氯化鈣結合季也蒙畢赤酵母（Meyerozyma guilliermondii）對抑制芒果采后炭疽病效果的影響

陳 敏，高云慨，宋海超，何書婷，張榮意，鐘利文，史學群

（1.海南大學環境與植物保護學院，海南 海口 570228；2.海南大學園藝園林學院，海南 海口 5702 28；3.海南大學食品學院，海南 海口 570228）

氯化鈣結合季也蒙畢赤酵母（Meyerozyma guilliermondii）對抑制芒果采后炭疽病效果的影響

陳 敏1，高云慨1，宋海超1，何書婷1，張榮意1，鐘利文2，史學群3,*

（1.海南大學環境與植物保護學院，海南 海口 570228；2.海南大學園藝園林學院，海南 海口 5702 28；3.海南大學食品學院，海南 海口 570228）

研究氯化 鈣（CaCl2）結合季也蒙畢赤酵母（Meyerozyma guilliermondii）處理對由炭疽病菌（Colletotrichum gloeosporioides）引起的芒果采后炭疽病的抑制效果，同時分 析CaCl2對病原菌和酵母拮抗菌生長以及果實抗病性的影響。結果顯示：40 g/L CaCl2可有效提升拮抗菌M. g uilliermondii對芒果采后炭疽病的生防效果，其中40 g/L CaCl2與1×108CFU/mL M. guilliermondii懸浮液的復合處理比單一處理更能有效地抑制芒果果實采后炭疽病的發生。此外，40 g/L CaCl2對C. gloeosporioides菌絲 的生長具有抑制作用，并能夠促進拮抗菌M. guilliermondii在芒果果實傷口處的增殖。與此同時，該復合處理顯著誘導了芒果果實抗病相關酶活性的升高。結果表明，40 g/L CaCl2可以直接通過抑制病原菌的生長和促進拮抗酵母的增殖、以及間接誘導果實抗病 性來提升拮抗菌M. guilliermondii對芒果果實采后炭疽病防治效果。

芒果；炭疽菌；氯化鈣；季也蒙畢赤酵母；生防；酶活性

芒果（Mangifera indica Linn.）作為世界五大熱帶水果之一，以其獨特的口感和豐富的營養價值，被譽為“熱帶水果之王”[1]。芒果炭疽病是世界性的芒果重要病害，其主要病原菌為胞炭疽菌（Colletotrchum gloeosporioides (Penz.) Penz.and Sacc.）[2]。使用化學殺菌劑仍然是該 病采后防治的常用措施[3-4]。然而，長期使用化學殺菌劑不但會導致病原菌抗藥性的產生從而降低化學藥劑的防治效果，而且經常使用高濃度化學藥劑會導致果實上農藥殘留量的增加而威脅人類的健康，并造成環境的污染[5-7]。因此，尋求安全、經濟、有效防治果實采后病害的新技術已成為當務之急。近年來，生物拮抗菌作為一種具有潛力的新興技術，在采后病害防治方面顯示出的有 效性和使用方便性廣受關注[8]。

目前，一些酵母拮抗劑已經被廣泛應用于水果采后病害控制的研究并具有明顯的抑制效果。筆者之前從中國海南昌江地區芒果園篩選到了1 株酵母，經中國普通微生物菌種保藏管理中心（China General Microbiological Culture Collection Center，CGMCC）鑒定為Meyerozyma guilliermondii。實驗表明，拮抗菌M. guilliermondii對芒果采后炭疽病具有較好的抑制效果。然而，該拮抗菌單獨使用時需要在高濃度條件下才能達到理想的防治效果，其防效與化學殺菌劑相比也存在一定的差距，這些因素極大地限制了該拮抗酵母的大規模商業化應用[5]。 因此，需要通過其他方法來提高該拮抗菌的生物防治能力。

前人的研究表明，很多外源化學物質，如殼聚糖[9]、鉬酸銨[10]、碳酸氫鈉[11]、微波[12]、水楊酸[13]、熱處理[14]和硅[10]等與拮抗酵母 結合使用，均能夠顯著提高拮抗酵母的生物防治活性。

