IgA腎病患者外周血單個核細胞Toll樣受體4的表達及血清炎癥趨化因子的水平

龍　泉, 朱　淳, 鄒　軍, 劉秀英, 蔣更如

(1. 上海國際醫學中心 腎臟內科, 上海, 201318;2. 上海交通大學醫學院附屬新華醫院崇明分院 腎臟內科, 上海, 202150;3. 上海交通大學醫學院附屬新華醫院 腎臟內科, 上海, 200092)

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IgA腎病患者外周血單個核細胞Toll樣受體4的表達及血清炎癥趨化因子的水平

龍泉1, 朱淳2, 3, 鄒軍3, 劉秀英3, 蔣更如3

(1. 上海國際醫學中心 腎臟內科, 上海, 201318;2. 上海交通大學醫學院附屬新華醫院崇明分院 腎臟內科, 上海, 202150;3. 上海交通大學醫學院附屬新華醫院 腎臟內科, 上海, 200092)

目的研究IgA腎病(IgAN)患者外周血單個核細胞Toll樣受體4(TLR4)的表達及血清中趨化因子MCP-1和炎癥因子IL-6的水平，探討TLR4在IgAN發病中可能的作用。方法將在本科經腎組織活檢確診為IgAN的60例患者(排除繼發性和遺傳性IgAN)根據蛋白尿程度進行分組，分為輕度蛋白尿組(24 h尿蛋白定量≤1.0 g), 中度蛋白尿組(24 h尿蛋白定量1.0～3.0 g)和重度蛋白尿組(24 h尿蛋白定量≥3.0 g)。另取年齡性別相匹配的健康志愿者20例作為健康對照組。分別使用流式細胞儀和Realtime-PCR方法檢測外周血單個核細胞(PBMC)中TLR4蛋白和基因的表達, ELISA法檢測血清中趨化因子MCP-1和炎癥因子IL-6的水平。結果IgAN組患者PBMC中TLR4的蛋白和基因表達水平以及血清中MCP-1和IL-6的濃度均較健康對照組顯著增加(P均<0.05)。PBMC中TLR4的蛋白和基因表達水平隨著蛋白尿的嚴重程度而逐漸增高。直線相關分析提示PBMC中TLR4 mRNA的表達水平與24 h尿蛋白定量呈顯著正相關(r=0.855,P<0.05), 而與GFR呈負相關(r= -0.735,P<0.05)。MCP-1和IL-6的水平與PBMC中TLR4 mRNA的表達水平呈顯著正相關(r=0.746、0.821,P<0.05)。結論IgAN患者PBMC中存在TLR4的表達水平上調，與蛋白尿程度和腎功能水平密切相關。血清中趨化因子MCP-1和炎癥因子IL-6的水平也隨著PBMC中TLR4的表達水平升高而升高。TLR4可能通過調節機體趨化因子和炎癥因子的釋放介導了IgA腎病中的炎癥損傷。

IgA腎病; Toll樣受體4; 單核細胞趨化因子-1; 白介素-6; 固有免疫

免疫球蛋白A腎病(IgAN)是亞洲人群最常見的腎小球疾病，也是導致終末期腎病的重要病因[1]。IgAN的確切發病機制不明，遺傳、環境、免疫失調等多種因素參與其中。Toll樣受體4(TLR4)是一種重要的模式識別受體，通過識別多種外源性和內源性配體激活細胞內核轉錄因子從而釋放多種炎癥因子，是病原體感染后連接機體固有免疫和獲得性免疫的重要橋梁[2]。臨床上發現黏膜系統(如呼吸道、消化道、泌尿道)的感染(如細菌、病毒、不典型病原體等)往往能誘發或加重IgAN，因此作者推測TLR4可能參與了IgAN的發生。本研究通過觀察IgAN患者外周血單個核細胞(PBMC)中TLR4的表達水平及其相應的血清中趨化因子MCP-1和炎癥因子IL-6的水平，探討TLR4在IgAN發病中可能的作用機制。

1　資料與方法

1.1一般資料

選取2012年10月—2014年3月在上海交通大學醫學院附屬新華醫院腎臟科行腎穿刺活檢確診的IgAN患者60例(男36例，女24例)作為病例組。患者同時需符合以下條件: ① 腎活檢前3個月內未使用過激素和免疫抑制劑; ② 除外紫癜性腎炎、狼瘡性腎炎、乙肝/丙肝病毒相關性腎炎等繼發性IgAN以及家族遺傳性IgAN; ③ 無活動性感染性疾病; ④ 年齡18～60歲。根據24 h尿蛋白定量結果將IgAN患者分為3組: 輕度蛋白尿組(24 h尿蛋白定量≤1.0 g), 中度蛋白尿組(24 h尿蛋白定量1.0～3.0 g)和重度蛋白尿組(24 h尿蛋白定量≥3.0 g)。另選取20例(男10例，女10例)年齡性別相匹配的健康志愿者(既往無糖尿病，高血壓，心腦血管疾病、肝臟疾病、腎臟疾病的疾患)作為對照組。所有患者均簽署知情同意書，經醫院倫理委員會批準。

