地塞米松預處理及治療對ISO致小鼠急性心肌損傷影響的比較研究

張嚴高，余　磊，王建莉，尹戴佳佳，朱閩湘

(1.中國人民解放軍南京軍區杭州療養院療養一科，浙江 杭州 310007;2.浙江大學免疫研究所，浙江 杭州 310058;3.中國人民解放軍第117醫院神經外科，浙江 杭州 310013)

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·論著·

地塞米松預處理及治療對ISO致小鼠急性心肌損傷影響的比較研究

張嚴高1，余磊2，王建莉2，尹戴佳佳1，朱閩湘3*

(1.中國人民解放軍南京軍區杭州療養院療養一科，浙江 杭州 310007;2.浙江大學免疫研究所，浙江 杭州 310058;3.中國人民解放軍第117醫院神經外科，浙江 杭州 310013)

目的觀察地塞米松(dexamethasone,DEX)對異丙腎上腺素(isoprotereno，ISO)致小鼠急性心肌缺血損傷的影響并探討其作用機制。方法將16只昆明種小鼠隨機分成正常對照(control,CON)組4只、ISO組4只、地塞米松預處理(dexamethasone pretreatment,DEX-pre)組4只、DEX組4只。CON組、ISO組首次處理前30 min給予等量0.9%氯化鈉注射液腹腔注射預處理。CON組給予等量0.9%氯化鈉注射液腹腔注射處理。ISO組給予5 mg/kg ISO，每日腹腔注射1次，連續3 d。DEX-pre組在首次ISO注射前30 min給予DEX 1.25 mg/kg腹腔注射，余同ISO組。DEX組在第2天、第3天ISO注射30 min后給予DEX 1.25 mg/kg腹腔注射，余同ISO組。在HE染色光鏡下觀察心肌組織的病理學改變；酶聯免疫吸附測定法檢測血清腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor alpha,TNF-α)的變化；流式細胞分析檢測脾臟T細胞亞群(殺傷性T細胞即CD4+T細胞、 抑制性T細胞即CD8+T細胞、激活的殺傷性T細胞即CD4+CD69+T細胞、激活的抑制性T細胞即CD8+CD69+T細胞)變化。結果①與ISO組比較，DEX-pre組心肌損傷得到明顯改善(P<0.05)，DEX組無明顯變化(P>0.05)。②DEX組TNF-α含量明顯高于CON組、ISO組和DEX-pre組，差異有統計學意義(P<0.05)。③DEX-pre組CD4+T細胞、CD4+CD69+T細胞、CD8+CD69+T細胞與其他3組差異有統計學意義(P<0.05)，其他3組之間差異無統計學意義(P>0.05)；DEX-pre組CD8+T細胞低于其他3組，DEX組低于CON組與ISO組，差異均有統計學意義(P<0.05)。結論DEX預處理對ISO致小鼠急性心肌缺血損傷的心肌具有明顯保護作用，而損傷后給予DEX治療則無保護作用。可能機制與DEX預處理導致免疫功能改變及炎性細胞因子改變相關，確切機制有待進一步研究。

心肌缺血；地塞米松；異丙腎上腺素doi:10.3969/j.issn.1007-3205.2016.10.011

目前認為地塞米松(dexamethasone,DEX)可以通過炎癥信號通路削弱實質性臟器缺血-再灌注損傷，這為臨床預防急性損傷提供了新的選擇和理論支持。進一步研究提示削弱炎癥反應可減輕急性心肌缺血損傷，且證實DEX等藥物預處理對心臟缺血-再灌注損傷、腎臟缺血-再灌注損傷等有誘導早期保護和延遲保護作用[1-2]。本研究觀察地塞米松預處理或治療對異丙腎上腺素(isoprotereno，ISO)致小鼠急性心肌缺血損傷影響，旨在探討臨床應用的可行性。

