銀杏黃酮、氨磷汀及亮丙瑞林對順鉑抑制卵巢惡性畸胎瘤細胞作用的影響

常　征，王惠蘭，喬宗旭，李　娜，馬華姝

(1.河北省邢臺市人民醫院產科，河北 邢臺 054000；2.河北醫科大學第二醫院婦科，河北 石家莊 050000)

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銀杏黃酮、氨磷汀及亮丙瑞林對順鉑抑制卵巢惡性畸胎瘤細胞作用的影響

常征1，王惠蘭2*，喬宗旭1，李娜1，馬華姝1

(1.河北省邢臺市人民醫院產科，河北 邢臺 054000；2.河北醫科大學第二醫院婦科，河北 石家莊 050000)

目的以惡性畸胎瘤PA-1細胞作為惡性生殖細胞腫瘤的代表，探討銀杏黃酮、氨磷汀及亮丙瑞林對順鉑抗腫瘤作用的影響。方法用細胞計數工具8(cell counting Kit-8，CCK-8)中方法檢測PA-1細胞增殖抑制率，免疫印跡法檢測胞漿細胞色素C(cytochrome c，Cyt-C)及凋亡蛋白酶活化因子1(apoptotic protease activating-1,Apaf-1)含量，實時定量聚合酶鏈反應(real-time polymerase chain reaction，RT-PCR)法檢測Cyt-C及Apaf-1信使核糖核酸 (message ribonucleic acid，mRNA)表達水平。結果各組PA-1細胞抑制率，Cyt-C、Apaf-1蛋白水平及mRNA水平比較，B、C、D、E均高于A組，C、D、E組高于B組，E組低于D組，差異有統計學意義(P<0.05)；E、D組PA-1細胞增殖抑制率、Cyt-C蛋白及Cyt-C mRNA、Apaf-1 mRNA高于C組，E組Apaf-1蛋白低于C組,差異有統計學意義(P<0.05)。結論在體外培養實驗中，順鉑對PA-1細胞存在明顯抑制效應，以其半抑制濃度(half maximal inhibitory concentration，IC50)所對應的銀杏黃酮、氨磷汀及亮丙瑞林劑量與其聯合應用，可增強順鉑對PA-1細胞的抑制作用，上調Cyt-C和Apaf-1 mRNA的表達水平，提高胞漿內Cyt-C和Apaf-1蛋白含量。三者比較以氨磷汀作用最強。

畸胎瘤；順鉑；氨磷汀；亮丙瑞林doi:10.3969/j.issn.1007-3205.2016.10.024

銀杏黃酮作用于惡性畸胎瘤PA-1細胞，與順鉑的抑瘤作用有協同作用[1]。氨磷汀在腫瘤組織及正常組織中的作用有差別[2-3]。亮丙瑞林在化療過程中對生殖細胞腫瘤有抑制作用。前期研究顯示，銀杏黃酮、氨磷汀及亮丙瑞林對順鉑所致卵巢損傷有一定的保護作用[4]，擬作為有生育要求的惡性畸胎瘤患者化療的輔助用藥，但3種藥物對順鉑抑制腫瘤細胞作用的影響無相關報道。本研究以PA-1細胞為研究對象，測定其細胞抑制率、胞漿細胞色素C(cytochrome c，Cyt-C)和凋亡蛋白酶活化因子1(apoptotic protease activating-1,Apaf-1)蛋白含量以及Cyt-C和Apaf-1mRNA含量，旨在探討銀杏黃酮、氨磷汀及亮丙瑞林在順鉑對PA-1抑制過程中的影響[5]。

1　資料與方法

1.1細胞來源PA-1細胞(編號ATCCCRL-1572，購自協和醫科大學細胞中心)。細胞培養條件：使用1640培養基，置于含5%CO2、飽和濕度、37 ℃恒溫培養箱中培養，每1～2 d傳代1次。

1.2細胞增殖抑制率的測定順鉑半抑制濃度 (half maximal inhibitory concentration，IC50)的確定：以不同濃度的順鉑作用于PA-1細胞，使用細胞計數工具8(cell counting Kit-8，CCK-8)法檢測細胞增殖抑制率，確定順鉑的作用時間和濃度。使用下列公式計算細胞增殖率及細胞增殖抑制率：細胞增殖率=[受試孔光密度(optical density，OD)值-本底對照孔OD值]/(對照細胞OD-本底對照OD值)×100%；細胞增殖抑制率=(1-細胞增殖率)×100%。