1.2研究方法

所有IgAN患者和健康對照者于晨起空腹采靜脈血，用德國Bayer公司生產的全自動生化儀檢測血糖、腎功能(包括尿素氮，肌酐和血尿酸)、血清IgA、補體C3等生化指標。用酶聯免疫吸附(ELISA)法檢測MCP-1和IL-6的水平(試劑盒購于北京晶美生物工程有限公司)。留取24 h尿液計算24 h尿蛋白定量。99mTc-DTPA核素法測定腎小球濾過率(GFR)。

1.2.1采用聚蔗糖-泛影葡胺密度梯度離心法分離人外周血單個核細胞(PBMC): 抽取患者和健康對照者新鮮靜脈血5 mL于肝素抗凝管，加等體積的生理鹽水稀釋，吸取淋巴細胞分離液5 mL(購于天津灝洋生物制品科技有限責任公司)，置于15 mL離心管中，然后小心地將2倍體積的稀釋血加在淋巴細胞分離液上, 2 000 r/min離心25 min, 小心吸出分層液與血漿交界處的灰白色渾濁層即為PBMC, PBS洗滌2次，臺盼藍拒染法測得活細胞>95%。

1.2.2流式細胞儀檢測PBMC中TLR4的表達: 取新鮮肝素抗凝全血各100 μL, 按試劑說明書，分別加入20 μL單克隆抗體CD14-FITC/TLR4-PE及相應的同型陰性對照小鼠抗人IgG1-FITC(熒光標記抗體購自美國Beckman Coulter公司)，混勻后室溫下避光反應15 min后，加入1 mL紅細胞溶解素(購自北京晶美基因谷科技有限公司), 37 ℃水浴約10 min, 待完全溶血后，立即上流式細胞儀檢測。在Ex-po32ADC軟件下檢測和分析數據。

1.2.3PBMC中TLR4 mRNA的測定: 參照說明書用Trizol試劑從分離的細胞中抽提約5×106個PBMCs的總RNA。以無模板的PCR產物為陰性對照。Trizol試劑、dNTP Mix、Rnasin、逆轉錄酶及緩沖系統、Taq DNA聚合酶及緩沖系統均購自美國Sigma公司。引物設計參照文獻, TLR4上游引物為: 5′-AAGTGTCTGAACTCCCTCCA-3′; 下游引物為: 5′-TCATTCCTTAC CCAGTCCTC-3′; 擴增片段452 bp。β-actin上游引物為: 5′-CCGCGAGAAGATGACCCAGA-3′; 下游引物為: 5′-GCCGTGGTGGTGAAGCTGTA-3′, 擴增片段269 bp。引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。

1.2.4相關性分析: 將IgAN患者PBMC中TLR4mRNA的表達水平與24 h尿蛋白定量和GFR進行相關性分析。將血清中MCP-1和IL-6的水平與PBMC中TLR4mRNA的表達水平進行Pearson相關性分析。

1.3統計學方法

所有數據采用平均數±標準差表示，兩組資料的比較采用t檢驗，多組間比較采用方差分析。相關性采用Pearson相關分析。由SPSS 10.0版軟件進行統計學分析，P<0.05表示差異具有統計學意義。

2　結　果

2.1各組間臨床指標的比較

各組患者的年齡、性別無顯著差異。IgAN組較健康對照組24 h尿蛋白定量水平顯著升高(P均<0.05)。根據不同蛋白尿水平進行分組，重度蛋白尿組患者與正常對照組以及輕度蛋白尿組患者相比，血壓(收縮壓和舒張壓)和血清IgA/C3水平顯著升高，而GFR和血清白蛋白水平顯著降低(P均<0.05)。見表1。

表1　各組臨床資料和生化指標

與正常對照組比較, △P<0.05; 與輕度蛋白尿組比較, *P<0.05。

2.2PBMC中的TLR4表達水平

流式細胞儀檢測的PBMC中TLR4的蛋白表達水平在IgAN組患者中較在健康對照組中顯著升高(P均<0.05)，見圖1。IgAN患者PBMC中TLR4的表達水平隨著蛋白尿嚴重度增加而逐漸升高。流式細胞儀檢測的TLR4蛋白的熒光陽性比例: 輕度蛋白尿組(12.38±3.29)%, 中度蛋白尿組(19.52±5.71)%，重度蛋白尿組(30.15±9.25)%。RT-PCR法檢測的TLR4 mRNA水平: 輕度蛋白尿組4.04±0.83, 中度蛋白尿組8.49±2.66, 重度蛋白尿組15.89±4.37。見表2。

