負載抗原的DC及DC-CIK對小細胞肺癌殺傷作用的比較研究

趙 鑫，常 穎，劉玉俠，趙 暉，盧衛平，于 鴻，王啟文*

(1.吉林省腫瘤醫院，吉林 長春130012；2.吉林省腫瘤防治研究所，吉林 長春130012)

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*通訊作者

負載抗原的DC及DC-CIK對小細胞肺癌殺傷作用的比較研究

趙 鑫1，常 穎1，劉玉俠2，趙 暉1，盧衛平1，于 鴻2，王啟文1*

(1.吉林省腫瘤醫院，吉林 長春130012；2.吉林省腫瘤防治研究所，吉林 長春130012)

目的 探討負載抗原的樹突狀細胞(Dendritic cells,DC)以及DC聯合CIK細胞(cytokine induced killer cells)對小細胞肺癌細胞株NCIH-446的殺傷作用，為DC、CIK應用于小細胞肺癌的治療提供實驗數據。方法 體外培養DC、CIK細胞，并將NCIH-446提取的抗原負載到DC，同時將DC與CIK聯合培養，將負載抗原的DC(DC-Ag)及DC-CIK與NCI446按50∶1的比例進行殺傷活性實驗，檢測培養不同時間的兩種細胞對NCIH-446的殺傷作用。結果 DC-Ag及DC-CIK在與NCIH-446CIK共同培養2個小時就監測到了兩種細胞對NCIH-446的殺傷作用，而且隨著時間的推移，殺傷作用逐漸增強，DC-Ag從2小時的57.63%提高到48小時的90.78%，而DC-CIK從62.95%提高到了91.57%，顯示了兩種細胞強大的殺傷作用，而且這種作用隨著時間的延長效果越明顯。結論 負載抗原的DC及DC-CIK對小細胞肺癌細胞株NCIH-446有極強的殺傷活性，為臨床小細胞肺癌的治療提供了一種新的方法。

樹突狀細胞；細胞因子活化殺傷細胞；小細胞肺癌，殺傷活性

(ChinJLabDiagn,2016,20:1627)

在肺癌的發病率中，小細胞肺癌所占的比例不是很高，大約13%左右[1]。但其生長迅速，侵襲性要強于非小細胞肺癌，易發生早期轉移，預后較差，生存期較短[1,2]。小細胞肺癌對化療極為敏感，據報道經化療后的病人RR可達60%-90%，CR可達30%-40%[3],但極易發生復發和轉移，所以如何預防化療后的復發和轉移，提高病人的生存期和生活質量，是小細胞肺癌治療成功的關鍵，也是目前治療的難題。生物治療近年來以其對腫瘤的強大殺傷力以及對腫瘤病人免疫功能的恢復和提高效果被用于腫瘤的治療。本實驗選擇生物治療中的DC負載抗原以及DC、 CIK聯合培養對小細胞肺癌進行體外殺傷實驗，為小細胞肺癌的治療提供一種除化療外的治療手段。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 淋巴細胞分離液 天津灝洋生物制品科技責任有限公司；GM-CSF，TNF-α，IL-4Peprotech公司;IMDM培養基GIBCO公司；胎牛血清天津康源公司； IL-2北京四環生物制藥有限公司；anti-CD3Ab Biolegend公司。anti-hunman CD3-FITC,anti-hunman CD16、CD56-PE購自 BD公司；IFN-γ天津灝洋生物制品科技責任有限公司；CD3+、CD4+、NK、NKT、CD3+HLA-DR+、CD8+CD28+熒光標記單克隆抗體購自美國BECKMAN COULTER公司。

1.1.2 小細胞肺癌細胞株NCIH-446 吉林省腫瘤防治研究所保存。

1.1.3 實驗設備 實時無標記細胞功能分析儀XCELLigence RTCA S16，E-Plate16細胞檢測板北京昊諾斯科技有限公司提供；低溫高速離心機SORVALL公司；HERA CEEL 240iCO2培養箱Thermo Scientific公司；流式細胞儀BD公司。

1.2 方法

培養NCIH-446細胞：將凍存的NCIH-446細胞復蘇、培養至對數生長期，用0.25%胰酶進行消化后，調細胞數為6×104/ml,備用。首先將E-Plate16細胞檢測板中加50 μl培養液測量基線，然后再加已調好細胞數的NCIH-446，100 μl/孔，放入xCELLigence RTCA S16實時無標記細胞功能分析儀中，并將其放到37℃，5%CO2培養箱進行培養24小時。效應細胞DC、CIK的制備及鑒定，見參考文獻[4,5]。NCIH-446腫瘤抗原的制備見參考文獻[6]。將培養6天的DC加入NCIH-446提取的抗原[5]與DC-CIK按1∶1的比例共同培養3天，分別調細胞數為3×106/ml，備用。將加入NCIH-446的E-Plate16細胞檢測板從37℃，CO2培養箱中取出，按以下設計加入已調好細胞數的負載抗原的DC及DC-CIK細胞，每孔100 μl，放入xCELLigence RTCA S16實時無標記細胞功能分析儀中，再將其放回到37℃，5%CO2培養箱中，對殺傷活性進行實時監測。本實驗共監測了48小時，每15分鐘監測1次。分三組，第1組:NCIH-446； 第2組:DC-Ag+NCIH-446(50∶1)；第3組;DC-CIK+NCIH-446(50∶1)。

1.3 統計學分析

應用SPSS17.0進行統計學分析，實驗數據以均值±標準差表示，組間比較采用t檢驗進行分析，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