1　材料與方法

1.1實驗動物、主要試劑及儀器昆明種小鼠：雄性，體質量20～22 g，浙江大學實驗動物中心提供，實驗動物合格證號2007000580817，許可證號SCXK(滬)2012-0002。鹽酸異丙腎上腺素注射液：上海禾豐制藥有限公司，產品批號131003。地塞米松磷酸鈉注射液：湖北天藥藥業股份有限公司，產品批號1408231。流式細胞儀：美國Becton Dickinso公司。Anti-CD4 FITC antibody：美國Ebioscience公司，克隆號RM4-4，貨號11-0043-85，批號E00087-1632。Anti-CD8a APC antibody：美國Ebioscience公司，克隆號53-6.7，貨號100711，批號B177121。Anti-CD69 PE antibody：美國Ebioscience公司，克隆號H1.2F3，貨號12-0691-83，批號B177121。腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor alpha,TNF-α)ELISA試劑盒：美國Ebioscience公司，貨號BMS607HS。

1.2動物模型制備與分組采用腹腔注射ISO建立小鼠急性心肌缺血模型。將16只小鼠隨機分為正常對照(control,CON)組、ISO組、地塞米松預處理(dexamethasone pretreatment,DEX-pre)組、地塞米松治療(dexamethasone treatment,DEX)組各4只。CON組、ISO組首次處理前30 min給予等量0.9%氯化鈉注射液腹腔注射預處理。CON組給予等量0.9%氯化鈉注射液腹腔注射處理。ISO組給予5 mg/kg ISO，腹腔注射1次/d，連續3 d。DEX-pre組在首次ISO注射前30 min給予DEX 1.25 mg/kg腹腔注射，余同ISO組。DEX組在第2天、第3天ISO注射30 min后給予DEX 1.25 mg/kg腹腔注射，余同ISO組。第4天各組小鼠用10 g/L戊巴比妥鈉(50 g/kg)麻醉，在超凈臺中進行心臟取血后取全心室，并取脾臟。全血以3 500 r/min離心15 min，分離取血清，轉置于-20 ℃低溫冰箱保存待測。

1.3心臟組織HE染色取心臟后以4%多聚甲醛固定，常規石蠟包埋整個心臟，間斷連續切片，切片厚約5 μm，常規HE染色，光鏡下觀察各組心肌病理改變。形態學計分標準[3]：0級，心肌細胞排列緊密，橫紋清晰，心肌纖維染色均勻，核居中，間質未見血管擴張及炎細胞浸潤，組織間隙無水腫，無出血壞死，心外膜、心內膜無異常計0分；Ⅰ級，心肌細胞排列稀疏，間質血管擴張及少量炎細胞浸潤，肌漿分布不勻，心肌間質水腫，無出血，可見心肌散在的點狀壞死，主要為凝固性壞死灶，局限在心內膜下，計2分；Ⅱ級，部分心肌壞死灶呈片狀分布，灶間無連接，病變累及心壁全層，間質可見血管擴張及炎細胞浸潤，有灶性出血，心肌間質有炎性出血及心肌間質水腫，計4分；Ⅲ級，心肌廣泛性大片壞死，灶間相互連接累及心壁全層，有明顯的間質血管擴張、水腫、出血及炎細胞浸潤，計6分。

1.4ELISA檢測TNF-α取低溫冰箱保存血清雙抗體夾心ELISA法檢測血清中炎性細胞因子TNF-α的含量變化。

1.5流式細胞分析剝除小鼠脾臟表面結締組織被膜后在200目不銹鋼網中輕輕研磨，PBS液洗滌2次后加Tris-NH4Cl液裂解紅細胞，再洗滌并調整細胞濃度為1×106/100 μL。取上述各組織單個核細胞懸液100 μL 加入CD4、CD8、CD69熒光抗體，常規設置平行空白對照，4 ℃避光孵育30 min,PBS洗3遍后，用流式細胞儀進行檢測，檢測小鼠脾臟單個核細胞的T細胞亞群(殺傷性T細胞即CD4+T細胞、 抑制性T細胞即CD8+T細胞、激活的殺傷性T細胞即CD4+CD69+T細胞、激活的抑制性T細胞即CD8+CD69+T細胞)在ISO致心肌缺血損傷及使用DEX后的變化情況。

1.6統計學方法應用SPSS 16.0軟件進行數據分析。計量資料比較分別采用單因素方差分析和SNK-q檢驗；等級資料比較采用秩和檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2　結　　果

