NOD鼠體內CD4+NKG2D+T細胞與CD8+T細胞間關系

王宇航, 馬旻軒, 徐婭雯, 李　凱, 潘興元, 錢　莉, 龔衛娟, 季明春

(揚州大學醫學院 病原生物學和免疫學教研室, 江蘇 揚州, 225001)

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NOD鼠體內CD4+NKG2D+T細胞與CD8+T細胞間關系

王宇航, 馬旻軒, 徐婭雯, 李凱, 潘興元, 錢莉, 龔衛娟, 季明春

(揚州大學醫學院 病原生物學和免疫學教研室, 江蘇 揚州, 225001)

目的探討NOD鼠體內CD4+NKG2D+T細胞與CD8+T細胞間關系。方法動態監測NOD鼠外周血中CD4+NKG2D+T及CD8+NKG2D+T細胞在不同周齡頻率。利用IGRP206-214特異性CTL清除的NOD鼠，對其外周血中CD4+NKG2D+/CD4+T及CD8+NKG2D+/CD8+T細胞頻率進行分析。將磁珠分選所得CD4+NKG2D+T細胞分別與經CFSE標記的純CD4+NKG2D-T細胞、CD8+T細胞共培養4 d, 檢測體系中CD4+NKG2D-T細胞、CD8+T細胞CFSE的熒光強度變化。結果NOD鼠外周血CD4+NKG2D+/CD4+T及CD8+NKG2D+/CD8+T細胞頻率均隨其1型糖尿病疾病進程發展逐漸升高，且二者之間呈正相關。IGRP206-214特異性CTL清除的NOD鼠，外周血中CD4+NKG2D+/CD4+T細胞頻率隨CD8+NKG2D+/CD8+T細胞頻率降低顯著下降。與單獨培養的CD4+NKG2D-T細胞相比，加入CD4+NKG2D+T細胞的培養體系中, CD4+NKG2D-T細胞增殖加快。但CD4+NKG2D+T細胞對CD8+T增殖作用不明顯。結論NOD鼠體內存在著一群與1型糖尿病疾病進程正相關的CD4+NKG2D+T細胞，且該群細胞極有可能是通過直接作用于CD4+NKG2D-T細胞而間接對CD8+T細胞產生作用。

CD4+NKG2D+T細胞; CD8+T細胞; 1型糖尿病; NOD鼠

Relationship between CD4+NKG2D+T and CD8+T cells in NOD rats

1型糖尿病(T1D)是一種自身反應性T細胞攻擊自身胰島β細胞使其受損的自身免疫性疾病[1-2]。該過程，主要是由效應性的CD4+T細胞和CD8+T細胞實施，其他多種免疫細胞共同參與而形成的。NKG2D為NK細胞活化性受體，近來研究發現亦可表達于人NKT、γδT、激活的巨噬細胞、CD4+T細胞亞群、CD8+T細胞及鼠的NKT、γδT細胞亞群、激活的CD8+T細胞、CD4+T細胞亞群。有研究[3-6]表明，1型糖尿病的動物模型NOD鼠的胰島β細胞表達NKG2D的配體Rae-1，因此產生了表達NKG2D受體的自身反應性CD8+T細胞，大量浸潤在胰島中，并且NOD鼠體內的CD4+NKG2D+T細胞是一群與正常小鼠體內CD4+NKG2D+T不同的細胞亞群，它隨著NOD鼠T1D疾病病程的發展而變化[7]。在人類中，Rodacki等[8]報道同NOD小鼠類似，在炎癥等因素刺激下，NKG2D 配體可能誘導表達于胰島細胞，這將激活表達NKG2D 受體的CD4+T細胞及自身反應性CD8+T細胞等單個核細胞。

1　材料與方法

1.1實驗小鼠

NOD鼠，引種于南京大學模式動物研究所，飼養于揚州大學醫學院微生物與免疫學實驗室SPF級鼠房。所有飼料、飲水以及墊料均經過滅菌處理。所有實驗操作均在無菌超凈工作臺內進行，操作都符合實驗動物福利。

1.2主要試劑

Anti-Mouse CD8a APC、Anti-Mouse CD4FITC、Anti-Mouse CD314(NKG2D) PE均購自美國eBioscience公司。BD FACSTMLysing Solution購自美國BD公司。

1.3NOD鼠動態血糖監測

從10周齡至30周齡進行血糖監測，1次/周。血糖檢測前更換新的墊料，并進行禁食6 h。當連續2周的空腹血糖值高于13.9 mmol/dL時，則認定該只NOD鼠發生糖尿病。

