間接免疫熒光法和歐蒙印跡法檢測抗雙鏈DNA抗體的比較

張小蓮，王乃群，羅 立

（宜春市人民醫院，江西宜春336000）

間接免疫熒光法和歐蒙印跡法檢測抗雙鏈DNA抗體的比較

張小蓮，王乃群，羅 立

（宜春市人民醫院，江西宜春336000）

目的比較間接免疫熒光法和歐蒙印跡法檢測抗雙鏈抗體的陽性率及特點。方法采用間接免疫熒光法和歐蒙印跡法對240例患者血清標本進行抗dsDNA抗體的檢測（其中系統性紅斑狼瘡患者80例，非系統性紅斑狼瘡患者160例）。結果經間接免疫熒光法檢測，SLE中抗dsDNA抗體陽性為28例，陽性率為35.00%（28/80），非SLE中抗dsDNA抗體陽性為1例，陽性率為0.625%（1/160）；經歐蒙印跡法法檢測，SLE中抗dsDNA抗體陽性為41例，陽性率為51.25%（41/80），非SLE中抗dsDNA抗體陽性為2例，陽性率為1.25%（2/160）。兩種方法檢出的陽性率在SLE組做統計學比較，有顯著性差異（P＜0.05）。結論在SLE患者的診斷中，歐蒙印跡法抗dsDNA陽性的敏感性高于間接免疫熒光法抗dsDNA陽性。

間接免疫熒光法；免疫印跡法；抗dsDNA抗體；系統性紅斑狼瘡

抗雙鏈DNA（dsDNA）抗體是系統性紅斑狼瘡（SLE）患者的特異性標志抗體［1，2］，在SLE的發病中起重要作用，抗體與dsDNA結合形成的免疫復合物可存留在循環中或沉積在組織局部，后者激活補體導致組織炎癥性損害，引起SLE。抗dsDNA抗體對SLE的診斷具有很高的特異性，其抗體滴度與疾病活動度存在相關性［3，4］，抗體滴度高提示SLE處于活動期。抗dsDNA抗體檢測是目前SLE患者診斷及治療最常用的指標之一［5］。本文采用分別間接免疫熒光法和歐蒙印跡法檢測抗dsDNA抗體，并對這兩種方法的檢測結果進行比較，報告如下。

1 材料與方法

1.1 標本來源收集在我院就診的風濕免疫病患者240例，包括SLE患者80例和非SLE患者160例，SLE的診斷符合1982年美國風濕病學會的診斷標準［6］。標本采集：抽取靜脈血3ml，分離血清置-20℃冰箱備檢。在同一工作日，用兩種不同方法進行檢測。

1.2 試劑與儀器抗雙鏈DNA抗體（IgG）間接免疫熒光法試劑盒（30T），抗核抗體譜（IgG）歐蒙印跡法試劑盒（64T）均購自德國歐蒙公司；熒光顯微鏡（ECLIPSE80i）購自日本Nikon公司；轉移脫色搖床（TS-8型）購自江蘇其林貝爾公司。

1.3 方法分別采用間接免疫熒光法和歐蒙印跡法對實驗標本進行抗dsDNA抗體的檢測，兩種方法嚴格按照試劑盒使用說明書進行操作。

1.31 間接免疫熒光法法采用歐蒙綠蠅短膜蟲間接免疫熒光檢測試劑盒進行檢測，將血清按1：10稀釋，嚴格按試劑盒使用說明書操作，在熒光顯微鏡下觀察結果，綠蠅短膜蟲動基體均質的或邊緣亮度增強的判為陽性，如果陰性，則動基體不顯示熒光。

1.3.2 歐蒙印跡法采用歐蒙抗核抗體譜檢測試劑盒進行檢測，將血清按1：101稀釋，嚴格按試劑使用說明書操作，每份標本檢測抗dsDNA的IgG抗體，當質控帶出現時，包被dsDNA純抗原位置呈現一條深色條帶為陽性，反之為陰性。

1.4 統計學方法采用SPSS 18.0統計軟件對患者資料進行分析，采用計數資料卡方檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義.

