CyclinD1、p16INK4在低度惡性子宮內膜間質肉瘤中的表達

強　賢, 范欽和, 唐正華, 張　琪

(1. 南京醫科大學第一附屬醫院 病理科, 江蘇 南京, 210029;2. 南京醫科大學附屬常州婦幼保健院 病理科, 江蘇 常州, 213003;3. 南京醫科大學附屬無錫婦幼保健院 病理科, 江蘇 無錫, 214002)

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CyclinD1、p16INK4在低度惡性子宮內膜間質肉瘤中的表達

強賢1, 2, 范欽和1, 唐正華2, 張琪3

(1. 南京醫科大學第一附屬醫院 病理科, 江蘇 南京, 210029;2. 南京醫科大學附屬常州婦幼保健院 病理科, 江蘇 常州, 213003;3. 南京醫科大學附屬無錫婦幼保健院 病理科, 江蘇 無錫, 214002)

目的探討低度惡性子宮內膜間質肉瘤(LGESS)組織中CyclinD1、p16INK4的表達。方法采用免疫組織化學法檢測36例手術切除后經病理確診的LGESS瘤組織中CyclinD1和p16INK4蛋白的表達，分析它們與臨床病理特征和預后的關系。結果CyclinD1、p16在LGESS中的表達率分別為47%、39%, 且它們的表達與患者的年齡、是否絕經、孕產次、腫瘤大小、肌層浸潤深度、是否脈管侵犯、有無淋巴結轉移均無相關性，但CyclinD1與臨床手術病理分期及LGESS預后有關(P<0.05)。結論CyclinD1陽性表達的低度惡性子宮內膜間質肉瘤與腫瘤侵襲性的臨床行為有關。

低度惡性子宮內膜間質肉瘤; CyclinD1; p16INK4; 免疫組織化學; 預后

子宮內膜間質腫瘤是少見的起源于子宮的間葉性腫瘤，約占女性惡性腫瘤的0.2%[1]，其中低度惡性子宮內膜間質肉瘤表現為具有低度惡性潛能的臨床過程，預后相對較好，少有復發和遠處轉移。但仍有大量文獻[2]證實許多低度惡性子宮內膜間質肉瘤患者在手術切除后發生復發轉移或死亡。雖然大多數低度惡性子宮內膜間質肉瘤患者確診后經過手術治療，臨床分期為I期，即腫瘤局限于子宮內，未侵及周圍組織，但幾年后有1/3的患者出現盆腔內復發或遠處器官轉移。有文獻報道CyclinD1、p16INK4表達的低度惡性子宮內膜間質肉瘤是一種新的亞型，代表該腫瘤的生物學行為更具侵襲性[3]。作者通過檢測CyclinD1、p16INK4在低度惡性子宮內膜間質肉瘤中的表達，分析其與腫瘤臨床病理因素及預后的關系，探討CyclinD1、p16INK4表達在低度惡性子宮內膜間質肉瘤的預后評估中的意義，報告如下。

1　材料與方法

1.1臨床資料

選取南京醫科大學附屬常州婦幼保健院23例及無錫市婦幼保健院13例低度惡性子宮內膜間質肉瘤組織標本，均具有詳細生存期跟蹤隨訪資料，標本為2003年7月—2013年6月手術切除后病理證實為低度惡性子宮內膜間質肉瘤的存檔蠟塊。診斷由2位病理醫生重新閱片完成，診斷結果一致。36例患者，發病年齡 35～61歲，平均45歲，因不規則陰道出血或月經改變作為首發癥狀，其余則因體檢發現。所有患者均在診斷后行全子宮、雙附件切除及盆腔淋巴結清掃手術，術前未行其他治療，包括激素治療及放化療。手術病理分期：I期(未侵出子宮體)25例，II期(累及宮旁或附件)10例，Ⅲ期(累及腹腔或淋巴結有轉移)1例。有淋巴結轉移的病例為1例，其余均無淋巴結轉移。見表1。

