05-0.40，Pc＜0.05）。結(jié)論MICA等位基因多態(tài)性與結(jié)直腸癌的易感性間存在關(guān)聯(lián)性。

MICA基因；基因多態(tài)性；結(jié)直腸癌

結(jié)直腸癌（colorectal cancer，CRC）是較為常見的消化道惡性腫瘤，近年來在世界范圍內(nèi)其發(fā)病率和死亡率總體呈不斷上升的趨勢。結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展與飲食、生活方式、危險因素暴露及基因變異等多種因素有關(guān)。MICA（MHC class I related chain A）是腫瘤相關(guān)基因，位于人類第6號染色體短臂，具有廣泛的多態(tài)性，1994年由美國西雅圖大學(xué)研究中心Spies教授領(lǐng)導(dǎo)的研究隊伍報道［1-3］。MICA編碼產(chǎn)物與HLAI類分子極其相似，包括信號肽、胞外α1、α2和α3結(jié)構(gòu)，跨膜區(qū)和胞質(zhì)區(qū)，但不與β2球蛋白結(jié)合。MICA分子是NK細(xì)胞表面活化性受體NKG2D分子的配體，研究表明MICA基因的多態(tài)性與多種疾病易感性相關(guān)，但暫無與中國南方人群結(jié)直腸癌患者易感性相關(guān)的報道［4-7］。因此本研究以南方漢族結(jié)直腸癌人群為研究對象，以健康人群作為正常對照，對MICA基因多態(tài)性及結(jié)直腸癌易感性之間的關(guān)聯(lián)性進(jìn)行研究。

1 材料與方法

1.1 研究對象100名結(jié)直腸癌患者來自于南華大學(xué)附屬南華醫(yī)院2012年10月-2014年10月的住院病人，均經(jīng)病理診斷或輔助診斷，符合結(jié)直腸癌診斷的要求。患者平均年齡59.5歲（33歲～81歲），其中男性64例（64%），女性36例（36%）。120例健康人群作為對照，年齡35.0歲（18歲～75歲），其中男性82例（68%），女性38例（32%）。研究對象相互間無親緣關(guān)系，均簽署知情同意書，并符合倫理委員會的其它相關(guān)要求。

1.2 外周血基因組DNA的提取收集新鮮的EDTA抗凝靜脈血2ml，采用WHO推薦的標(biāo)準(zhǔn)鹽析法提取DNA［8］，測定波長260nm和280nm的OD值，A260/A280值在1.6～1.8范圍內(nèi)為宜。

1.3 MICA基因分型方法采用PCR-SSP（PCR sequence-specific primers）［9］與PCR-SBT（PCR sequence-based typing）［10，11］兩種不同的方法對樣本進(jìn)行MICA基因分型。大部分樣本采用PCR-SSP方法進(jìn)行分型，考慮到部分罕見MICA等位基因型別無法用PCR-SSP方法分析，采用PCR-SBT方法分析。PCR-SBT方法參照文獻(xiàn)［12，13］，設(shè)計并合成一對外部引物，擴(kuò)增引物序列如下：

Forward：5'-CGTTCTTGTCCCTTGCCCGTGTG C-3'，

Reverse：5'-GATGCTGCCCCATTCCCTTCCCA A-3'，

擴(kuò)增產(chǎn)物長度2.2kb。測序引物序列為：

1F：5'-ATTTCCTGCCCCAGGAAGGTTGG-3'；

2R：5'-CAACTCTAGCAGAATTGGAG-3'；

3F：5'-AAGAGAAACAGCCCTGTTCCTCTCC-3'

4R：'-GATGCTGCCCCATTCCCTTCCCAA-3'。

引物合成及測序由華大生物公司完成。采用Chromas Lite 2.01軟件對測序結(jié)果進(jìn)行分析，掃描MICA多態(tài)位點，進(jìn)行人工判讀并與MICA序列數(shù)據(jù)庫中的標(biāo)準(zhǔn)序列進(jìn)行比對，獲得相應(yīng)的MICA等位基因型別。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析MICA等位基因頻率、MICA基因型頻率、Hardy-Weinberg equilibrium（HWE）采用SHESIS軟件進(jìn)行計算獲得。關(guān)聯(lián)性分析采用Logistic回歸進(jìn)行統(tǒng)計分析，顯著性檢驗采用Fisher精確概率檢驗進(jìn)行，對P值采用Bonferroni校正后得到的Pc值在5%水平上進(jìn)行檢驗。

