選擇性磷酸酶抑制劑Salubrinal對大鼠急性肺損傷細胞凋亡的影響

張海濤，饒艷偉*，賈桂風

(1.吉林省人民醫院 重癥醫學科，吉林 長春130021；2.吉林大學第一醫院 婦產科)

?

選擇性磷酸酶抑制劑Salubrinal對大鼠急性肺損傷細胞凋亡的影響

張海濤1，饒艷偉1*，賈桂風2

(1.吉林省人民醫院 重癥醫學科，吉林 長春130021；2.吉林大學第一醫院 婦產科)

Salubrinal為選擇性抑制elF2a去磷酸化的抑制劑，是在大鼠嗜鉻細胞瘤發生內質網應激而引起的凋亡中的化合物篩選出的小分子化合物，進一步研究發現其可以選擇性誘導elF2a磷酸化和抑制去磷酸化作用，最終可以保護細胞避免內質網應激相關的凋亡[1，2]。研究認為Salubrinal引起細胞中GRP78表達增高，認為Salubrinal可能上調GRP78來避免細胞中的內質網應激相關凋亡的發生[3]。 本研究以急性肺損傷大鼠為研究對象，通過觀察大鼠肺組織中Bcl-2、Bax和cleaved-caspase3蛋白的表達，探討Salubrinal對急性肺損傷大鼠細胞凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 藥品及主要試劑

脂多糖(美國 Sigma 公司)，Salubrinal (Sal，美國 Sigma 公司)，Bcl-2(美國 Abcam公司),Bax(美國 Abcam 公司),cleaved-caspase3蛋白抗體(美國 Santa Cruz 公司)。

1.2 實驗動物及分組

健康Wistar大鼠48只，雌雄各半，體質量(250±10)g，由吉林大學實驗動物中心提供，動物合格證號：SCXK-(吉)2008-0005。將大鼠隨機分為對照組、急性肺損傷組、急性肺損傷 Sal治療組，每組16只。

1.3 動物模型制備及處理

① 對照組：一次性灌胃1 ml生理鹽水；每日2次腹腔注射1 ml生理鹽水。② 急性肺損組(ALI)：一次性給予5 mg/kg 脂多糖靜脈注射。③ Sal 1.0治療組，一次性給予5 mg/kg 脂多糖靜脈注射造模后，腹腔注射1.0 mg/kg/天 Salubrinal。本實驗動物處置方法符合動物倫理學標準。

1.4 檢測指標及方法

造模7 d后腹腔注射10%水合氯醛麻醉，留取大鼠肺部組織-80℃保存，行蛋白質免疫印跡試驗(Western blot)。同時右肺中葉應用10%中性甲醛溶液予以固定48 h，之后進行脫水、浸蠟、包埋、切片等過程，最后給予蘇木素-伊紅(HE)染色。

1.4.1 肺組織形態學觀察 取肺組織切片，經脫蠟、HE染色、梯度乙醇脫水、透明、封固，光鏡下觀察。

1.4.2 Western blot檢測肺組織Bcl-2、Bax和cleaved-caspase3蛋白表達 提取肺組織總蛋白，Bio-Rad 法測定蛋白濃度。通過Western blot法檢測Bcl-2、Bax和cleaved-caspase3表達情況。用Image J圖像處理軟件計算各條灰度值，分析Bcl-2、Bax和cleaved-caspase3蛋白的表達情況。以目的蛋白與內參照β-肌動蛋白(β-actin)的灰度值比值表示。

1.5 統計學分析

2 結果

2.1 免疫組化檢查肺組織中Bax蛋白表達(圖1)

急性肺損傷大鼠肺組織免疫組化結果顯示：Bax在大鼠的大部分肺細胞中都有表達。與對照組相比，急性肺損傷組Bax蛋白表達明顯增加，有顯著的統計學意義(P<0.01)。與急性肺損傷組相比，Sal治療組的Bax蛋白明顯降低，有顯著的統計學意義(P<0.01)。

2.2Westernblot檢測Bcl-2、Bax蛋白表達(圖2)

與對照組相比，急性肺損傷組Bcl-2/Bax蛋白表達顯著降低(P<0.05)；與急性肺損傷組相比，Sal治療組Bcl-2/Bax蛋白表明顯達增高，差異有顯著的統計學意義(P<0.01)。

圖1 急性肺損傷大鼠肺組織中Bax蛋白的表達(×40)

圖2 Western blot檢測急性肺損傷大鼠的肺組織中

2.3 Western blot檢測cleaved-caspase3蛋白表達(圖3)

與對照組相比，急性肺損傷組cleaved-caspase3蛋白表達顯著增高(P<0.05)；與急性肺損傷組相比，Sal組cleaved-caspase3蛋白表明降低，差異有顯著的統計學意義(P<0.05)。