氯化鈣（CaCl2）作為防腐劑和固化劑在果蔬加工行業中已被廣泛應用[15]。之前已有研究表明，CaCl2可以增強Cryptococcus laurentii對蘋果綠霉病和梨灰霉病的防治效果[16-17]。但 對于CaCl2是否也能夠增強拮抗菌M. guilliermondii對芒果采后炭疽病的生防效果尚未見報道。因此，本實驗在先期研究的基礎上，進一步探討了使用CaCl2增強M. guilliermondii生防效力的可行性，同時對可能涉及到的機理進行探索，旨在為芒果采后炭疽病的生物防治提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

實驗所用的芒果品種為“紅金龍”，購自海南昌江芒果園，果實成熟度為7～8 成、大小均一、無病蟲害，使用前用20 g/L次氯酸鈉溶液消毒2 min后用自來水沖洗，自然晾干后備用。

1.2 試劑及培養基

CaCl2（分析純） 廣州化學試劑公司。

營養酵母-葡萄糖液體培養基：營養肉湯8 g/L、酵母粉5 g/L、葡萄糖10 g/L、氯化鈉20 g/L，121 ℃滅菌20 min，待用；馬鈴薯-葡萄糖（pota to dextrose agar，PDA）培養基：去皮馬鈴薯200 g/L、葡萄糖20 g/L、瓊脂20 g/L，121 ℃滅菌20 min，待用。

1.3 方法

1.3.1 病原菌和拮抗菌

1.3.1.1 病原菌

實驗所用的芒果采后炭疽病菌為實驗室分離保存的菌株，前期已經單孢分離和分子鑒定為C. gloeosporioides Penz. and Sacc，致病性測定表明為強致病力菌株。將其接種于PDA培養基上，28 ℃條件下培養7 d，孢子懸浮液的制備用含有0.05%吐溫-80的無菌水配制成實驗所需要濃度，待用。

1.3.1.2 拮抗菌

實驗用拮抗酵母分離自海南昌江地區芒果園芒果果實傷口，經CGMCC鑒定為M. guilliermondii。將該酵母菌株接種于含有50 mL營養酵母-葡萄糖液體培養基中，在2 8 ℃條件下振 蕩培養48 h，培養液在8 000 r/min條件下離心10 min后，棄上清液，加入無菌水，最后用血球計數板配制成實驗所需要的濃度。

1.3.2 CaCl2對C. gloeosporioides菌絲生長的影響

用無菌打孔器（直徑為5 mm）在培養7 d左右的PDA培養基上取炭疽菌菌落邊緣的菌塊放置于含有不同質量濃度CaC l2（0（對照）、5、10、20、40、50 g/L的PDA培養基平板（直徑為9 cm）中心。培養皿置于28 ℃條件下培養4 d，調查菌落直徑的大小。每個處理重復3 次，實驗重復2 次。

1.3.3 CaCl2對拮抗菌M. guilliermondii在果實傷口生長動態的影響

參照Janisiewicz等[18]的方法進行稍加改進，測定不同質量濃度CaCl2對拮抗菌M. guilliermondii在果實傷口處的生長動態的影響。分別用質量濃度為0（對照）、5、10、20、40、50 g/L的CaCl2溶液配制成濃度均為1×108CFU/mL的拮抗菌M. guilliermondii懸浮液，各取20 μL接種到芒果果實傷口內（直徑為5 mm，深3 mm，以下同），將果實28 ℃條件下保濕貯藏，分別測定0（接種后1 h）、24、48、72、96 h拮抗菌在果實傷口處的生長情況。測定方法為用滅過菌的打孔器從傷口處取直徑和高度都為10 mm的果肉組織，放在已加入1.0 mL 0.05 mol/L（pH 6.5）的磷酸緩沖液的研缽中，研磨后采用稀釋平 板 法測定拮抗菌的數目。每處理5 個果實，整個實驗重復2 次。

