CD200和CD200R在膀胱和腎臟腫瘤表達的研究

侯睿達，安治國，劉俊婷，毛靜濤，孔祥波*，侯治富*

(1.吉林大學中日聯誼醫院，吉林 長春130033;2.北京龍邁達斯科技開發有限公司，北京101111)

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CD200和CD200R在膀胱和腎臟腫瘤表達的研究

侯睿達1，安治國1，劉俊婷1，毛靜濤2，孔祥波1*，侯治富1*

(1.吉林大學中日聯誼醫院，吉林 長春130033;2.北京龍邁達斯科技開發有限公司，北京101111)

目的 探索CD200在膀胱、腎臟表達及其在腫瘤微環境的免疫調節作用。方法 應用組織芯片技術，對50例膀胱、腎臟腫瘤組織和癌旁正常組織CD200、CD200R的表達進行對比研究。結果 膀胱癌、腎癌及其癌旁組織CD200和CD200R均呈現不同程度的表達。其中，膀胱癌組織CD200R表達、腎癌組織CD200和CD200R表達顯著減低，且以CD200R減低為主。結論 CD200和CD200R在膀胱、腎臟組織表達，且具有一定的組織差異性，提示其在腫瘤微環境免疫調節中具有潛在的價值。

CD200；CD200R；膀胱；腎臟；腫瘤微環境；免疫調節

(ChinJLabDiagn,2016,20:1661)

CD200作為免疫調節分子已經成為當今的研究熱點，從最初在髓細胞系表達的發現，到如今被視為腫瘤干細胞，表明了CD200不僅在免疫活性細胞間相互作用，可能在腫瘤細胞與免疫活性細胞間存在腫瘤微環境的調節機制。為了探索CD200和CD200R分子在腫瘤微環境中作用，我們對泌尿系統腫瘤50例臨床配對樣本進行了篩查，為研究腫瘤微環境免疫調節提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 臨床資料 膀胱、腎臟癌與癌旁正常組織芯片由北京龍邁達斯科技開發有限公司提供，組織芯直徑：1.5 mm，切片厚度：3 μm，組織芯數：100芯。其中25對腎癌與癌旁組織，25對膀胱癌與癌旁組織。男性38例，女性12例。18-44歲5例，45-60歲21例，>60歲24例。

1.2 實驗方法 CD200抗體、CD200R抗體均為美國Abcam公司產品。將組織芯片切片置于二甲苯中浸泡20分鐘脫蠟，換新鮮二甲苯重復一次；將脫臘后的組織切片依次置于100%乙醇中浸泡5分鐘×2次，95%乙醇、90%乙醇、80%乙醇、70%乙醇、蒸餾水各浸泡5分鐘再行水化；將檸檬酸-檸檬酸鈉抗原修復液微波高火加熱至沸騰，放入切片，再用微波高火加熱5分鐘，補加蒸餾水恢復體積后再用微波高火加熱5分鐘，自然冷卻至室溫；用新配置3%H2O2滴片，室溫下避光孵育10分鐘；PBS洗5分鐘，去除內源性過氧化物酶；用10%正常羊血清，室溫封閉10分鐘。分別加入1∶50抗CD200、1∶100抗CD200R單克隆抗體，用10%正常羊血清作為實驗陰性對照(以PBS稀釋)，4℃過夜反應；PBS洗5分鐘，共3次；按照Dakocytomation Envision+TM System HRP試劑盒的說明書進行染色；最后用蘇木精復染細胞核，中性樹膠封片后，光學顯微鏡下觀察并記錄結果。

1.3 結果判定 CD200和CD200R表達定位于細胞膜，陽性產物均為黃色或棕黃色顆粒。結果根據陽性細胞在全部組織細胞中所占比例以及陽性細胞染色強度判定：A：按顯色細胞數記分，陽性細胞數<5%為0分，陽性細胞數≥5%-25%為1分，陽性細胞數≥26%-50%為2分，陽性細胞數≥51%-75%為3分，陽性細胞數>75%為4分。B：按細胞顯色深淺記分，無陽性反應細胞為0分，淺黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。

1.4 統計學分析 采用SPSS 17.0統計軟件，對實驗數據分別進行秩和檢驗和χ2檢驗。以α=0.05為檢驗水準。

2 結果

2.1 CD200在膀胱腫瘤、腎臟腫瘤的表達

配對膀胱組織芯片和配對腎臟組織芯片的免疫組化結果顯示，膀胱癌組織與癌旁組織CD200表達,無論在表達數量或表達強度上，經秩和檢驗均無顯著差異(P>0.05)。而腎癌組織與癌旁組織CD200表達,其表達數量和表達強度，腎癌組織顯著低于癌旁組織(P≤0.001)。見圖1- 2，表1-4。

2.2 CD200R在膀胱腫瘤、腎臟腫瘤的表達

25例配對膀胱組織芯片(去掉脫落癌旁組織)、25例配對腎臟組織芯片的免疫組化結果顯示，膀胱癌組織與癌旁組織CD200表達,其表達數量無顯著差異，而表達強度癌組織顯著低于癌旁組織(P<0.05)。而腎癌組織與癌旁組織CD200表達,無論在表達數量或表達強度上，腎癌組織顯著低于癌旁組織(P<0.001)。見圖3- 4，見表5-8。