2.1各組心肌組織病理學改變HE染色顯示：CON組心肌細胞排列整齊、致密，胞質著色均勻，胞核清晰，間質細胞無增生，未見炎性滲出，無水腫(圖1A、E)；ISO組心肌細胞體積增大呈圓形或類圓形，排列紊亂，細胞核固縮深染，血管和心肌細胞之間可見纖維增多、炎性細胞浸潤、少許淋巴細胞浸潤，少量紅細胞外滲，多處見局灶性壞死(肌溶解、核消失或不著色)(圖1B、F)。DEX-pre組心肌損害較ISO組明顯減輕，可見殘存正常肌纖維明顯增多(核圓形、有核仁，胞漿深紅色)，局灶性壞死明顯減少散在的點狀，肌纖維排列紊亂改善，血管和心肌細胞之間未見纖維增多、炎性細胞浸潤、淋巴細胞浸潤(圖1C、G)；DEX組肌纖維間充血水腫明顯，可見殘存少許正常肌纖維，多處見肌溶解、核消失或不著色的局灶性壞死，炎性細胞浸潤不明顯(圖1D、H)。

各組損傷程度差異有統計學意義(P<0.05)，兩兩比較結果顯示 ISO組、DEX組與CON組差異有統計學意義(P<0.05)，見表1。

圖1光鏡下心肌組織形態結構

A.CON組(HE ×200);B.ISO組(HE ×200);C.DEX-pre組(HE ×200);D.DEX組(HE ×200);E.CON組(HE ×400);F.ISO組(HE ×400);G.DEX-pre組(HE ×400);H.DEX組(HE ×400)

Figure 1The structure of myocardial tissue

表1　各組心肌病理損傷程度比較Table 1　The degree of myocardial injury　，例數)

*P<0.05與CON組比較(秩和檢驗)

2.2各組血清TNF-α含量比較DEX組TNF-α含量明顯高于CON組、ISO組和DEX-pre組，差異有統計學意義(P<0.05)，見表2。

2.3各組脾臟T細胞亞群變化DEX-pre組CD4+T細胞、CD4+CD69+T細胞、CD8+CD69+T細胞與其他3組差異有統計學意義(P<0.05),其他3組之間差異無統計學意義(P>0.05)。DEX-pre組CD8+T細胞低于其他3組，DEX組低于CON組和ISO組，差異均有統計學意義(P<0.05)。見表3。

表2各組血清TNF-α含量比較

組別 TNF-α含量CON組1.58±0.21*ISO組2.35±0.42*DEX-pre組0.42±0.09*DEX組18.73±2.80 F148.993 P0.000

*P<0.05與DEX組比較(SNK-q檢驗)

表3各組脾臟CD4+、CD8+、CD69+T細胞表達比較

組別 CD4+T細胞CD8+T細胞CD4+CD69+T細胞CD8+CD69+T細胞CON組18.50±0.70*#9.66±0.37*#12.10±0.65*6.44±0.32*ISO組15.50±0.90*13.20±0.50*#18.00±0.68*5.89±0.31*DEX-pre組3.90±0.213.55±0.1438.80±1.967.79±0.56DEX組16.00±1.20*9.01±0.36*15.80±1.43*5.37±0.30* F320.215811.337406.10112.016 P0.0000.0000.0000.000

*P<0.05與DEX-pre組比較#P<0.05與DEX組比較(SNK-q檢驗)

3　討　　論

采用腹腔注射ISO是建立小鼠急性心肌缺血的常用模型。連續注射ISO使心肌中氧化應激劇增，導致氧自由基聚集，可使生物膜磷脂在結構與功能方面發生異常變化，細胞膜通透性增高，肌漿內的可溶性酶大量釋放進入血液中，使血清心肌酶水平顯著升高，導致心肌缺血損害[3-4]。糖皮質激素通過調節細胞生長、發育、自身穩定和細胞凋亡來維持機體組織細胞的平衡及其功能， 而且糖皮質激素具有抗炎等作用。以往研究表明DEX預處理可使缺血-再灌注后心肌損傷程度明顯減輕，減少炎癥因子單核細胞趨化因子1、TNF-α的表達，使炎癥控制在一定的水平[5]。本研究探索DEX預處理及治療對急性心肌缺氧損傷效應，并研究細胞因子TNF-α及T細胞亞群變化(CD4+、CD8+、CD69+)發揮的作用，旨在為DEX在不穩定性冠心病，尤其是急性心肌梗死超早期臨床應用提供依據。本研究ISO損傷后心肌局灶性壞死明顯，給予DEX預處理心肌損害明顯減輕，給予DEX治療心肌損害無明顯改變，證實DEX預處理對ISO致小鼠急性心肌缺血損傷的心肌具有明顯保護作用，而損傷后給予DEX治療則無保護作用。