圖1　流式細胞儀檢測IgAN組和正常對照組患者PBMC中TLR4的表達水平

與正常對照組比較, △P<0.05; 與輕度蛋白尿組比較, *P<0.05; 與中度蛋白尿組比較, #P<0.05。

2.3血清MCP-1和IL-6的濃度

IgAN組患者較健康對照組血清中MCP-1和IL-6的水平顯著升高(P均<0.05)。IgAN患者血清中MCP-1和IL-6的濃度隨著蛋白尿水平增加而逐漸升高，差異具有統計學意義(P均<0.05)。見表2。

2.4相關性分析

將TLR4的表達水平與24 h尿蛋白定量和GFR水平分別進行相關性分析，結果提示IgAN患者PBMC中TLR4 mRNA的表達水平與24 h尿蛋白定量呈顯著正相關(r=0.855,P<0.05), 而與GFR呈負相關(r=-0.735,P<0.05)。將血清MCP-1和IL-6的濃度與PBMC中TLR4 mRNA的表達水平進行相關性分析，結果提示血清MCP-1和IL-6的水平與TLR4mRNA的表達水平呈顯著正相關(r=0.746、0.821,P均<0.05)。

3　討　論

IgAN是亞洲國家最常見的原發性腎小球疾病。由于多種因素參與了IgAN的發生和發展，而其確切的發病機制仍不清楚，因此IgAN的臨床表現和病理表現異質性很高。臨床研究發現IgAN患者的血清中存在與環境中抗原起反應的IgA, 腎小球中存在與扁桃體起交叉反應的IgA的沉積，且沉積在系膜區的主要是典型的黏膜免疫反應產物多聚體IgA和分泌型IgA[3]。動物研究發現多種病原體(如仙臺病毒、流感嗜血桿菌、細小病毒，柯薩奇病毒、金黃色葡萄球菌、巨細胞病毒、EB病毒和幽門螺桿菌等)通過不同途徑可以誘發出類似IgAN病理改變的腎臟損傷[4-6]。臨床上觀察到黏膜感染(尤其是上呼吸道感染和化膿性扁桃體炎)往往是IgAN發生或加重的誘因。這些結果均提示病原體感染與誘發IgAN發病密切相關，但病原體感染后誘發IgAN的具體機制并不清楚。人體內面積約400 m2的黏膜的固有免疫系統是機體抵抗外源性病原體入侵的第一道防線。Toll樣受體(TLR)是一種重要的模式識別受體，在抗感染時黏膜的固有免疫中發揮重要作用，也控制著機體由固有免疫向獲得性免疫的轉變[7-8]。目前至少已經報道了十多種人TLR亞型，而TLR4是TLR家族中的重要成員，通過識別多種外源性配體(如革蘭陰性細菌胞壁的脂多糖LPS)和內源性配體(如: 纖維連接蛋白，熱休克蛋白、纖維蛋白原等)激活細胞內核轉錄因子(NF-κB)信號通路，導致粘附分子、炎癥因子、趨化因子、促凝血因子和縮血管因子等多種細胞因子的產生和釋放，在介導體內的炎癥反應中發揮重要作用[9]。已有研究[10-14]發現TLR4激活參與了內毒素誘導的急性腎損傷、腎間質纖維化、腎移植排斥反應、抗體介導的腎小球腎炎、糖尿病腎病等眾多腎臟疾病的發病過程，但IgAN的發病機制中是否有TLR4的參與相關報道很少。有體外研究[15-18]發現TLR4被外源性配體細菌LPS激活后，誘導Cosmc(IgA1分子糖基化相關的β-1，3半乳糖轉移酶的分子伴侶)甲基化，導致IgA1分子糖基化水平降低。最近又有一項體外研究[16]報道在刺激的系膜細胞中, TLR4mRNA和蛋白表達增加與蛋白激酶信號傳導途徑有關。