1.3.4 CaCl2與拮抗菌M. guilliermondii配合使用對芒果采后炭疽病的抑制效果影響

每個處理選取7 個芒果果實置于塑料筐中，用打孔器在果實赤道部位制造傷口。芒果果實分別做以下處理：A：40 g/L CaCl2浸泡10 min；B：傷口處滴加30 μL 1×108CFU/mL拮抗菌M. guilliermondii懸浮液；C：40 g/L CaCl2浸泡10 min后傷口處滴加30 μL 1×108CFU/mL拮抗菌M. guilliermondii懸浮液；D：對照為無菌水浸泡10 min。4 h后，各處理果實傷口接入15 μL濃度為5×104CFU/mL炭疽孢子懸浮液。果實晾干后用保鮮膜封口以保持濕度（95%左右）28 ℃貯藏，分別于第4、6天測量各果實的病斑直徑及發病率。每個處理3 個重復，實驗重復2 次。

1.3.5 CaCl2不同處理時間對芒果采后炭疽病抑制效果的影響

按1.3.4節中的方法對芒果果實制造傷口。各果實分為2 組進行不同處理：A：40 g/L CaCl2浸泡10 min，2 h后再接種15 μL濃度為5×104CFU/mL C. gloeosporioides孢子懸浮液；B：40 g/L CaCl2浸泡10 min，24 h后再接種15 μL濃度為5×104CFU/mL C. gloeosporioides孢子懸浮液。各處理果實28 ℃條件下放置于95%相對濕度的塑料箱中，4 d后分別測定各果實的病斑直徑和發病率。每個處理5 個芒果果實，3 次重復，整個實驗重復2 次。

1.3.6 CaCl2和拮抗菌M. guilliermondii處理對芒果果實苯丙氨酸解氨酶（phenylalanineammonialyase，PAL）、過氧化物酶（peroxidase，POD）和多酚氧化酶（polyphenloxidase，PPO）活性的影響

1.3.6.1 酶活性的誘導

每個芒果果實用打孔器在果實赤道部位制造傷口（5 mm×3 mm）。實驗分為4 組不同處理：A：刺傷后滴加30 μL無菌水作為對照；B：刺傷后滴加30 μL 40 g/L CaCl2溶液；C：刺傷后滴加30 μL 1×108CFU/mL M. guillierm ondii懸浮液；D：刺傷后滴加40 g/L CaCl230 μL，10 min后繼續加入30 μL、1 ×108CFU/mL M. guilliermondii懸浮液。將處理的果實分別貯藏于28 ℃，每24 h取樣測定酶活性連續測定5 d。每個處理3 個重復，每個處理5 個果實，實驗重復2 次。

1.3.6.2 PAL酶液的制備與活性測定

5 g果肉中加入0.3 g聚乙烯吡咯烷酮，再加入0.05 mol/L的硼酸緩沖溶液25 mL（pH 8.8，含有0.005 mol/L巰基乙醇溶液），冰浴勻漿，12 000 r/min，4 ℃條件下離心45 min，上清液用于酶活性測定。

PAL 活性測定參照Assis等[19]的方法加以改進：5 mL反應體系中含有1 mL粗酶液、2 mL硼酸緩沖液和1 mL 0.02 mol/L L-苯丙氨酸，37 ℃水浴60 min后，立即加入0.5 mL 6 mol/L HCl溶液終止反應，隨后測定A290nm值，以反 應液每小時在 290 nm波長處吸光度增加0.01為1 個酶活力單位。酶活性結果以U/mg表示。

1.3.6.3 PPO及POD酶液的制備與活性測定

取5 g果肉組織，加入0.3 g聚乙烯吡咯烷酮，再加入0.1 mol/L的磷酸緩沖液30 mL（pH 6.4），冰浴勻漿，12 000 r/min，4 ℃條件下離心30 min，上清液用于活性測定。

POD活性測定參照Chance等[20]的方法加以改進：在2 mL 8 mmol/L愈創木酚溶液中（用0.1 mo/L pH 6.4的磷酸鈉緩沖液配制成）中加入0.5 mL酶液，于37 ℃水浴5 min后，加入1 mL H2O2（24 mmol/L）混勻后測定A470nm值，以反應液每分鐘在 470 nm波長處吸光度增加0.01 為1 個酶活力單位。酶活性結果以U/mg表示。