圖1 膀胱癌旁組織(A)與癌組織(B)CD200表達的免疫組化染色(×100)

圖2 腎癌旁組織(A)與癌組織(B)CD200表達的免疫組化染色(×100)

01234ZP膀胱癌1421260.3990.690癌旁123532

表2 CD200在膀胱配對樣本中的表達強度

表3 CD200在腎臟配對樣本中的表達數量

表4 CD200在腎臟配對樣本中的表達強度

圖3 膀胱癌旁組織(A)與癌組織(B)CD200R表達的免疫組化染色(×100)

圖4 腎癌旁組織(A)與癌組織(B)CD200R表達的免疫組化染色(×100)

01234ZP膀胱癌953441.4280.153癌旁43864

表6 CD200R在膀胱配對樣本中的表達強度

表7 CD200R在腎臟配對樣本中的表達數量

表8 CD200R在腎臟配對樣本中的表達強度

3 討論

CD200和CD200R均為細胞表面糖蛋白，包含兩個免疫球蛋白樣結構域，屬于免疫球蛋白超家族成員。主要通過CD200與CD200R交聯傳遞負向調節功能，在免疫抑制、免疫調節中起著重要作用。CD200主要表達在各種細胞(包括單核細胞、B細胞、T細胞)、胸腺細胞、神經元、內皮細胞等，而CD200R表達比較局限，主要在髓系細胞。目前研究主要集中在造血系統疾病，Gemei等于2013年報道了腫瘤干細胞篩選中CD200在部分腸癌細胞系的表達，提示CD200或CD200R表達的范圍可能更加廣泛[1-3]。本文研究結果顯示，CD200在膀胱的

癌組織和癌旁組織表達率約為40%；腎癌組織的表達率約為35%，癌旁組織約為90%。CD200R在膀胱的癌組織表達率約為64%，癌旁組織約為80%；腎癌組織的表達率約為75%，癌旁組織為100%。在膀胱、腎臟組織表達CD200、CD200R的研究尚未見報道。

研究表明，除了在腸癌細胞系表達CD200外，Borne等的敲出CD200基因動物肢體缺血性實驗研究證實，在缺乏CD200-CD200R作用的條件下，缺血局部的淋巴細胞聚集減少、新生血管增加，給予CD200R激動劑可以糾正這一反應[4]，揭示了CD200參與病變局部微環境的調節作用。本研究結果顯示，在膀胱上皮組織中，癌與癌旁CD200的表達無顯著差異(P>0.05)，癌組織的CD200R表達顯著低于癌旁組織(P<0.05)；而腎實質的癌組織CD200和CD200R的表達均顯著低于癌旁組織(P≤0.001)。提示CD200和CD200R的表達具有一定的組織特異性，在癌組織中以CD200R表達減少為主(P<0.01)，可能在腫瘤微環境免疫調節中，由于缺乏CD200-CD200R抑制機制，成為成瘤原因之一[5]。同時，其功能是否涉及腫瘤細胞與免疫活性細胞的直接作用等有待進一步研究。

[1]Rozhok AI,De Gregori J.Toward an evolutionary model of cancer:Considering the mechanisms that govern the fate of somatic mutations[J].Proc Natl Acad Sci USA，2015,112(29):8914.

[2]侯治富，王維忠，印 璞,等.大腸腫瘤基因調控模式初探[J].中國腫瘤臨床，1999，26(11)：867.

[3]Gemei M1,Di Noto R,Mirabelli P et al.Cytometric profiling of CD133+ cells in human colon carcinoma cell lines identifies a common core phenotype and cell type-specific mosaics[J].Int J Biol Markers,2013,28(3):267.

[4]van den Borne P,Rygiel TP,Hoogendoorn A,et al.The CD200-CD200 receptor inhibitory axis controls arteriogenesis and local T lymphocyte influx[J].PLoS ONE,2014,9(6):e98820.

[5]Xiong Z,Ampudia-Mesias E,Shaver R et al.Tumor-derived vaccines containing CD200 inhibit immune activation:implications for immunotherapy[J].Immunotherapy,2016,8(9):1059.

CD200 and CD200R expressed in bladder and kidney cancer

HOURui-da,ANZhi-guo,LIUJun-ting,etal.

(China-JapenUnionHospitalofJilinUniversity,Changchun130033,China)

Objective To explore CD200 expressed in bladder,kidney,and the immunoregulatory effects of tumor microenvironment.Methods The expression of CD200 and CD200R were detected in 50 cases of bladder,renal tumor tissue and adjacent tissue by tissue microarray technology.Results The expression of CD200 and CD200R in bladder,kidney,and adjacent tissue of carcinoma present different level.The expressions of CD200R in bladder,and both CD200 and CD200R expression in kidney tissue significantly reduced,especially with CD200R decreases.Conclusion CD200 and CD200R expressed in bladder,kidney were found,and which presents certain difference.The results suggest that CD200 and CD200R are the potential elements of prompting the immune regulation in tumor microenvironment.

CD200;CD200R;bladder;kidney;tumor microenvironment;immune regulation

吉林省基因工程藥物工程實驗室建設項目(吉發改高技【2011】1084號)

1007-4287(2016)10-1661-03

R737.11 R737.13

A

2015-03-27)

*通訊作者