本研究結果顯示, IgAN患者外周血單個核細胞中TLR4的蛋白和基因表達水平均較健康對照組顯著增加，并且TLR4的表達水平隨著蛋白尿的嚴重程度而逐漸增高，差異具有統計學意義。直線相關分析顯示PBMC中TLR4 mRNA的表達水平與24 h尿蛋白定量呈顯著正相關，與GFR呈負相關。這些結果提示IgAN患者的血循環中存在TLR4的激活，TLR4的活化程度與蛋白尿的程度和腎功能情況密切相關。由于起病時的血壓水平、蛋白尿水平、腎功能以及腎活檢的病理評分(牛津分型的MEST評分)是目前公認的決定IgAN患者預后的重要因素，因此檢測血循環中的TLR4將來也有望成為判斷IgAN嚴重程度和預后的一個無創性生物標志物。本組資料結果還顯示IgAN患者血清中趨化因子MCP-1和炎癥因子IL-6的水平均較健康對照組顯著增加，IgAN患者血清中MCP-1和IL-6的濃度隨著蛋白尿水平增加而逐漸升高，三組之間比較差異具有統計學意義。直線相關分析顯示IgAN患者血清MCP-1和IL-6的水平與PBMC中TLR4mRNA的表達水平呈顯著正相關。這些結果就提示了IgAN患者血循環中趨化因子和炎癥因子的水平與PBMC中TLR4的激活密切相關。由此作者推測病原體感染機體后可能通過激活PBMC中的TLR4引起趨化因子和炎癥因子等細胞因子釋放，細胞因子隨著血循環聚集在腎小球導致系膜區局部的炎癥反應繼而引起系膜細胞和系膜基質增生。既往有研究證實炎癥因子反過來也可能通過激活腎臟固有細胞(腎小球系膜細胞、足細胞和腎小管上皮細胞)上的TLR4進一步加重腎臟局部的炎癥反應和腎臟損害，形成惡性循環，由此介導了IgAN的發生發展[19-21]。但本實驗由于僅僅檢測了外周血中TLR4、MCP-1和IL-6的表達，尚未在體內的腎組織和體外的細胞試驗中驗證TLR4與炎癥反應的細胞因子之間的關系。因此，本課題組下一步擬在腎活檢的組織標本中進一步探討IgAN患者腎組織中TLR4的表達與腎臟局部炎癥因子表達之間的關系。

綜上所述，本研究結果證實IgAN患者的血循環中存在TLR4的激活, IgAN患者PBMC中TLR4的表達水平與蛋白尿程度和腎功能水平密切相關。血清中炎癥反應的相關細胞因子MCP-1和IL-6的水平隨著PBMC中TLR4的水平升高而升高。TLR4可能通過調節機體炎癥因子的釋放介導了IgAN中的炎癥反應和腎臟損傷。這為固有免疫在IgAN發病中的作用奠定了一定理論基礎。

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Expression of Toll-like receptor 4 and level of inflammation cytokine IL-6 and chemokine MCP-1 in peripheral blood mononuclear cells of patients with IgA nephropathy

LONG Quan1, ZHU Chun2, 3, ZOU Jun3, LIU Xiuying3, JIANG Gengru3

(1.DepartmentofNephrology,ShanghaiInternationalMedicalCenter,Shanghai, 201318; 2.DepartmentofNephrology,ChongmingBranchofXinhuaHospitalAffiliatedtoMedicalCollegeofShanghaiJiaotongUniversity,Shanghai, 202150; 3.DepartmentofNephrology,XinhuaHospitalAffiliatedtoMedicalCollegeofShanghaiJiaotongUniversity,Shanghai, 2000920)

ObjectiveTo explore the expression of Toll-like receptor 4 in peripheral blood mononuclear cells (PBMC) and serum concentration of chemokine MCP-1 and inflammation cytokine IL-6 in patients with IgA nephropathy. MethodsA total of 60 patients with IgAN confirmed by renal biopsy were divided into three groups according to 24 h proteinuria, which were mild proteinuria group, morderate proteinuria group and severe proteinuria group. Patients with secondary and hereditary IgAN were excluded. Another 20 healthy volunteers were selected as control group. Protein and gene expression of TLR4 in PBMC were evaluated with flow cytometry and real time-PCR respectively. Levels of MCP-1 and IL-6 were measured by commercial ELISA kit. ResultsExpression of TLR4 in PBMC and levels of MCP-1 and IL-6 in circulation were significantly higher in IgAN group than in

IgA nephropathy; Toll-like receptor 4; MCP-1; IL-6; innate immunity

2016-06-05

上海交通大學醫學院附屬新華醫院科研基金資助(12QYJ06)

朱淳, E-mail: zhuchun26@sina.cn

R 692

A

1672-2353(2016)19-023-05DOI: 10.7619/jcmp.201619007

control group (P<0.05). Protein and gene expression of TLR4 in PBMC increased with the severity of proteinuria (P<0.05). The Pearson correlation coefficient analysis suggested that gene expression of TLR4 in PBMC was positively correlated with 24 h urinary protein excretion (r=0.855,P<0.05), but negatively correlated with GFR (r=-0.735,P<0.05). Serum concentration of MCP-1 and IL-6 were positively correlated with gene expression of TLR4 in PBMC (r=0.746, 0.821,P<0.05). ConclusionExpression of TLR4 in PBMC and levels of MCP-1 and IL-6 in circulation are all up-regulated in patients with IgAN. Expression of TLR4 in PBMC is closely related with the severity of proteinuria and renal function. These findings suggest that TLR4 may mediate inflammatory injury of IgAN by releasing inflammation cytokine and chemokine.