外周血TTC7B基因高表達可能作為急性心肌梗死風險評估的分子標記

鄭 廣，楊玉雙，劉冬娜，施凱耀，孟繁波

(吉林大學中日聯誼醫院 心血管內科，吉林 長春130033)

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外周血TTC7B基因高表達可能作為急性心肌梗死風險評估的分子標記

鄭 廣，楊玉雙，劉冬娜，施凱耀，孟繁波*

(吉林大學中日聯誼醫院 心血管內科，吉林 長春130033)

冠心病(CAD)和急性心肌梗死(AMI)發病率呈逐年增高趨勢，其中遺傳因素在這組疾病的發病和進展中起了重要作用[1]。全基因組關聯分析(GWAS)確立了多個與冠心病和急性心肌梗死疾病的相關位點，這些基因位點的功能包括炎性反應[2]、粥樣斑塊進展[3]、平滑肌細胞增殖[4]等。多項研究表明染色體9p21與冠心病和心肌梗死發病有關[5-7]，有報道稱9p21可促進動脈粥樣硬化[3]。多個基因位點(PSRC1 at 1P13.3,MIA3 at 1q41,and SMAD3 at 15q22.33)在促進或抑制細胞生長方面扮演了重要角色，這些生物學過程在動脈粥樣硬化斑塊進展和斑塊穩定性方面起著重要作用[11]。

然而，作為冠狀動脈粥樣硬化性心臟病，從穩定型心絞痛(SA)向急性心肌梗死演變的過程中是否有遺傳因素參與，仍不清楚。本研究通過檢測TTC7B基因在AMI病人中表達量，從而明確TTC7B基因在SA向AMI轉變中是否發揮作用。

1 資料及方法

1.1 臨床資料

選取在2014年11月-2015年3月期間在吉林大學中日聯誼醫院住院的中國北方漢族人患者30人，其中穩定型心絞痛和急性心肌梗死分別為15人，并收集統計患者基線信息。所有患者均行冠狀動脈造影檢查明確診斷。本研究中，穩定型心絞痛診斷標準[9]和急性心肌梗死診斷標準[10]均按照最新國際指南執行。

穩定型心絞痛組15人(男∶女為9∶6)，平均年齡為58.67±6.82歲，所有患者平板運動實驗陽性，冠脈造影檢查顯示一個及以上的冠脈分支、段狹窄≥50%；急性心肌梗死組患者15人(男∶女為11∶4)，平均年齡為58.20±9.667歲，所有患者從出現癥狀到入院時間均<12 h。

排除標準：兩組入選者均排除靜脈血栓、嚴重肝腎功能不全、急慢性炎癥性疾病、腫瘤、血液病等。

實驗方案經吉林大學中日聯誼醫院倫理委員會審核通過，所有患者均簽署知情同意。

1.2 方法

1.2.1 總RNA和總蛋白提取 使用TIANGEN TRNzol-A+ Reagent總RNA提取試劑盒進行RNA提取，使用蛋白質提取試劑盒(中國武漢博士德生物科技公司)提取新鮮血液中總蛋白，實驗步驟參照說明書。使用分光光度計(Thermo NANODROP-2000)測定RNA濃度和純度，蛋白質濃度采用BCA法測定 。

1.2.2 引物設計與合成 利用NCBI生物信息學數據庫查詢TTC7B基因序列，設計TTC7B基因定量引物如表1所示，由上海生物工程股份有限公司合成。

表1 引物序列

1.2.3 cDNA的合成 使用TOYOBO Rever Tra Ace試劑盒。首先對RNA進行65℃變性反應，然后按以下體系加樣：RNA 7 μl(1 μg)，primer mix 0.5 μl,RT Enzyme Mix 0.5 μl,5×RT Buffer 2 μl,Total volume 10 μl。混勻后放入Applied Biosystems 9700 Thermocycler PCR儀中，37℃反應15 min，然后98℃變性5 min，迅速置于冰上，得到cDNA產物，-20℃保存備用。