TNF-α不僅是有效的腫瘤殺傷因子，還是重要的前炎性細胞因子和免疫調節因子，在介導炎癥反應中有很重要的作用。在心肌受損和超負荷時，心肌細胞和成纖維細胞中TNF-α等炎癥調節因子表達上調[6]；臨床觀察研究提示冠心病患者血清TNF-α水平明顯高于正常人，而且隨病情的加重而升高，且TNF-α在急性心肌梗死發病早期即可明顯升高，檢測TNF-α對急性心肌梗死早期診斷具有重要意義[7-9];另外， TNF-α水平的升高與心肌功能抑制有明顯的相關性[10]，而在阿托伐他汀治療急性腦梗死中升高的TNF-α下降更為明顯[11]。本研究顯示ISO損傷后TNF-α明顯升高與上述一致，說明血清TNF-α與急性心肌缺氧損傷有一定相關性。進一步血清TNF-α含量檢測顯示經DEX預處理，ISO導致TNF-α有下降，與以往DEX對小鼠心肌缺血-再灌注損傷、腎缺血-再灌注損傷、腦出血大鼠腦水腫引起TNF-α水平改變的報道相符[12]；且經DEX預處理TNF-α低于CON,可能DEX預處理在ISO導致心肌損傷中抑制TNF-α等炎性細胞因子作用比心肌缺血-再灌注損傷更明顯，其更有實用性。在ISO導致損傷后給予DEX治療TNF-α反之明顯升高，說明DEX治療無明顯得益。因此，認為DEX預處理對ISO所致小鼠心肌缺血明顯的保護作用中TNF-α水平的改變發揮重要的作用。可能的機制：TNF-α是強有力的促炎癥細胞因子，降低炎癥暴發，使炎癥控制在一定的水平，可減輕心肌缺血損傷；DEX預處理還可有抗凋亡等作用，減輕心肌缺血損傷。 在急性心肌缺血缺氧損傷中，DEX預處理可誘導早期保護和延遲保護作用， 尤其后者保護時間長而更具潛在的實用價值，較長時間處于一種預處理的保護狀態，為其臨床應用的意義。

CD4+T細胞和CD8+T細胞都是炎性T細胞，通過分泌細胞因子來調節機體免疫功能，起到誘導和輔助細胞及體液免疫的作用。CD69是T淋巴細胞激活后最早表達的表面抗原，已有大量研究表明，CD69的表達可以抑制機體炎癥反應，具有調節機體免疫平衡的功能。CD69可作為細胞的活化標記物,當其表達后，可作為共刺激信號促進細胞進一步活化和增殖，且CD69的表達與細胞的凋亡密切相關[13]。研究表明，CD69分子在急性腦梗死發生的早期(72 h之內)表達顯著增高，且在發病的第7天仍然高表達，活化的T細胞以多種形式損傷血腦屏障，參與疾病的發展過程[14]；通過應用外源性生物反應調節劑調節機體內T細胞亞群CD3、CD4、CD8的表達水平可以輔助免疫治療[15]；心肌組織中存在肌源性干細胞，且功能受損的心肌應用成肌細胞等肌源性細胞移植到心臟可生成大量心肌細胞，并促進周圍血管、神經再生，幾乎不觸發受植區的免疫反應[16]。均提示免疫調節在心肌損傷中發揮一定作用。本研究結果顯示DEX-pre組CD4+T細胞、CD8+T細胞明顯下降，并CD4+CD69+T細胞、CD8+CD69+T細胞明顯增高，病理示炎性細胞浸潤減少，說明經DEX預處理后，免疫功能明顯被雙重抑制，可能對損傷心肌細胞起到重要保護作用。DEX組CD8+T細胞有所下降， 而CD4+T細胞、CD8+CD69+T細胞、CD8+CD69+T細胞無明顯改變，沒有出現相似保護作用。證實CD4+T細胞、CD8+T細胞和早期激活的T細胞(CD4+CD69+T細胞、CD8+CD69+T細胞)可能共同參ISO對心肌細胞損傷過程，CD4+T細胞、CD4+CD69+T細胞作用更為重要。DEX預處理對ISO損傷心肌保護作用可能與 CD4+T細胞、CD8+T細胞雙重抑制，以及TNF-α等炎性細胞因子明顯抑制協同作用密切有關；而DEX治療不產生CD4+T細胞和CD8+T細胞雙重均衡抑制， TNF-α等炎性細胞因子反而明顯增高，所以也就不產生這種保護作用。因此，推斷DEX預處理對免疫功能與炎性細胞因子的改變是其對心肌缺血缺氧保護作用的重要機制之一。