2 結果

SLE組與非SLE組結果見表1。對80例SLE組患者進行抗dsDNA抗體檢測，間接免疫熒光法檢出陽性28例，陽性率為35.00%（28/80）；歐蒙印跡法檢出41例，陽性率為51.25%（41/80），2種方法陽性率有顯著性差異（P＜0.05）。SLE組中間接免疫熒光法檢測陽性患者，用歐蒙印跡法法檢測也為陽性。對160例非SLE組患者進行抗dsDNA抗體檢測，間接免疫熒光法檢出陽性1例，陽性率為0.625%（1/160）；歐蒙印跡法法檢出陽性2例，陽性率為1.25%（2/160），2種方法陽性率無顯著性差異（P＞0.05）。非SLE組中兩種方法檢測均陽性的有1例，歐蒙印跡膜條技術陽性而間接免疫熒光法檢測陰性的有1例，這兩例患者臨床表現不符合SLE的診斷標準，根據2002年干燥綜合征國際分類標準診斷，這兩例患者臨床表現均符合SS的診斷標準。

表1 SLE組與非SLE組中間接免疫熒光法與歐蒙印跡法檢測抗dsDNA的比較［n（%）］

3 討論

抗dsDNA抗體是診斷SLE的標志性抗體，美國風濕病學會已將其列為SLE的診斷標準之一。正確判斷抗dsDNA抗體的結果非常重要［7］。間接免疫熒光法檢測抗dsDNA抗體的標準基質是血鞭毛蟲屬的綠蠅短膜蟲作為抗原基質進行檢測的，它有一個大的含有dsDNA的線粒體（動基體），除dsDNA之外，通常不含有其他細胞核抗原，因而與動基體起反應的自身抗體只是dsDNA，具有高度特異性，被認為是檢測細胞內抗原自身抗體的金標準［8，9］，是一種較好的確證方法。此方法還可以檢測陽性標本的滴度，為患者療效監控提供有效的依據。但IIF結果的判斷有一定的主觀性，易受檢測人員技術水平及主觀因素影響，需要操作者有嫻熟的形態學技術及豐富的經驗，且熒光顯微鏡價格昂貴，基層醫院難以開展［10，11］。歐蒙印跡法檢測抗dsDNA抗體將天然的dsDNA抗原經親和層析純化后包被在膜條的固定位置上，稀釋血清的抗dsDNA抗體與膜條上的抗原結合，結合的抗體與堿性磷酸酶標記的抗人IgG抗體反應，加入底物液使已結合的抗體顯色，呈現一條深色的陽性帶。結果肉眼觀察、特異性強，敏感性高，膜條結果可長期保存，且操作簡便，用血量少，無需特殊設備，可同時完成對11種自身抗體的識別和過篩，對提高自身免疫疾病的診斷水平有很大的幫助，適合于各大醫院推廣應用，但是對臨界陽性的標本不同操作者對結果的判斷不盡相同，很容易造成誤判或假陽性，印跡技術在生產過程中可能會發生抗原轉印不充分或丟失，導致出現假陰性結果［12-14］。且膜條結果判讀抗雙鏈DNA時有些情況需要注意，如該抗體單獨出現時不能報，為非特異性反應。如果單獨出現時也記為非特異性反應，就會在一定程度上導致陽性率增高［15］。本研究中13例患者經間接免疫熒光法檢測呈陰性，而經歐蒙印跡法檢測呈陽性，其主要是由于間接免疫熒光法的標準基質為綠蠅短膜蟲，其只含有一個dsDNA不含其它細胞核抗原，其雖具有較高的特異性，然而該檢測方式較易受檢測人員主觀因素的影響，且在制備過程中DNA的內部結構位點可能少部分人為暴露，進而可能會因抗ssDNA抗體的存在而引發非特異性反應，對檢測結果的影響較大，產生假陽性；另外，該檢測方法需采用熒光纖維設備，故而難以在基層醫院推廣。