1.2.4 熒光定量檢測穩定型心絞痛和急性心肌梗死患者外周血中TTC7B基因表達量 本實驗采用SYBR-GreenⅠ染料法對TTC7B基因行實時熒光定量PCR檢測。每個樣品設3個重復，以GAPDH作為內參。在進行PCR反應之前，將反轉錄產物進行1∶10稀釋，然后進行qPCR反應。Real-time PCR反應體系如下：cDNA 2 μl，PCR-Master Mix 10 μl，PCR-F-Primer 0.5 μl，PCR-R-Primer 0.5 μl，RNase free H2O 7 μl，Total volume 20 μl。充分混勻，并放入八連管中離心20 s后，放入Mx3005P熒光定量儀中進行擴增反應。反應條件為95℃預變性1 min；95℃變性5 s，60℃退火30 s，40個循環，反應結束之后，記錄 60℃-95℃溫度范圍內的熔解曲線及擴增曲線，產物4℃保存備用。數據由Mx3005P熒光定量PCR儀隨機附帶軟件計算得出。用 2-△△CT法進行相對定量的計算，所得數據用 SPSS23.0 軟件統計分析。

1.2.5 蛋白免疫印跡技術檢測心梗患者和冠心病患者中TTC7B基因表達量 隨機從所選患者中抽取6名患者，分別為3名心梗患者和3名冠心病患者進行蛋白質提取，將提取的蛋白質通過BCA法進行總蛋白濃度的測定，并且使用內參基因β-Actin進行蛋白均一性標定，最終通過western blot及灰度值分析來確定心梗患者和冠心病患者中TTC7B基因表達量的高低。

1.2.6 統計學處理 采用SPSS 23.0進行統計分析，計量資料采用t檢驗，用均數±標準差進行統計描述；計數資料采用卡方檢驗或fisher檢驗，用頻數和率進行統計描述；如P<0.05，則認為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 病人的基線資料 如表2所示，兩組患者在性別、年齡、體重指數(BMI)、吸煙史、飲酒史、膽固醇水平、甘油三酯水平、低密度脂蛋白水平、高密度脂蛋白水平、是否合并高血壓、是否合并糖尿病均無顯著差異(P>0.05)。

表2 病人基線資料統計分析

注：*為fisher檢驗

2.2 RNA提取結果 經2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(如圖1)，RNA提取效果較好，沒有降解。

2.3 TTC7B基因mRNA的表達量檢測 qPCR溶解曲線和擴增曲線表明(如圖2)，TTC7B基因和內參基因GAPDH擴增條帶單一，無引物二聚體和非特異性條帶，擴增效率較好。從冠心病患者和心梗患者檢測結果可以看出，TTC7B基因在心梗患者的表達量為冠心病患者的3.24倍(如圖3)(P<0.01)。

注：泳道1-4為RNA的提取結果，M為DL2000 marker

圖2 TTCTB基因和GAPDH基因溶解曲線和擴增曲線

2.4 TTC7B基因蛋白表達量檢測 經過蛋白質免疫印跡檢測表明，內參基因β-Actin條帶均一，蛋白表達量一致，說明總蛋白上樣量一致。而TTC7B基因在心梗組患者中表達水平高于冠心病組患者(如圖4)。

圖3 TTCTB基因的mRNA表達量 圖4 TTC7B基因的蛋白質表達量

3 討論

本研究表明TTC7B基因在AMI患者外周血中表達量為SA組的3.24倍。同時，我們在蛋白表達水平也證實了該結果。與SA相比，TTC7B基因在AMI病人外周血中表達量增高，我們推測TTC7B基因可能參與了AMI的發病，在動脈粥樣硬化性心臟病由穩定型心絞痛向急性心肌梗死轉變過程中起了作用。

