兒童特發(fā)性血小板減少性紫癜Th亞群細胞因子測定與骨髓巨核細胞分類的意義

唐玉蓉，孫婷婷，王際亮，伊心浩

(山東省勝利油田中心醫(yī)院1.檢驗科；2.科教科,山東 東營257034)

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*通訊作者

兒童特發(fā)性血小板減少性紫癜Th亞群細胞因子測定與骨髓巨核細胞分類的意義

唐玉蓉1，孫婷婷1，王際亮1，伊心浩2*

(山東省勝利油田中心醫(yī)院1.檢驗科；2.科教科,山東 東營257034)

據報道兒童免疫性血小板減少性紫癜(ITP)的發(fā)病率為1.9-6.4/10萬[1]，由于病因、發(fā)病機理仍不十分明確，推測與多種誘因有關，導致機體出現(xiàn)細胞免疫和體液免疫紊亂。本研究通過判斷患兒的Th1/ Th2細胞因子極化狀態(tài)及Th3細胞因子與骨髓原幼巨核細胞是否有相關性，旨在探討Th各類型細胞因子與ITP發(fā)病的關系。

1 資料和方法

1.1 研究對象

2014年1月至2016年1月在勝利油田中心醫(yī)院兒科住院且初次確診為ITP患兒。依據張之楠[2]主編的《血液病診斷及療效標準》作為診斷標準。急性特發(fā)性血小板減少性紫癜(aITP)患兒24例，男性10例，女性14例，年齡在2.7歲到13.4歲之間；慢性特發(fā)性血小板減少性紫癜(cITP)患兒20例，男性11例，女性9例，年齡在2.1歲到12.3歲之間。對照組為同期骨髓檢查基本正常的住院兒童25例，男10例，女15例，年齡在2.5歲到12.8歲之間。各實驗對象需排除感染，且近期無手術及創(chuàng)傷。年齡和性別各組無統(tǒng)計學差異(P>0.05)。

1.2 儀器和試劑

流式細胞儀為Epics XL型(美國Beckman coulter公司)，Elx80型酶聯(lián)免疫儀(美國BioTeic公司)，F(xiàn)ITC-Cy5-抗人CD3單克隆抗體、PE-抗人CD8單克隆抗體及IgG同型對照、FITC-抗人IFN-γ單克隆抗體、PE-抗人IL-4單克隆抗體均購自美國BD公司，淋巴細胞分層液、伏波酯乙醇(PMA)、離子霉素(ionomycin)和蛋白轉運抑制劑莫能霉素(monensin)均為Sigma公司的產品，紅細胞裂解液(美國ImmunoProbe公司)，Reagent A和Reagent B均為An Der Crub公司的產品。TGF-β1 ELISA檢測試劑盒為科華生物公司產品。

1.3 方法

1.3.1 細胞培養(yǎng) ①無菌采集ITP患兒肝素抗凝的靜脈血4 ml，先取100 μl新鮮抗凝血，用RPMI1640[不含小牛血清-磷酸鹽緩沖液(PBS)]1∶1等體積稀釋。加1 μg/mL PMA12 μl、1 μg/mL離子霉素4 μl及1 mg/mL的莫能霉素3.4 μl混勻；37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)4-6 h。②另取3 ml新鮮抗凝血，用密度梯度離心法分離PBMC，用含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液調整PBMC密度為1×109/L；取2 ml細胞懸液加入PMA(終濃度為50 μg/L)和離子霉素(終濃度為1 μmol /L)，置37℃溫箱中培養(yǎng)過夜，收集上清置-70℃凍存待測細胞因子。

1.3.2 細胞染色 將培養(yǎng)后的外周血細胞平均分為A、B兩管，各加入20 μl CD3、CD8單抗混勻，37℃避光孵育15 min；加固定劑A 200 μl 37℃避光孵育15 min，加PBS 3 ml震蕩，1200 r/min離心5 min。棄上清后，A管和B管同時加破膜劑B 100 μL，A管加抗IFN-γ、IL-4單抗，B管加入同型對照IgG單抗，37℃避光孵育15 min，PBS洗滌、離心、棄上清液。最后以PBS懸浮細胞，經流式細胞儀檢測樣本CD3+，CD8-細胞中表達IFN-γ，IL-4的陽性百分比。

