蒙藥組方對大鼠乳腺上皮細胞增殖和分泌及細胞免疫功能的調節

高俊嬌，郝羽翀，王英軍，史紅艷*

(1.吉林大學基礎醫學院，吉林 長春130021；2.長春市圣心心腦血管病醫院；3.吉林省中醫藥科學院)

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*通訊作者

蒙藥組方對大鼠乳腺上皮細胞增殖和分泌及細胞免疫功能的調節

高俊嬌1，2，郝羽翀1，王英軍3，史紅艷1*

(1.吉林大學基礎醫學院，吉林 長春130021；2.長春市圣心心腦血管病醫院；3.吉林省中醫藥科學院)

目的 探討蒙藥組方治療乳腺增生的機制。方法 應用不同濃度蒙藥組方刺激體外培養的乳腺上皮細胞，測定乳腺上皮細胞增殖及酪蛋白mRNA表達；建立大鼠乳腺增生模型，檢測不同濃度蒙藥組方對大鼠T淋巴細胞亞群的影響。結果 蒙藥組方可有效抑制乳腺上皮細胞的增殖，其中0.105 mg/L組在有效抑制乳腺上皮細胞增殖的基礎上，對酪蛋白mRNA表達無抑制作用；0.105 g/kg蒙藥組方CD4+/CD8+均值高于正常對照組和模型對照組，可以促進機體的細胞免疫功能，能扭轉造模過程對機體免疫功能的抑制作用。結論 蒙藥組方可有效抑制大鼠乳腺上皮細胞增殖并能促進大鼠細胞免疫功能。

乳腺增生;蒙藥組方；細胞免疫

(ChinJLabDiagn,2016,20:1643)

目前，應用傳統蒙藥組方及其改良組方治療乳腺增生取得了較好臨床療效。本文力圖在細胞水平探討傳統蒙藥組方對于乳腺上皮細胞泌乳功能的影響；并以大鼠為動物模型，探討傳統蒙藥組方對細胞免疫功能的影響，探究蒙藥治療乳腺增生的機制。

1 材料和方法

1.1 實驗藥物及對照藥物

蒙藥組方主要成分包括郁金、王不留行、穿山甲、山慈菇、青皮、牡蠣、山楂、瓜蔞、浙貝母等，由吉林省中醫藥科學院提供。乳癖消片由沈陽紅藥制藥股份有限公司生產,國藥準字Z20003258。他莫昔芬由寧波市天衡制藥有限公司生產，國藥準字H33021583。

1.2 實驗試劑及抗體

改良型RPMI-1640培養基及胎牛血清由Hyclone生產,Dulbecco＇s Modified Eagle Medium(DMEM)購自GIBCO公司,青霉素與鏈霉素購自華北制藥有限公司,表皮生長因子購自英國Pepro-Tech House公司,胰島素、孕酮、轉鐵蛋白、谷氨酞胺購自Sigma公司，氫化考的松由天津市生物化學制藥廠生產,CCK8試劑盒由東洋紡織生產，細胞總RNA提取試劑盒、Trizol、Reverse Transcriptase、PCR試劑盒、dNTP等購自TAKARA公司，Anti-Rat CD3 FITC、Anti-Rat CD8a PE、Anti-Rat CD4 APC均為eBioscience公司產品，10×氯化銨紅細胞裂解液參照文獻配制及保存。

1.3 方法

1.3.1 蒙藥組方對大鼠乳腺上皮細胞增殖及酪蛋白mRNA表達的調節 用相差消化和相差貼壁方法,培養和純化分娩后3-5 d的大鼠乳腺上皮細胞[1-3]。將濃度為1×105/ml乳腺上皮細胞100 μl接種于96孔培養板,48 h后分別加入含不同濃度藥物的培養基200 μl，使各組終濃度分別是：他莫昔芬4.200 mg/L、乳癖消1.000 mg/L、蒙藥組方0.420 mg/L、蒙藥組方0.210 mg/L、蒙藥組方0.105 mg/L，每組設三個復孔；1,3和5 d后用CCK8試劑盒及酶標儀測定OD490，并計算細胞相對增長指數。細胞相對增長指數(抑制率)=(試驗組OD490-對照組OD490)/對照組OD490×100%。

將密度1×105/ml的乳腺上皮細胞200 μl/孔接種于6孔培養板,48 h后按0.420 mg/L、0.210 mg/L、0.105 mg/L在孔內加入含蒙藥組方的培養液，每組設三個復孔，在5%CO2、37℃條件下培養5 d[4]。根據試劑盒操作說明提取各孔細胞總RNA。參照逆轉錄酶說明書及分子克隆獲得細胞總RNA的cDNA。根據Gene Bank中大鼠β-Casien基因(NC_005113)，用PrimerSelect軟件篩選引物序列。上游引物為：5’-TTAAAATACACAAAGACACAA-3’；下游引物為：5’-TGCATAACTAGCCAAACATTC-3’。擴增條件如下：94℃ 5 min；94℃ 30 s；55℃ 30 s；72℃ 1 min，共30個循環；72℃ 10 min；4℃保存。

1.3.2 蒙藥組方對大鼠T淋巴細胞亞群的影響 雌性大鼠70只，隨機分為7組，每組10只，包括正常對照組、模型對照組，他莫西芬4.200 g/kg、乳癖消片1.000 g/kg及蒙藥組方0.420 g/kg、0.210 g/kg、0.105 g/kg組。除正常對照組外，其余組別每天肌肉注射苯甲酸雌二醇(0.5 mg/kg)，連續25天后用黃體酮(4 mg/kg)連續注射5d造成乳腺增生模型[1，4]。造模3w后每天灌胃給藥1次，連續4w，正常對照組及模型對照組給予同等體積蒸餾水。末次給藥1 h后，用10%水合氯醛麻醉，無菌摘取脾，收集脾淋巴細胞并調整細胞濃度為1×107/ml。用CD3、CD4、CD8抗體標記脾淋巴細胞后在流式細胞儀上檢測[5，6]。