PPO活性測定參照文獻[21]的方法加以改進：在2.5 mL 50 mmol/L鄰苯二酚溶液中（用0.1mol/L pH 6.4的磷酸鈉緩沖液配制成）中加入0.5 mL酶液，混合物混勻后置于30 ℃條件下充分5 min，隨后測定A398nm值，以反應液每分鐘在398 nm 波長處吸光度增加0.01為1 個酶活力單位。酶活性結果以U/mg表示。

1.3.6.4 酶液蛋白含量 的測定

參照Brodford[22]的方法進行，以牛血清白蛋白作為標準蛋白。

1.4 數據分析

采用SAS軟件進行數據統計，采用ANOVA對數據進行鄧肯多重差異分析（P＜0.05）。

2 結果與分析

2.1 CaCl2對芒果炭疽病菌菌絲擴展的影響

通過研究不同質量濃度（0、5、10、20、40、50 g/L）CaCl2對C. gloeosporioides在PDA固體培養基上生長的影響，結果見圖1，在28 ℃條件下培養4 d后，不同質量濃度的CaCl2對C. gloeosporioides在PDA培養基上的生長具有一定的影響。其中，質量濃度為5、10、20 g/L的CaCl2對C. gloeosporioides菌絲的生長具有一定的促進作用，而質量濃度為40 g/L和50 g/L的CaCl2對C. gloeosporioides菌絲的生長與對照相比則具有一定的抑制作用。

圖1 不同質量濃度CaCl2對芒果炭疽病菌菌絲擴展的抑制效果Fig.1 Inhibitory effect of different concentrations of calcium chloride on mycelial growth of C. gloeosporioides

2.2 CaCl2對拮抗菌M. guilliermondii在果實傷口生長動態的影響

圖2 CaaCCll2對拮抗菌M. guilliermonnddiiii在芒果果實傷口處生長動態的影響Fig.2 Effect of different concentrations of calcium chloride on population growth of M. guilliermondii in fruit wounds

分別將質量濃度為0、5、10、20、40、50 g/L的CaCl2配制的拮抗菌M. guilliermondii懸浮液接種于芒果果實傷口，觀察其在芒果傷口的生長動態，結果見圖2。從圖2可以看出，不同質量濃度CaCl2配制的拮抗菌懸浮液在芒果果實傷口處都能迅速繁殖。在0～48 h期間，芒果果實傷口處各拮抗菌數量大約是接種時的57～127 倍，隨后基本保持穩定。其中，質量濃度為20 g/L和40 g/L的CaCl2對拮抗菌M. guilliermondii在芒果果實傷口處的生長具有促進作用，而質量濃度為50 g/L的CaCl2對拮抗菌M. guilliermondii在芒果果實傷口處的生長與對照相比則有輕微的抑制作用。

2.3 CaCl2和拮抗菌M. guilliermondii結合使用對芒果采后炭疽病抑制效果的影響

將質量濃度為40 g/L CaCl2與拮抗菌M. guilliermondii結合處理芒果果實，觀察40 g/L CaCl2對拮抗菌M. guilliermondii抑制芒果采后炭疽病的影響，其結果見圖3。與對照相比，40 g/L CaCl2單獨使用時對芒果采后炭疽病沒有顯著的抑制作用，而拮抗菌M. guilliermondii單獨使用或結合40 g/L CaCl2使用能顯著降低芒果采后炭疽病病斑直徑和發病率。當40 g/L CaCl2和1×108CFU/mL拮抗菌M. guilliermondii懸浮液結合使用時，芒果采后炭疽病病斑直徑和發病率比拮抗菌M. guilliermondii單獨時有所降低，其中，芒果果實在接種第4天能完全抑制芒果采后炭疽病的發生，盡管接種第6天發病率有所上升但病斑直徑仍然顯著低于對照。

圖3 CaCl2與M. guilliermondii 處理對芒果采后炭疽病發病率（A）和病斑直徑（B）的影響Fig.3 Effects of disease incidence (A) and lesion diameter (B) of C. gloeosporioides in mango fruit postharvest-treated with calcium chloride and M. guilliermondii alone or in combination, respectively