2 結(jié)果

2.1 Hardy-Weinberg平衡吻合度檢驗所選擇的健康對照經(jīng)Hardy-Weinberg平衡吻合度檢驗分析表明，各等位基因的分布理論頻率與觀察頻率之間無顯著性差異，表明本實驗所選樣本是符合Hardy-Weinberg平衡的隨機(jī)婚配群體。

2.2 MICA基因PCR-SSP產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖圖1為一隨機(jī)研究對象的MICA基因PCR-SSP法擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖，參照MICA分型格局表對其基因型進(jìn)行分析判斷，該隨機(jī)研究對象MICA基因型為MICA*01201/01201。

圖1 一隨機(jī)研究對象的MICA PCR產(chǎn)物電泳圖譜M：Marker；1～67為67個引物對，68孔為空白對照。

1.5.3 MICA等位基因多態(tài)性與結(jié)直腸癌相關(guān)性分析結(jié)直腸癌患者中共檢出7種MICA等位基因，其中MICA*010、MICA*019、MICA*002是患者組中分布頻率最高的3種等位基因，分別占30.0%、22.0%、20.0%。和對照組相比較，結(jié)直腸癌患者組中MICA*010等位基因分布頻率顯著偏高（30.0% vs 6.2%，OR=6.43，95%CI：3.51～11.76，Pc＜0.05）；MICA*010等位基因可能對結(jié)直腸癌易感（OR= 6.43，95%CI：3.51～11.76，Pc＜0.05）；。MICA*008和MICA*045等位基因在結(jié)直腸癌患者組分布頻率顯著偏低（MICA*008：14.0%vs 25.4%，OR= 0.48，95%CI：0.29～0.78，Pc＜0.05；MICA*045：2.0% vs 12.9%，OR=0.14，95%CI：0.05～0.45，Pc＜0.05），見表1。

1.5.4 MICA-STR基因多態(tài)性與結(jié)直腸癌關(guān)聯(lián)性分析結(jié)直腸癌患者中共檢出5種MICA-STR等位基因，其中MICA-A5在結(jié)直腸癌患者組中分布頻率最高，占52.0%，與對照組比較，結(jié)直腸癌患者組中MICA-A5等位基因顯著升高（52%vs 35.4%，OR=1.98，95%CI：1.35～2.90，Pc＜0.05）；MICA-A5.1等位基因分布則顯著降低（14.0%vs 25.4%，OR= 0.48，95%CI：0.29～0.78，Pc＜0.05）（見表2）。

1.5.5 MICA基因型與結(jié)直腸癌相關(guān)性分析和對照組相比較，結(jié)直腸癌患者組MICA*008/008基因型分布頻率顯著減少（2.0%vs 10.8%，OR= 0.17，95%CI：0.04～0.76，Pc＜0.05）；MICA*002/010、MICA*010/010基因型分布顯著升高（MICA*002/ 010：14.0%vs 4.2%，OR=3.74，95%CI：1.30～10.79，Pc＜0.05；MICA*010/010：16.0%vs0.8%，OR= 22.67，95%CI：2.95～174.24，Pc＜0.05）（見表3）。