本文通過上述兩種檢測抗dsDNA抗體的方法比較，兩種方法檢出的陽性率在SLE組做統計學比較，有明顯差異（P＜0．05），歐蒙印跡法檢測的陽性率明顯高于間接免疫熒光法檢測的陽性率。兩種方法在檢測SLE組與非SLE組的陽性率做統計學比較，有顯著差異（P＜0.01），SLE組明顯高于非SLE組，驗證了抗dsDNA抗體在SLE的診斷中的意義。綜上討論，兩種方法各有其優缺點，可根據實際情況選擇檢測方法，并結合患者的臨床表現來判斷結果。

［1］Aganovic-Musinovic I，Prljaca-Zecevic L，Subasic D.The Incidence of ANA and ETI-dsDNA detected by enzyme Immunoassays and indirect immunofluorescence assay（IFA）［J］.Med Arh，2010，64（2）:68-70.

［2］Almogren A.Anti-double stranded antibody.AssociationWith titers and fluorescence pattems of anti-nuclear anti-bodyin systemic lupus erythemtosus［J］.Saudi Med J，2010，31（1）:32-36.

［3］牟君成，陳聯，王文昕，等.ANA、抗ENA抗體聯合檢測對自身免疫病診斷的意義［J］.重慶醫學，2009，38（18）：2334-2337.

［4］姜友珍，莫碧媛.SLE患者ANA、抗ds-DNA及ENA聯合檢測的對照分析［J］.廣西醫學，2006，28（4）：524-525.

［5］Tan EM，Cohen AS，Fries JF，et al.The 1982 revised criteria for the classification of systemic lupus erythematosus（SLE）［J］.Arthritis Rheum，1982，25（11）:1271-1277.

［6］武永康，王蘭蘭，唐江濤，等.抗核抗體不同檢測方法的對比分析［J］.中華風濕病學雜志，2006，10（10）：610-614.

［7］Conrad K，Ittenson A，Reninhold D，et al.High sensitive detection of double-straned DNA autoantibodies by a modified Crithidia luciliaeimmunofluorescenecetest［J］.AnnNYAcadSci， 2009，1173:180-185.

［8］丁耀東，范雪麗，胡彥，等.三種不同方法檢測抗雙鏈DNA抗體的比較分析［J］.實驗與檢驗醫學，2015，33（6）：697-700.

［9］曾燕坤，吳杰.抗核抗體、抗核抗體譜及抗雙鏈DNA抗體的聯合檢測系統性紅斑狼瘡的診斷價值［J］.醫學臨床研究，2014，31（11）：2081-2083.

［10］吳煒霖，林德偉，潘永康，等.系統性紅斑狼瘡患者外周血IL-10和TGF-β1的表達及與抗雙鏈DNA抗體的關系［J］.廣東醫學，2013，34（16）：2493-2495.

［11］王紅，謝奇朋，孫莉，等.三氧化二砷對MRL/lpr自發性狼瘡小鼠抗雙鏈DNA抗體和DNA甲基轉移酶及CD11a表達的影響［J］.中華風濕病學雜志，2012，16（3）：177-181.

［12］王廣杰，陳潔，李士軍.比較酶聯免疫吸附法與間接免疫熒光法檢測抗核抗體的價值［J］.國際檢驗醫學雜志，2015，36（19）：2814-2816.

［13］王艷，劉曉輝，張學智，等.間接免疫熒光法和酶聯免疫吸附法檢測抗線粒體抗體的分析與比較［J］.中日友好醫院學報，2015，29（3）：154-157.

［14］董玉琳，曹向紅，王勝虎.間接免疫熒光法與線性免疫印跡法聯合檢測抗核抗體在系統性紅斑狼瘡診斷中的意義［J］.實用醫技雜志，2014，21（7）：701-704.

［15］劉雁，章松平，師金川，等.間接免疫熒光法在艾滋病合并肺孢子菌肺炎診斷中的應用［J］.中華實驗和臨床病毒學雜志，2014，28（2）：139-141.

R446.62，R593.21

A

1674-1129（2016）05-0642-03

10.3969/j.issn.1674-1129.2016.05.035

2016-02-29；

2016-05-04）