1.2主要試劑

鼠抗人CyclinD1、p16INK4單克隆抗體購自北京中杉金橋公司。

1.3免疫組化染色和判定標準

在美國羅氏公司BenchMarkXT全自動免疫組織化學染色機上進行。操作步驟均嚴格按照羅氏診斷優化程序進行。基本過程如下: 4 μm切片脫蠟, 3%H2O2阻斷內源性過氧化物酶活動，抗原修復，滴加10%正常山羊血清封閉非特異染色后，順序加一抗、二抗室溫靜置1 h后, DAB染色，蘇木精對比染色，常規脫水、透明、封片，光鏡下觀察結果。選擇已知陽性染色的切片作陽性對照，以PBS代替一抗作為陰性對照。由2位醫生獨立判定結果。染色結果判定: CyclinD1以大于5%的腫瘤細胞核內棕黃色顆粒判定為陽性染色[4]。p16INK4以腫瘤細胞核內出現清晰棕黃色顆粒為陽性細胞，陽性細胞數大于10%為陽性，小于10%為陰性[5]。

表1　36例患者臨床病理特征[n(%)]

2　結　果

2.1CyclinD1、p16INK4在低度惡性子宮內膜

間質肉瘤中的表達

CyclinD1、p16INK4在子宮內膜間質肉瘤中的陽性表達率分別為47%(17/36)，39%(14/36)，其中5例CyclinD1彌漫強表達，3例p16彌漫表達，陽性細胞數達60%以上，其余陽性細胞數為5～20%，多表達在血管周圍的腫瘤細胞。3例較早復發的病例均示CyclinD1彌漫強表達。

2.2CyclinD1、p16INK4與臨床病理學特征的

關系

患者的年齡、是否絕經、孕產次、腫瘤大小、肌層浸潤深度、是否脈管侵犯、有無淋巴結轉移與CyclinD1、p16INK4的表達均無明顯差異。但CyclinD1的表達與臨床手術病理分期有關, 5例CyclinD1彌漫陽性表達的病例中，3例為Ⅱ期，1例為Ⅲ期，1例為Ⅰ期。而p16INK4與之無關。見表2。

表2　CyclinD1、p16與分期的關系

2.3CyclinD1與p16INK4表達的關系

本研究36例子宮內膜間質肉瘤標本中，17例CyclinD1表達陽性，其中12例p16同時表達陽性，而22例p16表達陰性中，17例CyclinD1表達陰性。二者表達呈正相關性。

2.4CyclinD1、p16INK4與預后的關系

全部病例獲得隨訪，時間為60個月。本組36例患者中，15例復發，復發率為41.7%，復發時間為 4～60個月，中位復發時間29個月，最早復發的3例分別是手術后4個月、7個月、11個月，其余患者均在初治后1年半以上復發。復發部位均在盆腔內(包括盆腔淋巴結轉移)，無死亡病例。復發后行手術切除，輔助放化療，目前情況良好。

15例復發轉移病例中，12例示CyclinD1表達陽性，3例示CyclinD1表達陰性，提示CyclinD1與復發有相關性。p16與復發轉移無相關性。12例兩者共同表達的病例中，6例發生復發轉移。見表3。

表3　CyclinD1、p16與預后的關系

3　討　論

傳統上，將ESS分為低級別子宮內膜間質肉瘤(LGESS)和高級別子宮內膜間質肉瘤(HGESS), 而2003版WHO分類認為HGESS缺乏特異性分化，并且組織學不同于子宮內膜間質，故將其命名為未分化肉瘤。Shuichi K等[6]將ESS分為3組進行研究，即低級別子宮內膜間質肉瘤(LGESS), 不伴核多形的未分化子宮內膜肉瘤(UES-U)和伴有核多形的未分化子宮內膜肉瘤(UES-P), 主要依據腫瘤細胞是否出現明顯的不典型性及多形性、腫瘤性壞死為基礎。但是，近來認為只有LGESS才是子宮內膜間質肉瘤，包括傳統意義的LGESS和大部分的UES-U, 因為有研究[7]認為這兩者具有相同的分子免疫表型。而HGESS被認為是未分化的子宮肉瘤即UES-P, 因為它無論從腫瘤細胞的形態學或分子生物學均不顯示子宮內膜間質的分化證據，且無激素受體的表達。而本文診斷的LGESS均在一定程度上顯示子宮內膜間質分化的特點，腫瘤細胞類似正常子宮內膜間質細胞，細胞大小形態較一致，無明顯核異型或伴有輕-中度異型，常見腫瘤細胞圍繞螺旋小動脈樣結構呈漩渦狀生長，部分病例局灶區域出現明顯核異型，核增大，染色質增多，可見小核仁，但核大小相對一致。核分裂相多小于4個/10HPF, 個別病例核分裂相>10個/10HPF。腫瘤細胞呈巢狀或島狀增生，不規則狀浸潤子宮肌壁間。其中1例灶區可見腫瘤性壞死，有輕到中度異型性，但腫瘤細胞具有一致性，能找到螺旋小動脈樣結構，免疫組化顯示激素受體陽性，CD10陽性或局灶陽性。但UES-P和瘤細胞呈現重度異型的那部分UES-U仍劃分到HGESS中。因此，可能會將之前診斷為HGESS的一部分病例納入作者診斷的LGESS中。