3 討論

結(jié)直腸癌是常見的消化道惡性腫瘤，其在世界范圍內(nèi)的發(fā)病率和死亡率總體呈不斷上升的趨勢。在我國，隨著經(jīng)濟(jì)社會發(fā)展和人們生活水平提高，包括飲食、生活方式在內(nèi)的多種環(huán)境因素都在不斷的發(fā)生變化，直腸癌的發(fā)病率也呈逐年上升的趨勢［14］。結(jié)直腸癌的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，其發(fā)生受飲食、生活方式、環(huán)境因素、遺傳因素、致癌物的暴露強(qiáng)度、種族、地域等多種因素影響。近年來，直結(jié)腸癌的遺傳易感性機(jī)制在其發(fā)病中的意義越來越引起人們的重視，大量的研究開始關(guān)注于直結(jié)腸癌發(fā)病與基因多態(tài)性之間的關(guān)聯(lián)性研究。研究表明，MMP-7基因多態(tài)性可能是直腸癌進(jìn)展的一個因素；XRCC2基因多態(tài)性與直腸癌發(fā)病風(fēng)險存在關(guān)聯(lián)性；IGFBP7 rs11133472AG、rs1718848AG基因型增加直腸癌患病風(fēng)險［15-17］；以上研究結(jié)果充分說明，直結(jié)腸癌的發(fā)生發(fā)展與遺傳因素密切相關(guān)；結(jié)直腸癌的發(fā)生是多種基因共同作用的結(jié)果；單一基因?qū)Y(jié)直腸癌的發(fā)生作用有限；因此需對結(jié)直腸癌與基因多態(tài)性之間的關(guān)聯(lián)進(jìn)行深入研究。

表1 MICA等位基因頻率在結(jié)直腸癌病人與對照人群中的比較

表2 MICA-STR等位基因頻率在肺癌病人與對照人群中的比較

表3 MICA基因型頻率在結(jié)直腸癌病人與對照人群中的比較

MICA基因具有高度的多態(tài)性，目前已報道超過100個基因型。MICA基因的高度多態(tài)性與腫瘤、自身免疫病等多種疾病發(fā)生發(fā)展相關(guān)［14-16］。根據(jù)編碼跨膜區(qū)DNA序列微衛(wèi)星GCT重復(fù)次數(shù)的不同，已發(fā)現(xiàn)有A4、A5、A5.1、A6、A7、A9和A10等MICA跨膜區(qū)微衛(wèi)星基因型。A5.1與其他微衛(wèi)星基因型主要區(qū)別在于第952位處插入了一個鳥嘌呤核苷酸殘基，導(dǎo)致移碼突變，這種變異的MICA分子在翻譯部分跨膜結(jié)構(gòu)后遇終止密碼而被中斷，從而使MICA-A5.1分子僅含有部分膜區(qū)結(jié)構(gòu)，但胞漿尾部結(jié)構(gòu)完全缺失［18］。Gambelunghe G等發(fā)現(xiàn)，MICA-A5.1基因與SLE易感正相關(guān)［19］。邢永華等人通過對青海回族胃癌人群的MICA-TM等位基因的分型研究發(fā)現(xiàn)，MICA-A5.1基因是胃癌易感相關(guān)基因［20］。Zhao J等人近來研究表明，功能性的MICA-129基因多態(tài)性與潰瘍性結(jié)腸炎的發(fā)病呈正相關(guān)［21］。Garcia G等人發(fā)現(xiàn)MICA*008型別為登革熱發(fā)病的易感基因［22］，MICA-A5.1與多種疾病的易感之間具有關(guān)聯(lián)性［23］。

