可視化蛋白芯片法同時檢測牛乳中殘留的磺胺類和喹諾酮類藥物

鐘文英，王興如，許丹科，李鐘卉，李周敏

（1.中國藥科大學理學院分析化學教研室，江蘇 南京 211198；2.南京大學化學化工學院，生命分析化學國家重點實驗室，江蘇 南京 210093）

可視化蛋白芯片法同時檢測牛乳中殘留的磺胺類和喹諾酮類藥物

鐘文英1，王興如1，許丹科2,*，李鐘卉2，李周敏2

（1.中國藥科大學理學院分析化學教研室，江蘇 南京 211198；2.南京大學化學化工學院，生命分析化學國家重點實驗室，江蘇 南京 210093）

目的：利用可視化蛋白芯片分析技術對牛乳中磺胺類和喹諾酮類抗生素多殘留的同時檢測。方法：采用間接競爭法反應原理，將磺胺類和喹諾酮類藥物的人工抗原以微陣列形式固定于微孔板底部，制備成微孔板生物芯片陣列，并依次與磺胺類和喹諾酮類單克隆抗體、納米銀標記羊抗鼠IgG反應，最后用納米銀增強法顯色，并采用可視化芯片掃描儀對微孔板顯色結果進行快速掃描成像，圖像采用芯片分析軟件處理。結果：本法磺胺嘧啶和恩諾沙星線性范圍為分別為0.3～7.2 ng/mL和0.4～18 ng/mL。空白牛乳中加標磺胺嘧啶（0.5、2.0、5.0 ng/mL）和恩諾沙星（0.5、3.0、15.0 ng/mL），結果牛乳中2 種藥物的加標回收率分別為83%～110%，且相對標準偏差均在10%以內。結論：本法能夠用于牛乳樣本中磺胺類和喹諾酮類藥物的殘留的快速初篩。

蛋白質芯片；間接競爭法；多殘留檢測；磺胺類藥物；喹諾酮類藥物

為了控制動物疾病的發生，養殖過程中會有多種藥物同時或交替使用的情況，這就導致了藥物多殘留的發生。磺胺類和喹諾酮類藥物均為廣譜抗菌藥，常被用于奶牛養殖業中。但是過量使用會導致其在奶牛體內蓄積，進而殘留在牛乳中，最終會影響人類的健康。磺胺類藥物的半衰期較長，容易在人體中蓄積而對人體產生很多危害，如藥物過敏性反應、影響造血系統、損傷泌尿系統和耐藥性[1]。喹諾酮類藥物會對中樞神經系統消化道反應、過敏反應、血液系統造成不良反應[2]。因此，很多國家對磺胺類和喹諾酮類藥物的使用及其在動物源性食品中的殘留做了嚴格的規定。我國農業部2002年規定了獸用磺胺類藥物最高殘留限量100 μg/kg，牛、雞、豬、羊、兔等動物的肌肉、脂肪、肝、腎食品中達氟沙星、恩諾沙星等喹諾酮類獸藥最高殘留限量10～1 900 μg/kg[3-4]。

磺胺類和喹諾酮類藥物殘留的分析方法[5-6]主要有免疫法[4]、微生物法[7-8]和色譜法[7,9]等。免疫法中酶聯免疫吸附（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）測定及膠體金試紙條技術作為一種快速、方便、低成本、高通量的篩選手段，廣泛應用于眾多領域，但是ELISA[6,8]只能檢測單組分殘留，而膠體金試紙條技術[7]容易出現高的假陽性率或假陰性率。微生物法的優點是操作簡便、成本低、檢測快速，但靈敏度不高，特異性差。色譜法然精確，但是存在設備昂貴、技術操作復雜、前處理繁鎖、檢測時間長及費用高等缺點，決定其不適于大規模的現場快速檢測。蛋白芯片法具有高通量、檢測時間短、特異性高、操作簡單、成本低等優點，在國內外的研究中被廣泛應用于臨床監測、食品監測、病毒監測等領域[10-23]。