本研究結果顯示, CyclinD1、p16在LGESS中的表達率分別為47%、39%，且它們的表達與患者的年齡、是否絕經、孕產次、腫瘤大小、肌層浸潤深度、是否脈管侵犯、有無淋巴結轉移均無相關性，但CyclinD1表達與LGESS臨床手術病理分期和預后有關，而p16與手術分期和預后無關。提示CyclinD1會使腫瘤細胞的生長能力發生改變。進一步分析他們與預后的關系發現CyclinD1與預后不良有關，容易發生復發，因此CyclinD1可以作為潛在的生物學標志物，成為LGESS預后評估與指導治療的重要指標。通常作者認為淋巴結轉移提示預后不好，但CyclinD1的表達與預后有關，卻與淋巴結轉移無關，這可能與作者收集的病例有關，收集的病例中發生淋巴結轉移的只有1例，且這1例顯示CyclinD1、p16陽性表達。Shuichi K[8]研究結果顯示CyclinD1在LGESS中表達率只有5%，在UES-U中表達率高達85%，這可能與LGESS診斷標準不一樣有關。本文p16表達率與Park JY[9]的研究結果一致，并且病例選擇標準一致，均顯示p16與預后無關。

CyclinD1和p16均屬于G1周期重要調節蛋白，研究[10]表明, CyclinD1是一種癌基因產物，在不同組織起源的多種腫瘤中過度表達，促進腫瘤細胞增殖。而p16則為一種抑癌基因，有抑制細胞增殖的作用。認為兩者均陽性表達的腫瘤中，其導致腫瘤發生的原因可能與CyclinD1蛋白表達超過p16蛋白的生物效應而使Rb蛋白處于持久磷酸化狀態有關，從而使Rb蛋白對細胞生長的抑制效應失活。本研究結果顯示兩者的表達具有相關性，可能是CyclinD1表達的明顯增加促使與之相拮抗的p16表達增加。但兩者共同表達的病例中，僅有6例發生復發轉移，提示p16可能削弱CyclinD1的作用，而CyclinD1的單獨作用與預后關系更大。近來，關于CyclinD1在子宮內膜間質肉瘤中表達已有報道，尤其在UES-U中呈現高表達。有報道[11]顯示CyclinD1是伴YWHAE-FAM22基因重排子宮內膜間質肉瘤的一種診斷性免疫標記物，而伴YWHAE-FAM22基因重排的子宮內膜間質肉瘤是一種預后較差的腫瘤亞型。而Bharat R報道了CyclinD1和p16陽性表達的子宮內膜間質肉瘤，認為它是一個新的亞型，更具有侵襲性和不良預后，指出在低級別子宮內膜間質肉瘤中CyclinD1和p16陽性表達與侵襲性臨床行為有密切關系。p16也常表達在UES中，提示腫瘤更具侵襲行為[12]。這與作者的實驗結果一致。CyclinD1在UES-P中幾乎不表達，因此認為UES-P不屬于子宮內膜間質肉瘤，而應歸為子宮未分化肉瘤。所以認為將CyclinD1也作為鑒別子宮內膜間質肉瘤及未分化肉瘤的重要免疫指標。

[1]Nam J H. Surgical treatment of uterine sarcoma[J]. Best Pract Res Clin Obstet Gynaecol, 2011, 25(6): 751-60.

[2]Park J Y, Kim D Y, Kim JH, et al. The impact of tumor correlation during surgery on the outcomes of patients with apparently early low-grade endometrial stromal sarcoma of the uterus[J]. Ann Surg Oncol, 2011, 18(12): 3453-61.