所得數據采用Partec軟件進行分析，以CD3+，CD8-設門表達CD4+T細胞(Th)，分析標本中Th1和Th2細胞占CD4+T細胞的比例。

1.3.3 TGF-β1檢測 取上述凍存的PBMC培養(yǎng)上清，ELISA檢測其TGF-β1的水平，操作按試劑盒說明進行，酶聯(lián)儀上測定450 nm波長吸光度(A450)。

1.3.4 骨髓片姬姆薩-瑞氏染色，自然干燥后在低倍鏡下查找骨髓巨核細胞，并在油鏡下進行分類。

1.4 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 外周血Th細胞分泌的因子在ITP患兒與正常對照兒童中水平變化

外周血Th1細胞表達的IFN-γ在aITP患兒中的百分比較正常對照組顯著增高 (P<0.05)；在cITP患兒中較對照組顯著降低 (P<0.01)；aITP、cITP和對照組三組之間的差異有顯著性(P<0.05)。Th2細胞表達的IL-4因子在aITP患兒中的表達較對照組低(P>0.05)，兩組間無顯著性差異；在cITP患兒中的表達高于對照組(P<0.05)，有顯著性差異。在aITP患兒中Th1/Th2較對照組升高，有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；在cITP患兒中Th1/Th2較對照組降低，有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。在aITP患兒中的外周血單個核細胞Th3細胞表達的因子TGF-β1水平較對照組顯著降低(P<0.05)，而cITP患兒的TGF-β1水平較aITP組顯著降低(P<0.05)；aITP、cITP和對照組三組間有顯著性差異，結果見表1。

表1 ITP患兒與正常對照兒童外周血中細胞因子水平比較±s)

與對照組比較，△△P<0.01，△P<0.05；與aITP組比較，#P<0.05

2.2 ITP患兒外周血單個核細胞TGF-β1與骨髓原幼巨核細胞百分比分析

實驗表明，外周血單個核細胞TGF-β1因子水平在aITP患兒中的表達與骨髓原、幼巨核細胞百分比呈現(xiàn)負相關，外周血單個核細胞TGF-β1因子水平在cITP患兒中與骨髓原、幼巨核細胞正相關，結果見表2和圖1。

表2 外周血單個核細胞TGF-β1與骨髓原、幼巨核細胞之間相關性分析

圖1 外周血單個核細胞TGF-β1與骨髓原、幼巨核細胞之間相關性分析

3 討論

免疫性血小板減少癥在兒童出血性疾病中最為常見，各年齡段均可以發(fā)病，國內文獻報道兒童ITP 3歲以下嬰幼兒多見[3]，且隨著年齡的增長，兒童cITP的發(fā)病率呈增長趨勢。近年來越來越多的研究支持免疫功能紊亂是ITP發(fā)病的主要原因。淋巴細胞亞群、細胞因子表達及功能的變化引發(fā)了異常的體液免疫和細胞免疫，是ITP發(fā)病機制的基礎。其中免疫功能異常的T細胞，特別是CD4+T淋巴細胞在ITP的發(fā)病過程中免疫功能及其分泌的細胞因子起了非常重要作用。CD4+T淋巴細胞中Th1 亞型細胞因子的功能是通過介導機體細胞免疫來參與巨噬細胞的活化過程，代表因子有IL-2、IFN-γ； Th2亞型細胞因子的功能是通過介導機體體液免疫誘導機體產生抗體，代表因子有IL-4， IL-5， IL-10，但是IL-10可以由如單核細胞等非 T 細胞產生而影響其水平，而IL-4， IL-5主要由Th2 型細胞活化后分泌的。Th3亞型細胞的功能通過分泌免疫調節(jié)因子參與機體免疫耐受誘導，以能下調抗原提呈細胞的TGF-β1為代表。