綜上所述，在ISO所致急性心肌細胞缺血損傷中，DEX預處理可以明顯改善心肌損傷,而給予DEX治療則沒有這種保護作用，其相關機制可能與DEX預處理導致T細胞亞群介導免疫應答功能改變和TNF-α等細胞因子的變化有關，這為DEX預處理治療方法在不穩定性冠心病，尤其是急性心肌梗死超早期中的應用提供了依據。其確切機制有待進一步研究。

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(本文編輯：劉斯靜)

A comparative study on the effects of dexamethasone pretreatment and treatment on acute myocardial injury induced by isoproterenol in mice

ZHANG Yan-gao1， YU Lei2, WANG Jian-li2, YIN Dai-jia-jia1, ZHU Min-xiang3*

(1.The First Department of Sanatorium, Hangzhou Sanatorium of Nangjing Military Area Command,Zhejiang Province, Hangzhou 310007, China; 2.Institute of Immunology, Medicine School of Zhejiang University, Hangzhou 310058, China; 3.Department of Neurosurgery,117 Hospital of PLA, Zhejiang Province, Hangzhou 310013, China)

ObjectiveTo investigate the potential protective effect of glucocorticoid receptor agonist dexamethasone on isoproterenol(ISO)-induced myocardial injury and the possible mechanism. MethodsThe sixteen mice were randomly divided into control(CON) group(n=4)， ISO group(n=4), dexamethasone pretreatment(DEX-pre) group(n=4) and dexamethasone treatment(DEX) group(n=4). The mice in CON group and ISO group were given the same amount of 0.9% sodium chloride and DEX-pre group given dexamethasone(1.25 mg/kg) injection by intraperitoneal injection as a pretreatment at 30 minutes before treatment. CON group was given the same amount of 0.9% sodium chloride injection by intraperitoneal injection; ISO group, DEX-pre group and DEX group received 5 mg/kg isoproterenol hydrochloride, daily intraperitoneal injection of 1time, for 3 consecutive days. At the second and third day, dexamethasone(1.25 mg/kg) was given after ISO injected for 30 minutes in DEX group. Myocardial tissue injury was assessed by HE staining. Flow cytometry was adopted to detect the expression of CD4+T， CD8+T， CD4+CD69+T， CD8+CD69+T cells in spleen. Results①Compared with ISO group， the degree of myocardial injury were greatly improved(P<0.05); the degree of myocardial injury wasn't significantly difference in DEX group(P>0.05). ②The expression of TNF-α in serum in DEX group was significantly difference to the other group(P<0.05). ③The expression 0f CD4+T， CD4+CD69+T， CD8+CD69+T cells in DEX-pre group was significantly difference to the other group(P<0.05). The expression of CD8+T cells in DEX-pre group was significantly reduced to the other group(P<0.05). The expression of CD8+T cells in DEX group was significantly reduced to the control group and ISO group(P<0.05). ConclusionDEX pretreatment has protective effect against ISO-induced myocardial injury. But dexamethasone treatment don't have protective effect after injury. The mechanism might be the related with the changes of immune function and changes of inflammatory cytokines. The exact mechanism remains to be further studied.

myocardial ischemia; dexamethasone; isoproterenol

2015-08-07；

2015-12-01

張嚴高(1964-)，男，浙江東陽人，中國人民解放軍

。E-mail:hzlyylkzyg@163.com

R452.2

A

1007-3205(2016)10-1157-05

南京軍區杭州療養院主任醫師，從事老年心血管疾病診治及療養保

健研究。