1.4流式檢測CD4+NKG2D+T、CD8+NKG2D+T細胞頻率

小鼠眼眶靜脈叢采血后，標記相應抗體，裂解紅細胞。PBS洗滌后，調整體系至200 μL用流式細胞儀進行檢測。

1.5CFSE標記淋巴細胞增殖

利用磁珠分選試劑盒(購自德國美天妮公司)所得細胞數調整至0.5×106至10×107/mL。用1 mL 5%HIFCS充分混勻細胞，加入適量CFSE保證其終濃度應在5 mmol/L。室溫避光孵育5 min后PBS洗滌細胞，重復2次。

1.6統計學分析

采用GraphPad Prism5進行統計，采用t檢驗或ANOV方差檢驗進行分析，當P<0.05為差異具有統計學意義。

2　結　果

2.1NOD鼠外周血CD4+NKG2D+/CD4+T細胞及CD8+NKG2D+/CD8+T細胞頻率隨T1D疾病進程顯著上升

NOD鼠的血糖值隨著1型糖尿病的疾病發展逐漸升高，且在30周左右的發病率高達80%, 故分別在6、8～10、12～16、20、25、30周以及發病期，取NOD鼠外周血進行監測。結果顯示，隨NOD鼠1型糖尿病疾病發展其外周血中CD4+NKG2D+/CD4+T及CD8+NKG2D+/CD8+T細胞的頻率顯著上升。見圖1和表1。

表1　各周齡NOD鼠外周血CD4+NKG2D+/CD4+T及CD8+NKG2D+/CD8+T細胞頻率　%

圖1 NOD鼠外周血CD4+NKG2D+/CD4+T及CD8+NKG2D+/CD8+T細胞頻率變化典型流式圖

2.2IGRP206-214特異性CTL清除的NOD鼠外周血中CD8+NKG2D+/CD8+T與CD4+NKG2D+/CD4+T細胞頻率均降低

本課題組前期已成功制備IGRP206-214特異性CTL清除的NOD鼠模型，且實驗結果表明實驗組較對照組在降低NOD鼠血糖及發病率方面均有明顯效果。利用該小鼠模型，取同為35周齡的處理組及同周齡PBS對照組小鼠(已發病)的外周血，對其CD4+NKG2D+/CD4+T及CD8+NKG2D+/CD8+T細胞頻率進行分析。結果顯示與CD8+NKG2D+/CD8+T細胞頻率變化趨勢相同，外周血CD4+NKG2D+/CD4+T細胞頻率也降低。見表2和圖2。

表2　IGRP206-214特異性CTL清除的NOD鼠外周血CD8+NKG2D+/CD8+T及CD4+NKG2D+/CD4+T細胞頻率　%

與PBS比較, *P<0.05。

圖2IGRP206-214特異性CTL清除的NOD鼠外周血CD8+NKG2D+/CD8+T及CD4+NKG2D+/CD4+T細胞頻率典型流式圖

2.3NOD鼠外周血中CD4+NKG2D+/CD4+T與CD8+NKG2D+/CD8+T細胞頻率呈正相關

將上述所得的NOD鼠外周血CD4+NKG2D+/CD4+T細胞頻率與相應個體相同周齡的外周血CD8+NKG2D+/CD8+T細胞頻率做線性回歸分析發現，NOD鼠外周血CD4+NKG2D+/CD4+T細胞頻率與CD8+NKG2D+/CD8+T細胞頻率成正向線性相關(P<0.0001,n=24)。見圖3。

圖3 NOD鼠外周血CD4+NKG2D+/CD4+T與CD8+NKG2D+/CD8+T細胞頻率線性回歸

2.4NOD鼠中CD4+NKG2D+T細胞直接促進CD4+NKG2D-T細胞增殖但對CD8+T細胞增殖影響不大

為觀察NOD鼠體內CD4+NKG2D+T細胞對CD4+NKG2D-T細胞及CD8+T細胞的作用方式，作者取20周齡尚未發病的NOD雌鼠脾臟，采用磁珠分選方式分別獲取CD4+NKG2D+T細胞、CD4+NKG2D-T細胞以及CD8+T細胞。將所得的CD4+NKG2D+T細胞分別與經CFSE標記的CD4+NKG2D-T細胞、CD8+T細胞共培養。4 d后檢測體系中的CD4+NKG2D-T細胞、CD8+T細胞CFSE的熒光強度變化情況。結果發現，與單獨的CD4+NKG2D-T細胞相比，加入CD4+NKG2D+T細胞的培養體系中，其CD4+NKG2D-T細胞的增殖加快。而CD8+T的增殖則幾乎無變化。見圖4。