一般認為，冠心病和急性心肌梗死為“同一種疾病”，表現為兩者均存在冠狀動脈狹窄，而急性心肌梗死是在冠心病基礎上發生的粥樣斑塊破裂或持續痙攣，堵塞冠脈造成遠端心肌的持續缺血、缺氧而發生壞死，常可導致惡性心血管事件發生，其致死率高。急性心肌梗死是冠心病最嚴重的臨床表型，兩者之間有著共同的危險因素,如糖尿病、高膽固醇血癥、高血壓、BMI、吸煙、肥胖、高脂飲食等[11]，這些危險因素對CAD和AMI的發病起了重要作用。然而，本研究中的2組病人性別、年齡、體重指數(BMI)、吸煙史、飲酒史、膽固醇水平、甘油三酯水平、低密度脂蛋白水平、高密度脂蛋白水平以及是否合并高血壓病、是否合并糖尿病均無顯著差異(P>0.05)。因此，可以明確，TTC7B基因獨立于上訴已知危險因素，可能是AMI發病的又一獨立危險因素。我們可以合理推測，TTC7B基因對冠狀動脈粥樣硬化性心臟病由SA向AMI轉變起了作用，因此，該基因可能作為評估AMI發病的基因危險因素。

全基因組關聯研究發現，TTC7B基因在心腦血管疾病的發生過程中存在重要的作用，在葡萄牙人和西班牙人的缺血性中風群體中，TTC7B基因第5、6內含子中單堿基突變的頻率相對較高[12]。也有研究表明，TTC7B基因的甲基化會加速機體老化，從而引起心血管機能的退化[13]。CHIKV會導致少數患者出現腦膜腦炎、心肌炎及皮膚黏膜出血等癥狀，TTC7B與CHIKV蛋白的結合會有效的提高CHIKV的作用效率[14]。

Otowa T等研究發現，TTC7B基因在焦慮癥的發生過程中可能存在調節作用[15]，而焦慮癥是導致冠心病發生的重要因素之一[16]。然而，本研究所選病人均未行心理檢測，尚不能明確是否因為焦慮導致了AMI的發病。

在對正常小鼠與肥胖性小鼠模型的比較中得知，TTC7B基因在兩種動物模型中的表達量差異性顯著，從而表明TTC7B基因可能是肥胖病發生的一個重要的調節因子，并且在導致肥胖發生的同時也會引起血管內皮生成發生變化，最終導致肥胖病人血管疾病的發生[17]。肥胖是心血管疾病的危險因素之一，對心血管事件的發生起了重要作用。本研究中的病人BMI基線值無顯著差異，因此，TTC7B基因促使SA向AMI轉變過程的機制，與其影響肥胖的機制可能無關。

TTC7B是TPR基因家族中的一員。TPR是由34個氨基酸組成的重復序列，其結構域常形成螺旋-轉角-螺旋結構，并在其內部形成空隙[18，19]。這些TPR結構一般作為大分子復合物蛋白相互作用的組件，并涉及到多種細胞生物學過程，如轉錄調節、mRNA修飾、蛋白折疊及轉移等[20]。然而，目前為止TTC7B的功能尚不明確。

在本研究中，我們首次發現在冠狀動脈粥樣硬化性心臟病中，TTC7B基因在SA和AMI均有表達，但與SA相比，TTC7B基因在AMI組表達升高，我們合理推測TTC7B基因參與了AMI的發病。然而，TTC7B基因導致AMI發病是否合并上述機制尚不得知，因此，對TTC7B基因進一步研究尤為必要。

致謝：我們衷心感謝吉林大學畜牧獸醫學院趙志輝教授和他的研究團隊對本實驗的技術指導。

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2008年教育部新世紀優秀人才、2004年度吉林省杰出青年科學研究計劃、吉林省科技廳項目(20090734)、吉林省財政廳項目(2012009)

1007-4287(2016)10-1723-04

2015-08-17)

*通訊作者