2 結果

2.1 蒙藥組方對小鼠乳腺上皮細胞增殖及酪蛋白mRNA表達的影響 見表1。將各組別吸光度值輸入SPSS19統計學軟件，用單因素AVONA方法分析上述實驗數據。作用3 d及5 d后，0.420 g/L蒙藥組方組增殖活性值顯著低于正常對照組；0.210 g/L和0.105 g/kg蒙藥組方5 d組，細胞增殖活性小于對照組。應用蒙藥組方5 d后大鼠乳腺上皮細胞酪蛋白β-Casien的RT-PCR結果見圖1。

表1 各試驗組別細胞吸光度

與對照組比較*P<0.05,**P<0.001

2.2 實驗藥物及對照藥物對大鼠脾T淋巴細胞亞群的影響

應用SPSS19軟件中的單因素AVONA方法分析各實驗組和對照組大鼠的脾淋巴細胞亞群分布結果見表2。除0.105 g/kg蒙藥組方組外，其他各實驗藥物組、對照藥物組及模型對照組的CD4+T淋巴細胞百分比均低于正常對照組，差異具有統計學意義(表2)。各實驗藥物及對照藥物組的CD8+T細胞百分比與正常對照組及模型對照組比較均無顯著性差異(表2)。除0.105 g/kg蒙藥組方組外，各實驗藥物組及對照藥物組脾臟T淋巴細胞中CD4+/CD8+的值與正常對照組及模型對照組比較雖無顯著性差異，但均值都低于正常對照組；而0.105 g/kg蒙藥組方組中的CD4+/CD8+均值高于正常對照組及模型對照組，差異具有統計學意義(表2)。

M：DNA分子量Marker；Lane 1：0.420 mg/L蒙藥組方組；Lane 2：0.210 mg/L蒙藥組方組；Lane 3：0.105 mg/L蒙藥組方組；Lane 4 正常對照組。

圖1 應用蒙藥組方5 d后大鼠乳腺上皮細胞酪蛋白β-Casien的RT-PCR結果

3 討論

不同濃度蒙藥組方在作用5 d后對大鼠乳腺上皮細胞均具有抑制作用；0.105 mg/L作用5 d對大鼠乳腺上皮細胞的抑制率最低，并且該組酪蛋白表達量高于0.420 mg/L和0.210 mg/L組。說明在抑制大鼠乳腺上皮細胞增殖的基礎上，0.105 mg/L的蒙藥組方對乳腺上皮細胞酪蛋白分泌的抑制作用最低。

表2 正常對照組、模型對照組與各藥物治療組脾淋巴細胞亞群的流式細胞分析結果±s，n=3)

與正常對照組比較*P<0.05,#與模型對照組的比較P<0.05

T淋巴細胞亞群對于機體細胞免疫及體液免疫具有重要作用。CD4+T細胞具有調節免疫反應活性、輔助B細胞產生抗體、分泌細胞因子的作用，而CD8+T細胞具有免疫抑制和細胞毒性作用。在正常情況下CD4+/CD8+處于相對穩定狀態。CD4+/CD8+下降甚至倒置是細胞免疫功能抑制的表現。在本實驗中，模型對照組大鼠脾臟CD4+T細胞比例低于正常對照組，說明模型制備方法對免疫系統具有抑制作用；而各對照藥物組和0.420 g/kg蒙藥組方組、0.210 g/kg蒙藥組方組大鼠的脾臟CD4+T細胞的比例亦低于正常對照組(P<0.05)，說明各濃度的實驗藥物及對照藥物不能扭轉造模過程對免疫系統的抑制作用； 0.105 g/kg蒙藥組方組大鼠的脾CD4+T細胞比例與正常對照組沒有差異(P>0.05)，說明0.105 g/kg蒙藥組方對機體的免疫系統無抑制作用；而且該組的CD4+/CD8+均值高于正常對照組和模型對照組，說明0.105 g/kg的蒙藥組方可以促進機體的細胞免疫功能，能扭轉造模過程對機體免疫功能的抑制作用。

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The Function of Compound Mongolia Medicine on Rat's Cell-Mediated immunity and Regulation to Proliferation and Secretion of Rat's Mammary Gland Epithelium

GAOJun-jiao,HAOYu-chong,WANGYing-jun,etal.

(TheBasicMedicalSchoolofJilinUniversity,Changchun130021,China)

Objective To study the mechanism of Compound Mongolia Medicine (CMM) on treating mammary gland hyperplasia.Methods Applying different concentration of CMM to stimulate mammary epithelial cells in vitro,the mammary cell proliferation and casein mRNA expression were tested; administrating a series dose of CMM to rat model of mammary gland hyperplasia and detecting the changes of CD4+and CD8+T lymphocyte to evaluate the function of cell-mediated immunity.Results 0.105 mg/L CMM can effectively inhibit the proliferation of breast epithelial cell without inhibiting casein mRNA expression;and 0.105 g/kg CMM can promote the cell-mediated immunity；CD4+/CD8+of 0.105 g/kg CMM group is higher than that of normal control and mammary gland hyperplasia model.Conclusion CMM can effectively inhibit rat mammary epithelial cell proliferation and promote rat cell-mediated immunity.

Hyperplasia of mammary glands;compound Mongolia medicine;cell-mediated immunity

1007-4287(2016)10-1643-03

R655.8

A

2015-10-14)