本研究建立了一種可同時檢測牛乳中磺胺類和喹諾酮類藥物多殘留的可視化蛋白芯片法通過對抗原質量濃度、抗體質量濃度、納米銀標記羊抗鼠IgG用量等條件的優化，考察了方法的檢出限、回收率和線性范圍等，獲得了良好的分析結果。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

磺胺類單克隆抗體、磺胺類人工抗原、磺胺嘧啶對照品（USP Grade）、喹諾酮類單克隆抗體、喹諾酮類人工抗原、恩諾沙星對照品（USP Grade）、納米銀標記的羊抗鼠IgG、納米銀增強顯色液 南京祥中生物科技有限公司。

1.2 儀器與設備

點樣儀 清華大學自主研制；Q-array2000可視化生物芯片掃描儀、多管渦旋混旋儀、恒溫孔板振蕩儀 南京祥中生物科技有限公司；KQ218型超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司；單道可調移液器 蘇州百得實驗室儀器有限公司；微孔板 南京祥中生物科技有限公司；顯色液A、顯色液B 美國Sigma公司。

1.3 方法

1.3.1 人工抗原的固定與封閉

本實驗所用抗原為磺胺類-牛血清蛋白（bovine serum albumin，BSA）和喹諾酮類-BSA偶聯物。用生物芯片點樣儀在96微孔板上根據需要制備不同規格的矩陣，分別點不同質量濃度的抗原，點樣量為50 nL/點，每樣分別重復3 個點，點樣結束后，將芯片放于37 ℃恒溫箱里孵育2 h，使人工抗原固定于板底。每孔加入200 μL的芯片封閉液（含1% BSA的0.01 mol/L的磷酸鹽緩沖溶液（phosphate-buffered saline，PBS）），放于37 ℃恒溫箱里孵育2 h，然后用0.1%的PBST（含Tween-20的PBS）洗3 次，每次10 s，拍干，置于4 ℃待用。

1.3.2 微孔板生物芯片的分析檢測

制備好的板內每孔加入25 μL的磺胺嘧啶和恩諾沙星混合標準品和25 μL的磺胺類和喹諾酮類混合單克隆抗體，放于37 ℃恒溫箱里孵育30 min，然后用PBST洗3 次，每次10 s，拍干。每孔加入50 μL的納米銀標記的羊抗鼠IgG，放于37 ℃恒溫箱里孵育30 min，然后用PBST洗3 次，每次10 s，拍干。再在每孔加入50 μL的銀增強顯色劑（顯色液A+顯色液B體積比1∶1混合，現配現用），放于37 ℃恒溫箱里孵育15 min，然后用PBST洗3 次，每次10 s，拍干。利用可視化生物芯片掃描儀進行掃描，并利用芯片分析軟件進行結果處理分析。

1.3.3 牛乳樣本前處理

取1 mL牛乳，加入6 mL乙酸乙酯，振蕩（2 400 r/min，3 min），然后離心（4 500 r/min，15 min）后吸取上層有機層3 mL，氮吹。加入1 mL正己烷振蕩（2 200 r/min，5 min），再加入500 μL復溶液振蕩（2 000 r/min，5 min）。轉入2 mL離心管中，離心（12 000 r/min，10 min），棄去上層有機相，取下層水相用于實驗。

2 結果與分析

2.1 抗原抗體質量濃度優化

采用正交試驗法優化。分別固定質量濃度為2.8、1.4、0.7、0.35 mg/mL磺胺類的抗原和質量濃度為3.6、1.8、0.9 mg/mL喹諾酮抗原，磺胺類單克隆抗體質量濃度為800、400、200、100 ng/mL，喹諾酮單克隆抗體的質量濃度為1 000、500、250、125 ng/mL。結果表明，抗原稀釋度增加孔內及孔間變異系數（coefficient of variation，CV）均會變大。低質量濃度抗體時靈敏度高，但是信號值偏低，會造成孔內CV會變大。檢測信號灰度值隨抗體質量濃度增大而增大，但抗體質量濃度過高時，信號飽和而使競爭失去意義，在綜合考慮檢測精密度和靈敏度的基礎上，最終確定磺胺類抗原質量濃度為0.7 mg/mL，抗體質量濃度為400 ng/mL，喹諾酮類抗原質量濃度為1.8 mg/mL，抗體質量濃度為500 ng/mL（表1、2）。