1.3細胞分組及用藥按照實驗要求，選取對數生長期細胞，按照每孔1×105個細胞的濃度鋪96孔板，加入培養液至每孔體積100 μL，培養24 h后分成5組，每組測10組數據，A組為生理鹽水組，B組為順鉑組，C組為銀杏黃酮+順鉑組，D組為氨磷汀+順鉑組，E組為亮丙瑞林+順鉑組，每組數據設3個復孔及本底對照孔(僅加培養基，無細胞)。根據表1測定結果，順鉑作用于PA-1細胞24 h ，其IC50為35.02 mg/L。根據人體臨床用藥劑量比例，確定銀杏黃酮、氨磷汀及亮丙瑞林的相應給藥濃度，分別為銀杏黃酮26.25 g/L、氨磷汀5.25 g/L及亮丙瑞林17.5 mg/L。

1.4檢測指標檢測各組細胞生長抑制率，評價藥物對順鉑作用的影響；免疫印跡法檢測胞漿Cyt-C及Apaf-1蛋白含量；實時定量聚合酶鏈反應(real-time polymerase chain reaction,RT-PCR)法檢測Cyt-C及Apaf-1 mRNA表達水平[6]。

順鉑濃度12h24h48h72h00.576±0.0100.615±0.0070.669±0.0200.756±0.0211mg/L0.554±0.0080.585±0.0080.605±0.0070.672±0.0062.5mg/L0.516±0.0060.534±0.0110.539±0.0160.572±0.0155mg/L0.495±0.0100.500±0.0120.472±0.0170.456±0.02610mg/L0.473±0.0100.467±0.0200.382±0.0190.414±0.01115mg/L0.459±0.0120.414±0.0110.331±0.0190.335±0.007

1.5統計學方法應用SPSS 18.0軟件包進行統計學分析。計量資料比較分別采用單因素方差分析和SNK-q檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2　結　　果

各組PA-1細胞增殖抑制率，Cyt-C、Apaf-1蛋白水平及mRNA水平比較：B、C、D、E均高于A組，C、D、E組高于B組， E組低于D組，差異有統計學意義(P<0.05)；E、D組PA-1細胞增殖抑制率、Cyt-C蛋白及Cyt-C mRNA、Apaf-1 mRNA高于C組，E組Apaf-1蛋白低于C組,差異有統計學意義(P<0.05)。見表2。

組別細胞增殖抑制率(%)Cyt-C蛋白Apaf-1蛋白Cyt-CmRNAApaf-1mRNAA組01111B組44.70±0.41*1.56±0.09*1.72±0.09*2.23±0.45*1.91±0.23*C組56.30±1.60*#1.57±0.03*2.66±0.10*#3.64±0.35*#2.72±0.45*#D組64.00±2.02*#△2.91±0.07*#△4.35±0.30*#△7.56±0.66*#△5.77±0.45*#△E組61.50±0.89*#△☆2.33±0.05*#△☆2.46±0.17*#△☆4.22±0.42*#△☆3.07±0.34*#△☆F388.147894.527362.324219.877193.809P0.0000.0000.0000.0000.000

*P<0.05與A組比較#P<0.05與B組比較△P<0.05與C組比較☆P<0.05與D組比較(q檢驗)

3　討　　論

臨床多種抗腫瘤藥物，均通過各種方式誘導腫瘤細胞凋亡而發揮其抗腫瘤作用，而一些腫瘤產生耐藥也與細胞凋亡過程密切相關[7]。人類卵巢惡性畸胎瘤細胞株PA-1由轉移性卵巢癌患者的腹水細胞中獲得，是生殖細胞腫瘤的一種，順鉑是一種臨床常用的抗腫瘤藥物，對多種腫瘤具有良好的抑制作用，對生殖細胞腫瘤也有良好的抑制效果。其主要機制就是通過氧化損傷誘導腫瘤細胞凋亡。本研究結果顯示，在體外培養過程中，給予順鉑后，PA-1細胞胞漿Cyt-C及Apaf-1 mRNA的表達水平上調，胞漿Cyt-C及Apaf-1蛋白含量增加，細胞凋亡增加，細胞增殖受到抑制，24 h抑制率為44.70%。