圖3 Western blot檢測急性肺損傷大鼠的

3 討論

Salubrinal可通過選擇性誘導elF2a磷酸化和抑制其去磷酸化，以保護細胞免于ERS所致凋亡。在我們前期研究發現通過給予Salubrinal處理急性肺損傷大鼠后，發現大鼠肺組織形態有明顯的改變。李海峰等[4]在百草枯中毒大鼠經過Salubrinal處理后，發現Salubrinal也能明顯改變其肺組織的形態。這說明Salubrinal可以改變肺損傷大鼠肺組織的形態，但是其通過何種機制還不確定。有研究學者認為與肺細胞的凋亡水平有關系，在前期研究中我們發現其能增加肺組織中的抗氧化水平，提高抗氧化蛋白的表達，來免受損傷因子的刺激，降低肺組織中和血清活性氧的含量。

Matsuoka M的研究認為Salubrinal引起細胞中GRP78表達增高，可能維持細胞內內質網應激的穩態，避免細胞中的內質網應激相關凋亡的發生[5]。本研究通過免疫組化法發現急性肺損傷大鼠的肺組織中Bax蛋白表達明顯增高，同時Western blot也證明了Bax蛋白表達明顯增高，同時發現了Bcl-2蛋白表達明顯降低。凋亡相關蛋白分為抗凋亡蛋白和促凋亡蛋白，抗凋亡蛋白如Bcl-2、Bcl-xl等，促凋亡蛋白分為Bax、Bim等。Bcl-2/Bax值還是衡量細胞中抗凋亡水平，在本研究中發現Salubrinal能明顯的提高急性肺損傷大鼠的Bcl-2/Bax值，即增加其抗凋亡水平。

現階段研究認為凋亡包括外源性細胞凋亡途徑和內源性細胞凋亡途徑，兩條凋亡途徑在細胞內有多個交匯點，其最終會引起Caspase依賴的及Caspase非依賴的細胞凋亡。細胞凋亡體是由多個Apaf-1/Cyto-c復合物聚集而形成的聚集體。凋亡小體中的Apaf-1結構發生變化，會募集Caspase 9進一步導致Caspase 9被剪切成兩段，誘導其發生激活。活化Caspase 9進一步發生剪切以及活化胞質中下游的效應Caspase家族，例如Caspase 3，Caspase 6和Caspase 7[6]，進而引起細胞凋亡的形態和生化特征的出現，如核內染色質凝聚、DNA片段化和磷脂酰絲氨酸的外翻等凋亡特征的出現。Smac和凋亡誘導因子在多種外界因素刺激下釋放入細胞胞質，會引起Caspase非依賴途徑凋亡的發生。本研究中我們發現急性肺損傷大鼠的cleaved-caspase3蛋白表達明顯增加，而經過Salubrinal處理后，發現cleaved-caspase3蛋白表達明顯降低，這說明Salubrinal能降低急性肺損傷大鼠的線粒體途徑的凋亡發生。

總之，我們模擬大鼠急性肺損傷模型，通過Salubrinal進行處理，發現Salubrinal可能通過增加抗凋亡Bcl-2蛋白的表達，降低促凋亡蛋白Bax蛋白表達來降低急性肺損傷大鼠細胞凋亡的發生，同時也可能通過改變急性肺損傷大鼠的線粒體途徑降低細胞凋亡的發生。

[1]Tajeddine N,Galluzzi L,Kepp O,et al.Hierarchical involvement of Bak,VDAC1 and Bax in cisplatin-induced cell death[J].Oncogene,2008,27(30): 4221.

[2]Zmasek CM，Godzik A.Evolution of the animal apoptosis network[J].Cold Spring Harb Perspect Biol,2013,5(3):a008649.

[3]Kervégant M,Merigot L,Glaizal M,et al.Paraquat Poisonings in France during the European Ban:Experience of the Poison Control Center in Marseille[J].J Med Toxicol,2013,9(2):144.

[4]李海峰,邢寶鵬,權玉蘭,等.選擇性磷酸酶抑制劑Salubrinal對急性百草枯中毒大鼠肺組織細胞自噬和凋亡的影響[J].中華危重病急救醫學,2014,26:671.

[5]Matsuoka M,Komoike Y.Experimental Evidence Shows Salubrinal,an eIF2α Dephosphorylation Inhibitor,Reduces Xenotoxicant-Induced Cellular Damage [J].Int J Mol Sci,2015,16(7):16275.

[6]Bernardi P， Scorrano L，Colonna R，et al.Mitochondria and cell death.Mechanistic aspects and methodological issues[J].Eur J Biochem，1999，264 (3):687.

吉林省衛生計生委資助項目(2015SZC13)

1007-4287(2016)10-1638-03

2015-11-04)

*通訊作者