表1 磺胺類抗原抗體篩選Table 1 Screening of sulfonamides antigen and antibody

表2 喹諾酮類抗原抗體篩選Table 2 Screening of quinolones antigen and antibody

2.2 納米銀標記的羊抗鼠IgG工作濃度的優化

篩選濃度為1∶50、1∶100、1∶200、1∶400的納米銀標記的羊抗鼠IgG。納米銀標記羊抗鼠IgG的量在這個體系中不是決定性的因素，但濃度過小會導致檢測信號偏弱，增大了系統的誤差。結合實驗結果確定納米銀標記羊抗鼠IgG選1∶100稀釋度，可以得到較為滿意的實驗結果。

2.3 納米銀催化顯色劑顯色時間的優化

將銀增強顯色劑A液與B液按照體積比1∶1混合，每孔加入50 μL，分別顯色10、15、20 min。顯色過程中隨顯色時間的延長，0～10 min內信號值變化很小，10～15 min信號值緩慢增加，15 min以后信號值明顯增加，且孔板中溶液的顏色不斷加深，造成背景值也明顯的增加，信噪比降低。顯色10 min時，雖然背景信號值很低，信噪比較高，但是點陣的信號值偏低，綜合考慮，選擇信噪比較高的15 min為最佳顯色時間。

2.4 磺胺類和喹諾酮類特異性實驗

用間接競爭法分別測定抗磺胺類單克隆抗體與磺胺類藥物、抗喹諾酮類單克隆抗體與喹諾酮類藥物的交叉反應性，計算交叉反應率。

交叉反應率/%=（50%抑制磺胺嘧啶（恩諾沙星）的質量濃度/50%抑制磺胺（喹諾酮）類似物的質量濃度）×100

結果表明抗磺胺類抗體與9種磺胺類藥物、抗喹諾酮類抗體與8種喹諾酮類藥物的交叉反應率都達50%以上（表3）。

表3 抗磺胺類和喹諾酮類抗單克隆抗體的交叉反應率Table 3 Cross-reactivity of monoclonal antibodies against sulfonamidesand quinolones

2.5 磺胺類和喹諾酮類抗原抗體的特異性反應

通過將磺胺類抗體與喹諾酮抗原和不同質量濃度（0、1、18、40 ng/mL）恩諾沙星做交叉反應，以及喹諾酮類抗體與磺胺類抗原和不同質量濃度磺胺嘧啶（0、1.8、7.2、20 ng/mL）的交叉反應。結果如表4和5所示，磺胺類和喹諾酮類抗原抗體之間具有特異性反應，相互之間基本無交叉反應。

表4 磺胺類抗原抗體的特異性反應Table 4 Specificity of antibody against sulfonamides antigen

表5 喹諾酮類抗原抗體的特異性反應Table 5 Specificity of antibody against quinolones antigen

2.6 磺胺類和喹諾酮類二合一標準曲線的建立

探索磺胺類和喹諾酮類標準曲線采用間接競爭法。每個抗原質量濃度點印3 個平行微陣列點，信號值取其平均值。在一定范圍內，隨著競爭對照品質量濃度的增大，固定的人工抗原結合的抗體會越來越少，與其相結合的納米銀標記羊抗鼠IgG的量也將隨之減少，因而檢測到的灰度值信號就越低，超過這個范圍，檢測灰度值不隨競爭對照品的增大而變化。磺胺嘧啶對照品（0、0.3、0.9、1.8、3.6、7.2 ng/mL）與恩諾沙星對照品（0、0.4、1.0、2.4、6.0、18.0 ng/mL）混合溶液進行競爭抑制實驗，圖1a為同時檢測磺胺類和喹諾酮類蛋白芯片競爭抑制的掃描圖。采用Origin軟件對信號值與質量濃度對數（lgC）作競爭抑制曲線，如圖1b所示，磺胺類藥物的標準曲線線性范圍為0.3～7.2 ng/mL，喹諾酮類藥物的標準曲線線性范圍為0.4～18 ng/mL。