DC-Ag、DC-CIK對NCIH-446的殺傷效應的監測結果見圖1。整個實驗進行了72小時，其中殺傷實驗從24小時開始進行，共進行了48小時。從圖中可以看出，DC-Ag、DC-CIK與NCIH-446共培養后NCIH-446的CI迅速下降，并且一直維持到本實驗結束。從監測的結果中選取了以上的時間點進行統計分析，見表1。結果證明DC-Ag及DC-CIK對NCIH-446的殺傷效應從2小時開始顯現，而且隨著時間的推移，殺傷效果不斷提高，到實驗結束時最高達都達到90%，而且6小時，13小時，24小時35小時，48小時DC-CIK及DC-Ag 與2小時的殺傷活性比有明顯差異(P<0.01)，而DC-CIK與DC-Ag相比在同一時間點對NCIH-446的殺傷效應統計學上沒有差異。

紅色為NCIH-446，綠色為DC-Ag+NCIH-446，藍色為DC-CIK+NCIH-446

3 討論

小細胞肺癌在肺癌的發病率中雖然不是很高，但是其發展速度快，侵襲性強，治療后的復發率和轉移率高，因此預后往往很差。雖然化療對小細胞肺癌的治療可以快速起效，但其復發轉移速度也較其它類型肺癌快，嚴重影響了它的預后和生存期。目前生物治療在腫瘤的綜合治療中發揮著重要作用，它可以直接殺傷腫瘤細胞，提高免疫功能，尤其對清除放化療后殘存的腫瘤細胞[7]，預防轉移和復發具有較好的作用。

樹突狀細胞(Dendritic cells,DC)是目前發現功能最強的專職抗原遞呈細胞，可以激活CD8+T殺傷細胞以及CD4+T輔助細胞，在免疫應答反應中起著重要作用[8]。CIK是一種廣譜的抗腫瘤細胞，它具有殺傷性強，無MHC限制的特點。本實驗選用抗原負載的DC(DC-Ag)及DC聯合CIK對小細胞肺癌細胞NCIH-446進行殺傷活性實驗，通過xCELLigence RTCA S16實時無標記細胞功能分析儀進行實時監測，結果證明，DC-Ag 、DC-CIK與NCIH-446在效靶比為50:1時，在共同培養2小時時就產生了較強的殺傷效果，而且隨著培養時間的延長，殺傷效果不斷提高(見圖1，表1)，維持了對腫瘤殺傷的持續效應，兩種細胞在培養48小時殺傷率都達到了90%以上，證明了抗原負載的DC及DC聯合CIK對小細胞肺癌強大的殺傷活性。但在同一時間點兩種細胞對NCIH-446的殺傷作用沒有明顯差異。

表1 DC-Ag、DC-CIK對NCIH-446的殺傷效應

※P<0.01,與2小時相比，△P<0.01與2小時相比

[1]Van Meerbeeck JP,Fennell DA,De Ruysscher DK.Small- cell lung cancer[J].Lancet,2011,378(9804):1741.

[2]Dooley AL,Winslow MM,Chiang DY,et al.nuclear factor I/B is an oncogene in small cell lung cancer[J].Genes Dev,2011,25(14):1470.

[3]廖美琳，王慧敏.小細胞肺癌的治療進展[J].腫瘤，2001,21(6)：399.

[4]趙 鑫，常 穎，劉玉俠，等.培養不同時間CIK細胞免疫表型變化與其抗腫瘤活性關系的研究[J].中國實驗診斷學，2015,19(9)：1455.

[5]于 鴻，劉玉俠．熱休克蛋白抗原肽致敏的臍血樹突狀細胞治療肺癌的實驗研究[J].中國實用醫藥，2007,2(35)：18.

[6]于 鴻，張 健，劉玉俠，等.抗原致敏的臍血樹突狀細胞誘導抗腫瘤效應的體外實驗研究[J].中國實驗診斷學，2010,14(1)：107.

[7]劉清池，張慧敏，張玉娜，等.DC-CIK細胞清除微小殘留白血病的臨床研究[J].中國腫瘤生物治療雜志，2013,20(4)：398.

[8]Gilboa E.DC-based cancer vaccines[J].J China Invest,2007,117:1195.

The compare study of antigen-pulsed DC and DC united CIK on Small cell lung cancer

ZHAOXin,CHANGHing,LIUYu-xia,etal.

(JilinProvinceTumorHospital,Changchun130012，China)

Objective Investigate the killing effect which antigen-pulsed Dendritic cells(Dendritic cells,DC)and DC united CIK cells(cytokine induced killer cells)have on small cell lung cancer cell lines NCIH-446 and provide the experimental data for the DC,CIK used in the treatment of small cell lung cancer.Methods Culture the DC,CIK cells in vitro,load the antigen extracted from NCIH-446 to DC,co-culture DC and CIK at the same time,do the experiment of killing activity making the antigen-pulsed DC(DC-ag)and DC-CIK in a 50:1 properation with NCIH-446,detective killing effect of two cells in different culture time on NCIH-446.Results The killing effect which DC-Ag and DC-CIK have on NCIH-446 can be surveyed after 2 hours' co-culture and the killing effect increases gradully over time,DC-Ag increases from 57.63% to 90.78% within 46 hours and DC-CIK increases from 62.95% to 91.57%,which shows the great killing effect of the two cells,the effect becomes more obvious over time.Conclusion Antigen-pulsed DCs and DC-CIK have strong killing activity on small cell lung cell line NCIH-446,which provides a new method for the clinical treatment of small cell lung cancer.

dendritic cells;cytokine activated killer cells;small cell lung cancer;killing activity

1007-4287(2016)10-1627-03

R734.2

A

2015-04-11)