2.4 CaCl2不同處理時間對芒果采后炭疽病抑制效果的影響

圖4 CaaCCll2不同處理時間對芒果采后炭疽病抑制效果的影響Fig.4 Effect of different incubation times with calcium chloride on control of C. gloeosporioides in mango fruit

由圖4可知，CaCl2不同時間處理對芒果采后炭疽病具有不同的抑制效果。接種間隔時間為24 h時，在28 ℃條件下貯藏4 d后，芒果采后炭疽病病斑直徑和發病率僅為2.55 mm和60%，顯著低于對照果實的13.54 mm和100%（圖4A、B）。CaCl2先于C. gloeosporioides孢子2 h對果實進行處理時，對芒果采后炭疽病的抑制效果與對照相比，無顯著差異（圖4C），而CaCl2與C. gloeosporioides孢子處理間隔時間擴大到24 h時，對芒果采后炭疽病的抑制效果要顯著好于對照（圖4D）。

2.5 CaCl2和拮抗菌M. guilliermondii處理對芒果果實PAL、POD和PPO活性的影響

圖5 CaCl2和M. guilliermondii對采后芒果果實PAL（a）、POD（b）和PPO（c）活性的影響Fig.5 Changes in activities of PAL (a), PPO (b) and POD (c) of mango fruit postharvest-treated with calcium chloride and M. guilliermondii alone or in combination, respectively

由圖5可知，在貯藏前1～4 d期間，對照組果實PAL活性處于逐漸下降的趨勢，而其他處理在貯藏第1～3天期間均顯著誘導了果實中PAL活性的上升，并在貯藏后第2天時到達峰值，其中滴加40 g/L CaCl210 min后接種拮抗菌M. guilliermondii處理的果實要顯著高于其他處理，此時PAL活性是對照果實的2.45 倍（圖5a）。在貯藏前3 d，各處理芒果果實POD活性始終保持上升的趨勢，在貯藏第3天時到達峰值。其中，滴加40 g/L CaCl2或單獨接種拮抗菌M. guilliermondii處理的果實P O D活性都要顯著高于對照，達到1.76 倍。同樣，滴加40 g/L CaCl210 min后接種拮抗菌M. guilliermondii處理的果實POD活性要顯著高于單一處理的果實，隨著芒果果實貯藏時間的延長，各處理POD活性都逐漸下降（圖5b）。所有處理芒果果實PPO活性在貯藏前3 d基本保持穩定，但隨后酶活性急劇升高。與對照相比，滴加40 g/L CaCl210 min后接種拮抗菌M. guilliermondii處理的果實PPO活性顯著提升（圖5c）。

3 討論與結論

前期研究發現拮抗菌M. guilliermondii處理對芒果果實采后炭疽病具有一定的抑制作用，但同時也存在有效處理質量濃度偏高和生防效力低下等不足。因此，為進一步提高拮抗菌M. guilliermondii的生防效力，本實驗測試了通過使用CaCl2來提高拮抗菌M. guilliermondii拮抗效力的可行性。實驗發現，質量濃度為5～20 g/L的CaCl2對C. gloeosporioides的生長具有促進作用，但質量濃度過大（50 g/L）時具有抑制作用。表現在40 g/L CaCl2能夠提高拮抗菌M. guilliermondii在芒果果實傷口處的增殖速度，而50 g/L CaCl2則抑制拮抗菌M. guilliermondii在芒果果實傷口處的生長。所以CaCl2與拮抗菌M. guilliermondii的復合處理的最佳質量濃度為應為40 g/L。結果證實，40 g/L CaCl2能顯著提高拮抗菌M. guilliermondii對芒果采后炭疽病的生防效力，其中復合處理對芒果采后炭疽病的抑制效果較拮抗菌M. guilliermondii單一處理更為顯著。