[3]Rekhi B1, Motghare P. Cyclin D1 and p16INK4 positive endometrial stromal sarcoma: a case report with new insights[J]. Indian J Pathol Microbiol, 2014, 57(4): 606-8.

[4]Saito T1, Oda Y, Tanaka K, et al. beta-catenin nuclear expression correlates with cyclin D1 overexpression in sporadic desmoid tumours[J]. J Pathol, 2001, 195(2): 222-8.

[5]Park J Y1, Kim K R, Nam J H. Immunohistochemical analysis for therapeutic targets and prognostic markers in low-grade endometrial stromal sarcoma[J]. Int J Gynecol Cancer, 2013, 23(1): 81-9.

[6]Popiolek D1, Yee H, Levine P. MIB1 as a possible predictor of recurrence in low-grade endometrial stromal sarcoma of the uterus[J]. Gynecol Oncol, 2003, 90(2): 353-7.

[7]Kurihara S1, Oda Y, Ohishi Y, et al. Endometrial stromal sarcomas and related high-grade sarcomas: immunohistochemical and molecular genetic study of 31 cases[J]. Am J Surg Pathol, 2008, 32(8): 1228-38.

[8] Kurihara S1, Oda Y, Ohishi Y, et al. Coincident expression of beta-catenin and cyclin D1 in endometrial stromal tumors and related high-grade sarcomas[J]. Mod Pathol, 2010, 23(2): 225-34.

[9]Park J Y1, Kim K R, Nam J H. Immunohistochemical analysis for therapeutic targets and prognostic markers in low-grade endometrial stromal sarcoma[J]. Int J Gynecol Cancer, 2013, 23(1): 81-9.

[10]Ewen M E1, Lamb J. The activities of cyclin D1 that drive tumorigenesis[J]. Trends Mol Med, 2004, 10(4): 158-62.

[11]Lee C H1, Ali R H, Rouzbahman M, et al. Cyclin D1 as a diagnostic immunomarker for endometrial stromal sarcoma with YWHAE-FAM22 rearrangement[J]. Am J Surg Pathol, 2012, 36(10): 1562-70.

[12]Ivy Chew, Esther O. Endometrial Stromal Sarcomas: A Review of potential prognostic factors[J]. Adv Anat Pathol, 2010, 17(2): 113-121.

Expression of CyclinD1, p16INK4 proteins in low-gradeendometrial stromal sarcoma

QIANG Xian1, 2, FAN Qinhe1, TANG Zhenghua2, ZHANG Qi3

(1.DepartmentofPathology,TheFirstAffiliatedHospitalofNanjingMedicalUniversity,Nanjing,Jiangsu, 210029; 2.DepartmentofPathology,ChangzhouMaternalandChildHealthCareHospitalAffiliatedtoNanjingMedicalUniversity,Changzhou,Jiangsu, 213003; 3.DepartmentofPathology,WuxiMaternalandChildHealthCareHospitalAffiliatedtoNanjingMedicalUniversity,Wuxi,Jiangsu, 214002)

ObjectiveTo explore the expression of CyclinD1, p16INK4 proteins in low-grade endometrial stromal sarcoma tissues. MethodsThe expression of CyclinD1, p16INK4 proteins in 36 cases of LGESS was detected by immunohistochemical method. The correlations between the two proteins, clinicopathological factors and the prognosis were analyzed. ResultsExpression rates of CyclinD1, p16INK4 proteins in LGESS were 47%, 39% respectively, and there were no significant correlations between the expression of the two proteins and age, menopause, parity, tumor size, depth of myometrial invasion, lymphovascular space invasion and lymph node metastasis. CyclinD1 protein expression was associated with FIGO stage and the prognosis of LGESS (P<0.05). ConclusionThe positive expression of CyclinD1 in LGESS might be associated with clinical aggressive behavior of tumor.

low-grade endometrial stromal sarcoma; CyclinD1; p16INK4; immunohistochemical method; prognosis

2016-06-05

范欽和, E-mail: fanqinhe@aliyun.com

R 737.33

A

1672-2353(2016)19-061-04DOI: 10.7619/jcmp.201619018