圖1 同時檢測磺胺類和喹諾酮類蛋白芯片競爭抑制掃描（a）和競爭抑制標準曲線（bb）Fig.1 Protein chip scanning images (a) and standard curves of competitive inhibition for simultaneous detection of sulfonamides and quinolones (b)

2.7 牛乳加標回收實驗結果

表6 磺胺類和喹諾酮類的加標回收率Table 6 Recoveries of sulfonamides and quinolones spiked into blank milk

在優化的實驗條件下，精確量取1 mL空白牛乳樣本，分別添加磺胺嘧啶（0.50、2.00、5.00 ng/mL）和恩諾沙星（0.50、3.00、15.00 ng/mL）的對照品，每個樣本測3 次。按照1.3.3節的方法處理后，質量濃度范圍內添加，磺胺類的回收率在85%～110%之間，喹諾酮類的回收率在83%～98%之間，CV均在10%以內，可以滿足磺胺類和喹諾酮類殘留限量的要求（表6）。

3 結 論

本實驗實現了可視化蛋白芯片法同時檢測牛乳中磺胺類和喹諾酮類藥物的多殘留，該方法具有測定時間短、靈敏度高及操作簡單等優點。養殖過程中多種獸藥同時或交替使用而造成的藥物多殘留對檢測提出了很大挑戰，因而開發能提高檢測效率、降低檢測的成本和避免漏檢的藥物多殘留分析方法具有重要意義，對于安全開發能同時檢測多種藥物殘留[24-25]的快速靈敏的方法更具有實際意義。

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Simultaneous Determination of Multiresidues of Sulfonamides and Quinolones in Milk with Visual Protein Chip

ZHONG Wenying1, WANG Xingru1, XU Danke2,*, LI Zhonghui2, LI Zhoumin2
(1. Department of Analytical Chemistry, China Pharmaceutical University, Nanjing 211198, China; 2. State Key Laboratory of Analytical Chemistry for Life Science, School of Chemistry and Chemical Engineering, Nanjing University, Nanjing 210093, China)

Purpose: To develop a protein microarray method for the simultaneous detection of multiresidues of two veterinary drugs, sulfonamides and quinolones, in milk with a visual protein chip. Methods: A 96-well microplate was used as solid support, on which artificial antigens of sulfonamides and quinolones were immobilized, respectively. After immobilization, a mixture of antibodies to two analytes and either standard solutions containing the analytes or samples were added to the array reaction area. Silver nanoparticles (AgNPs)-labeled goat anti-mouse IgG were used as an indicator and nanosilver enhancement technique was applied to amplify the detection signals, producing black image on array spots visible with naked eyes. The signals were detected with a visual scanner; therefore the analyte residues could detected quantitatively. Results: The linear ranges for sulfonamides and quinolones were 0.3–7.2 ng/mL and 0.4–18 ng/mL respectively. The recovery rates were in the range of 83% to 110% for milk samples at spiked levels of 0.5/0.5, 2.0/3.0, and 5.0/15.0 ng/mL with coefficient of variation (CV) values ＜ 10%. Conclusions: These results indicate that the protein microarray method is suitable for the routine screening of multiresidues of sulfonamides and quinolones in milk.

protein chip; indirect competition; multiresidue detection; sulfonamides; quinolones

10.7506/spkx1002-6630-201602034

O657

A

1002-6630（2016）02-0193-05

鐘文英, 王興如, 許丹科, 等. 可視化蛋白芯片法同時檢測牛乳中殘留的磺胺類和喹諾酮類藥物[J]. 食品科學, 2016, 37(2): 193-197. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201602034. http://www.spkx.net.cn

ZHONG Wenying, WANG Xingru, XU Danke, et al. Simultaneous determination of multiresidues of sulfonamides and quinolones in milk with visual protein chip[J]. Food Science, 2016, 37(2): 193-197. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201602034. http://www.spkx.net.cn

2015-03-16

江蘇研究生科研創新計劃項目（KYZZ-0184）

鐘文英（1968—），女，教授，博士，研究方向為儀器分析。E-mail：wyzhong@cpu.edu.cn

*通信作者：許丹科（1965—），男，教授，博士，研究方向為生物芯片。E-mail：xudanke@nju.edu.cn