我們采用PCR-SSP及PCR-SBT方法檢測了結(jié)直腸癌患者中MICA等位基因分布的情況，首次報道了MICA等位基因在中國南方人群結(jié)直腸癌患者中的分布頻率。我們的研究發(fā)現(xiàn)，結(jié)直腸癌患者中共檢出7種MICA等位基因，其中MICA *010、MICA*019、MICA*002是患者組中分布頻率最高的3種等位基因。MICA*008和MICA*045等位基因在結(jié)直腸癌患者組分布頻率較少，提示為結(jié)直腸癌的保護(hù)性等位基因（OR＜1，Pc＜0.05）。MICA*010等位基因在結(jié)直腸癌患者組分布較多，提示為結(jié)直腸癌的易感性等位基因（OR＞1，Pc＜0.05）。結(jié)直腸癌患者中共檢出5種MICA-STR等位基因，其中MICA-A5在直結(jié)腸癌患者組中分布頻率最高，提示為結(jié)直腸癌的易感性等位基因OR＞1，Pc＜0.05）；MICA-A5.1在結(jié)直腸癌患者中分布較少，提示為結(jié)直腸癌的保護(hù)性等位基因（OR＜1，Pc＜0.05）；這些結(jié)果提示結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展與MICA基因的多態(tài)性之間存在關(guān)聯(lián)。推測可能的致病機(jī)制是由于某些型別的MICA基因編碼的蛋白質(zhì)分子與NK細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞上的NKG2D受體親和力低，導(dǎo)致這些免疫細(xì)胞不能有效活化，對腫瘤細(xì)胞不能發(fā)揮正常的免疫監(jiān)視功能所致。特別的是，在本次研究中我們發(fā)現(xiàn)，結(jié)直腸癌患者人群中MICA-A5.1分布率低，可能原因有二，一是標(biāo)本數(shù)量偏少，二是直結(jié)腸癌腫瘤細(xì)胞表面MICA的α3區(qū)域與ERp5形成復(fù)合物，使得MICA可以被ADAM裂解，誘生可溶性的MICA（sMICA），即“MICA脫落”現(xiàn)象［24］。裂解下來的sMICA與NKG2D相互作用，然后誘導(dǎo)其內(nèi)化及降解，并刺激免疫抑制性T細(xì)胞的增殖，使得MICA-A5.1等位基因表現(xiàn)出對結(jié)直腸癌不易感。然而結(jié)直腸癌的發(fā)生是環(huán)境和遺傳因素交互作用的結(jié)果，是一種多因素、多階段、多基因?qū)е碌募膊。壳叭圆磺宄﨧ICA基因是如何獨立于其他基因?qū)Y(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展起作用的機(jī)制，且不同人群中MICA基因型分布不完全相同。因此，我們將對不同地區(qū)及種族之間多個基因的多態(tài)性與結(jié)直腸癌易感性之間的關(guān)系進(jìn)行進(jìn)一步研究。

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Study on the association between MICA gene polymorphism and colorectal cancer

CHEN En1，ZOU Xuesen1，NIE Dekui2，WANG Chunyang1，LV Saiping1，CHEN Hui1，CHEN Chunjing3，LIN Lin4.
1.Clincal Laboratory，Jiangxi Province Tumor Hospital，Nanchang 330029，China；2.Maternal And Child Health Care Family Planning Service Center of Fengcheng，F(xiàn)engcheng Jiangxi 331100，China；3.Department of Immunology，College of Basic Medical Sciences，Central South University，Changsha 410078，China；4.Faculty of Basic Medical Sciences，Xiamen Medical College，Xiamen Fujian 361008，China.

Objective To study the association between the MICA gene polymorphism and susceptibility to colorectal cancer. Methods PCR-SSP and PCR-SBT were used to analyze the gene polymorphism of MICA in 100 colorectal cancer patients and 120 healthy individuals.Results Seven allele genes were found in the participants，the phenotype frequency of MICA*010 was higher in colorectal cancer patients when compared with healthy controls，presenting genic susceptibility to colorectal cancer（30. 0%vs 6.2%，OR=6.43，95%CI：3.51-11.76，Pc＜0.05）.Additionally，MICA*008 and MICA*045 were less frequent among patients（MICA*008：14%vs 25.4%in healthy controls，Pc＜0.05，OR=0.48，95%CI：0.29-0.78；MICA*045：2%vs 12.9%in healthy controls，Pc＜0.05，OR=0.14，95%CI：0.05-0.40），presenting genic protection to colorectal cancer.Conclusions These results suggest that the MICA allele gene polymorphism may be associated with susceptibility to colorectal cancer.

MICA alleles；Gene polymorphism；Colorectal cancer

R574.63，R446.62

A

1674-1129（2016）05-0545-05

10.3969/j.issn.1674-1129.2016.05.003

2016-05-18；

2016-07-07）

江西省衛(wèi)生計生委科技計劃項目（20165393）

陳恩，1982年11月生，男，主管檢驗師，醫(yī)學(xué)博士，中南大學(xué)免疫學(xué)專業(yè)畢業(yè)，主要從事遺傳免疫研究。TEL：079188313884；E-mail：cheneng3821@sina.com.

林琳，1979年6月生，女，講師，醫(yī)學(xué)博士，中南大學(xué)免疫學(xué)專業(yè)畢業(yè)，主要從事遺傳免疫研究。TEL：05922110642；E-mail：lynnvenn@sina.com.