圖4 NOD鼠中CD4+NKG2D+T細胞直接促進CD4+NKG2D-T細胞增殖,但對CD8+T細胞增殖影響不大

3　討　論

NKG2D為NK細胞活化性受體，近來研究[9]發現亦可表達于其他多種免疫細胞。有研究[10]顯示，NOD鼠的胰島β細胞表達NKG2D的配體Rae-1, 并且其胰島中有大量CD8+NKG2D+T細胞浸潤。那么NOD鼠體內的CD4+NKG2D+T、CD8+NKG2D+T細胞極有可能參與了其T1D的疾病進程。本研究表明，隨著NOD鼠T1D疾病發生發展，NOD鼠外周血中CD4+NKG2D+T、CD8+NKG2D+T細胞頻率均是逐漸上升的。本課題組前期成功制備的IGRP206-214特異性CTL清除的NOD模型鼠較普通NOD鼠在降低NOD鼠血糖及發病率方面均有明顯效果，并且CD4+NKG2D+/CD4+T細胞隨著模型鼠外周血CD8+NKG2D+/CD8+T細胞頻率降低亦下降。這從另一方面證實了CD4+NKG2D+/CD4+T與CD8+NKG2D+/CD8+T細胞之間是存在關系的，且該種關系是與NOD鼠T1D相關的。

在小鼠體內, NKG2D僅僅表達在活化的CD8+T細胞表面[11], 而CD8+T細胞又為T1D的主要效應細胞。將所得的NOD鼠外周血CD4+NKG2D+/CD4+T細胞頻率與相應個體同周齡的外周血CD8+NKG2D+/CD8+T細胞頻率做線性回歸分析，結果顯示，二者間呈正向線性相關。那么CD4+NKG2D+/CD4+T細胞對CD8+T細胞的增殖是否起到促進作用呢？結果顯示CD4+NKG2D+T細胞可以直接促進CD4+NKG2D-T細胞增殖，但對CD8+T細胞增殖并無直接作用。所以作者推斷, NOD鼠體內的CD4+NKG2D+T細胞可能是通過直接對CD4+NKG2D-T細胞作用從而對CD8+T細胞產生作用[12-13]。這個想法在青少年肺炎中被得到了證實[14-15]。

綜上所述, NOD鼠外周血中的CD4+NKG2D+T、CD8+NKG2D+T細胞頻率隨著T1D疾病進程逐漸升高，二者之間呈正向線性關系。該群細胞可以直接促進CD4+NKG2D-T細胞增殖，但對CD8+T細胞增殖則無直接作用。

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WANG Yuhang, MA Minxuan, XU Yawen, LI Kai, PAN Xingyuan,QIAN Li, GONG Weijuan, JI Mingchun

(DepartmentofPathogenicBiologyandImmunology,TheMedicalCollege

ofYangzhouUniversity,Yangzhou,Jiangsu, 225001)

ObjectiveTo explore the relationship between CD4+NKG2D+T and CD8+T cells in NOD rats. MethodsThe frequency of CD4+NKG2D+T and CD8+NKG2D+T cells in peripheral blood of NOD rats in different weeks were dynamically monitored. By using IGRP206-214-SAP NOD rats, the frequencies of CD4+NKG2D+/CD4+T and CD8+NKG2D+/CD8+T cells in peripheral blood were analyzed. CD4+NKG2D+T cells was purified and CFSE CD4+NKG2D-T cells or CD8+T were co-cultured 4 days were marked. The CFSE fluorescence intensity change of CD4+NKG2D-T cells or CD8+T cells were detected. ResultsThe frequency of CD4+NKG2D+/CD4+T and CD8+NKG2D+/CD8+T cells in peripheral blood of female NOD rats during the development of type 1 diabetes disease process gradually increased, and they were positively correlated to the linear. In the NOD rats with IGRP206-214-SAP, the frequency of CD4+NKG2D+/CD4+T cells in peripheral blood was reduced by CD8+NKG2D+/CD8+T cells reduction. Compared with alone CD4+NKG2D-T cells, the proliferation of CD4+NKG2D-T cells was speeded up in cell culture system incubated with CD4+NKG2D+T. CD4+NKG2D+T cells is no direct effect on the CD8+T cell. ConclusionAn increased CD4+NKG2D+T cells subsets in NOD mice might have an effect on CD8+T cells through activation of CD4+NKG2D-T cells.

CD4+NKG2D+T cells; CD8+T cells; T1D; NOD

2016-01-21

國家自然科學基金(30771955)

季明春, E-mail: mcji@yzu.edu.cn

R 392.2

A

1672-2353(2016)19-005-04DOI: 10.7619/jcmp.201619002