本研究發(fā)現(xiàn)，外周血CD4+的IFN-γ因子 在aITP兒童組中高表達，提示aITP急性期時增強了外周血T細胞是從Th0細胞向Th1細胞分化，疾病優(yōu)勢表達Th1；而cITP組中外周血CD4+細胞的IFN-γ因子低表達及IL-4因子的高表達，提示發(fā)病時，機體明顯減弱了外周血T細胞由Th0細胞向Th1細胞的分化，疾病相對優(yōu)勢表達Th2。TGF-β1的表達在兒童ITP患者中均低表達，提示機體對B細胞的抑制可能隨著TGF-β1因子的表達減低而減弱， B細胞增殖可能更活躍，更加容易激活抗血小板抗體對外周血血小板的作用，進一步加劇血小板的破壞；B細胞抑制減弱還會促進其誘導巨噬細胞的激活、加劇補體的形成和增強細胞毒的活性，最終大量破壞巨核細胞和外周血中的血小板而引發(fā)疾病。三種細胞因子在外周血中的不同變化，證實了cITP患兒和aITP患兒均存在不同程度機體細胞免疫和機體體液免疫異常，而體液免疫在cITP患兒中表現(xiàn)更明顯，提示機體的免疫紊亂則更為嚴重。

同時，我們也發(fā)現(xiàn)aITP和cITP患兒均存Th1/Th2功能極化異常。Dominguez等[4]在研究中發(fā)現(xiàn)Th1/Th2細胞間的平衡是影響免疫功能的重要環(huán)節(jié)。aITP和cITP的患兒細胞因子在本實驗中呈相反的極化改變，說明在免疫機制上，兩種疾病可能存在本質區(qū)別。細胞因子呈Th1優(yōu)勢表達的是aITP組患兒，提示機體的免疫功能亢進是由自身反應性細胞免疫引起的，而在相對優(yōu)勢表達Th2細胞因子的cITP患兒組則提示機體增強的是體液免疫，這與本實驗中Th3細胞因子表達TGF-β1結果相一致，均提示cITP體液免疫更明顯。

同時，TGF-β1主要是由骨髓幼稚巨核細胞分泌，外周血單個核細胞TGF-β1含量降低，可能反映骨髓幼稚巨核細胞生成TGF-β1障礙。aITP患兒的原幼稚巨核細胞比例明顯增多，且TGF-β1含量與之呈負相關，驗證了該推測。cITP患兒骨髓中原、幼稚巨核比例正常，其結果與外周血單個核細胞TGF-β1含量正相關，提示TGF-β1在aITP和cITP中的發(fā)病機制不同，可能參與了aITP的發(fā)病機制。

aITP患兒中TGF-β1濃度低于正常組對照，有觀點認為Tr細胞活化后，可通過分泌TGF-β1等抑制性細胞分子調節(jié)T細胞功能，由于aITP中的Tr細胞活化受抑制導致TGF-β1含量下降，使T細胞功能混亂，導致抗血小板抗體增多，血小板破壞增多[5]。而TGF-β1主要是由幼稚巨核細胞生成，外周血單個核細胞分泌的TGF-β1降低考慮可能與骨髓巨核細胞分泌TGF-β1障礙相關，提示其可能作為aITP患兒療效檢測的因子，相互之間的作用機制有待遇進一步探討研究。

在cITP中，外周血單個核細胞分泌的TGF-β1的變化與骨髓原幼巨核細胞比例正相關，提示可能與全身免疫異常有關系，除了骨髓外，其他細胞影響TGF-β1分泌所致[6]。本研究cITP的病例較少，TGF-β1 在cITP中發(fā)揮的作用可能更復雜，有待于進一步擴大樣本研究。

[1]Terrell DR,Beebe LA,Vesely SK,et al.The incidence of immune thrombocytopenic purpura in children and adults:A critical review of published reports[J].Am J Hematol,2010,85(3):74.

[2]張之楠.血液病診斷及療效標準[M].第3版.北京：科學出版社,2008:172-175.

[3]劉德新,廖寧.兒童急性特發(fā)性血小板減少性紫癜125例臨床分析[J].中國小兒血液與腫瘤雜志,2012,17(3):129.

[4]Dominguez garcia MV，Rodriguez Moyado H.Cellular and biochemical mechanisms involved in physiopathgenesis of autoimmune thrombocytopenic purpura[J].Gac Med Mex，2002，15(3)：461.

[5]Maloy KJ,Salamn L,Cahill R,et al.CD4+CD25+T(R) cells suppress immune pathology cytokine-dependent mechanisma[J].J Exp Med,2003,197:111.

[6]胡洪玻,胡 群,胡 迎.小兒特發(fā)性血小板減少性紫癜骨髓巨核細胞轉化生長因子-β1改變及意義[J].中國實用兒科雜志,2008，23(11):812.

1007-4287(2016)10-1746-03

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