大量研究[23-25]表明，抗病相關酶PAL、POD和PPO活性的變化與果蔬采后對各種病菌的防衛反應能力密切相關。之前有研究發現，采后果蔬利用生物和非生物誘導因子處理，都能夠提高果蔬抗病相關酶的表達，增強果蔬對病害的抵抗能力[26-28]。本實驗結果顯示，40 g/L CaCl2與C. gloeosporioides孢子處理間隔時間擴大到24 h時，對芒果采后炭疽病的抑制效果顯著增強，這說明CaCl2能夠誘導芒果果實產生抗病性。這一結果與前人的報道相類似，研究[29]結果表明，CaCl2處理的梨果實能夠誘導其產生抗病性，從而增強梨對青霉病和灰霉病的防治效果。另外，通過對芒果果實抗病相關酶酶活性進行測定，結果同樣表明，40 g/L CaCl2和拮抗菌M. guilliermondii均可顯著誘導芒果果實抗病相關酶PAL、POD和PPO活性的上升，其中復合處理對芒果果實抗病相關酶的誘導比單一處理更顯著。

綜上，40 g/L CaCl2能夠直接抑制炭疽病原菌的生長和促進拮抗菌M. guilliermondii在芒果果實傷口處的增殖，同時還具有誘導芒果果實產生抗病性的作用。因此，可綜合提高拮抗菌M. guilliermondii生防效力，從而減少芒果實采后炭疽病病害的發生，在芒果采后的運輸和貯藏過程中顯示了良好的應用前景。

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Control of Postharvest Anthracnose of Mango Fruit by Combining Yeast Meyerozyma guilliermondii with Calcium Chloride

CHEN Min1, GAO Yunkai1, SONG Haichao1, HE Shuting1, ZHANG Rongyi1, ZHONG Liwen2, SHI Xuequn3,*
(1. College of Environment and Plant Protection, Hainan University, Haikou 570228, China; 2. College of Horticulture and Landscape, Hainan University, Haikou 570228, China; 3. College of Food Science and Technology, Hainan University, Haikou 570228, China)

The purposes of the present study were to investigate the effect of the combined treatment with calcium chloride and the antagonistic yeast Meyerozyma guilliermondii for control of postharvest athracnose caused by Colletotrichum gloeosporioides on mango fruit and to analyze the effect of CaCl2on the growth of the pathogen and yeast as well as the disease resistance. The results indicated that the biocontrol activity of M. guilliermondii at 1 × 108CFU/mL on anthracnose decay was enhanced by co mbination with 40 g/L CaCl2treatment. The combi ned treatment with M. guilliermondii and 40 g/L CaCl2resulted in a remarka bly improved control of the disease in comparison with the treatment with M. guilliermondii or 40 g/L CaCl2alone. In addition, 40 g/L CaCl2inhibited mycelial growth of pathogens and enhanced the population of M. guilliermondii in the wounds of mango fruits. Meanwhile, the combined treatment induced higher defense-related enzymes act ivities than either alone. Thus, these results suggested that 40 g/L CaCl2could improve the bio control activity of M. guilliermondii on the control of postharvest athracnose deca y caused by C. gloeosporioides in mango fruit, directly by inhibiting mycelial growth of pathogens and increasing population size of antagonist and indire ctly by enhancing disease resistance.

mango; Colletotri chum gloeosporioides; calcium chloride; Meyerozyma guilliermondii; bio control; enzyme activity

10.7506/spkx1002-6630-201602036

Q939.92；TS255.3

A

1002-6630（2016）02-0204-06

陳敏, 高云慨, 宋海超, 等. 氯化鈣結合季也蒙畢赤酵母(Meyerozyma guilliermondii)對抑制芒果采后炭疽病效果的影響[J].食品科學, 2016, 37(2): 204-209. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201602036. http://www.spkx.net.cn

CHEN Min, GAO Yunkai, SONG Haichao, et al. Control of postharvest anthracnose of mango fruit by combining yeast Meyerozyma guilliermondii with calc ium chloride[J]. Food Science, 2016, 37(2): 204-209. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201602036. http://www.spkx.net.cn

2015-01-25

國家自然科學基金面上項目（31360415）；海南省自然科學基金項目（312061）；海南大學中西部創新項目（MWECSP-RT08；ZXBJH-XK004；ZXBJH-XK005）；海南省教育廳科研重點項目（HNKY2014-01）

陳敏（1992—），女，碩士研究生，研究方向為熱帶水果采后病理學。E-mail：18805140991@163.com

*通信作者：史學群（1972—），男，副教授，博士，研究方向為采后病理學。E-mail：shixuequn@163.com