本研究結果顯示，銀杏黃酮+順鉑組的抑制率高于順鉑組，提示銀杏黃酮與順鉑聯合應用，不僅可以發揮對卵巢功能的保護作用，同時可以加強順鉑的抗腫瘤作用。目前研究者對于黃酮類化合物的抗腫瘤作用的認識逐漸加深，臨床研究顯示黃酮類化合物通過抑制腫瘤細胞增殖及誘導腫瘤細胞凋亡2個方面而發揮抗腫瘤作用。在人類神經母細胞瘤、乳腺癌、結腸癌、前列腺癌及子宮內膜癌等腫瘤的研究中，黃酮類化合物都發揮了這一作用[8-9]。有研究顯示，銀杏黃酮對于小鼠淋巴瘤YAC-1細胞的增殖在體外及體內實驗中均有抑制作用，對于宮頸癌Hela細胞，可降低Bcl-2 mRNA的表達，誘導Hela細胞凋亡，對于肝癌HepG細胞可發揮抑制增殖和誘導凋亡作用。銀杏黃酮的抗腫瘤作用機制復雜而廣泛，其可通過調節多種凋亡相關蛋白的表達而起作用。本研究結果中，銀杏黃酮+順鉑組與順鉑組比較，Cyt-C及Apaf-1 mRNA表達水平均增高，胞漿中Apaf-1蛋白含量也增高，但Cyt-C蛋白含量差異無統計學意義，提示Cyt-C在合成及釋放過程中受到了調節，與mRNA的表達水平不協調，其具體機制尚需進一步研究。

本研究將氨磷汀與順鉑聯用，可加強順鉑對PA-1的抑制作用，其細胞增殖抑制率可高達64.00%，高于單純順鉑組及銀杏黃酮+順鉑組，同時上調了Cyt-C及Apaf-1 mRNA的表達水平，提高了胞漿內Cyt-C及Apaf-1蛋白含量，加強了順鉑的誘導凋亡作用。氨磷汀在以往的多項研究中顯示了廣泛細胞保護作用，在多種惡性腫瘤的治療中，用于減輕放療及化療所致的骨髓抑制、腎功能損害、神經系統功能損害等。氨磷汀需經過體內代謝后發揮作用，氨磷汀經堿性磷酸酶水解后形成帶有自由巰基的代謝產物，正常組織對其攝取能力較腫瘤組織高達100倍，同時堿性磷酸酶的活性與pH有關，腫瘤組織pH值較低，該酶活性較低。由于在正常組織及腫瘤組織中的不同分布，氨磷汀可發揮對正常組織的保護作用而不影響腫瘤組織對放化療的敏感性[10-11]。在離體實驗中，氨磷汀可以誘導DNA損傷的細胞發生凋亡，而且其誘導凋亡的作用在正常細胞與腫瘤細胞中存在差別。這一作用在體內實驗中是否能夠出現，有待進一步研究。

本研究將亮丙瑞林與順鉑聯合應用，對于PA-1細胞顯示了一定的抑制作用，在給予順鉑前給予亮丙瑞林作用24 h，使PA-1細胞的增殖抑制率提高至61.50%，較單用順鉑組抑制效果更明顯，同時可以上調Cyt-C和Apaf-1 mRNA的表達水平及提高胞漿內Cyt-C和Apaf-1蛋白含量。表明在保護卵巢功能的同時，亮丙瑞林還發揮了對腫瘤細胞的抑制作用，并未影響順鉑的化療效果，且這一效果與線粒體途徑相關。亮丙瑞林是一種促性腺激素釋放激素 (gonadotropin-releasing hormone，GnRH)激動劑，臨床應用廣泛，主要應用于性激素依賴性疾病如乳腺癌、前列腺癌、子宮內膜異位癥及性早熟等[12-13]。其作用是抑制垂體及卵巢功能，減少促性腺激素及雌孕激素的分泌，對化療所致卵巢功能損傷有確切的保護作用，其主要機制是抑制卵泡發育，使卵泡停滯于對化療損傷敏感性較低的原始卵泡階段[14]，以減輕化療損傷。而GnRH激動劑通過抑制垂體功能，下調促性腺激素的分泌，對于卵巢腫瘤也有一定的治療作用。

銀杏黃酮、氨磷汀及亮丙瑞林均顯示了對PA-1細胞的抑制作用，且均顯示與線粒體途徑相關，比較三者的作用效果，氨磷汀對PA-1的抑制作用最強，但由于線粒體途徑包含的步驟很多，且存在眾多調節因子，因此3種藥物對PA-1細胞的抑制作用機制仍需進一步探討，本實驗觀察到的現象為今后的研究指出了一個方向。

總之，在體外培養實驗中，順鉑對PA-1細胞存在明顯抑制效應，以其IC50所對應的銀杏黃酮、氨磷汀及亮丙瑞林劑量與其聯合應用，可增強順鉑對PA-1細胞的抑制作用，上調Cyt-C和Apaf-1 mRNA的表達水平及提高胞漿內Cyt-C和Apaf-1蛋白含量。三者比較以氨磷汀作用最強。

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(本文編輯：劉斯靜)

·論著·

R730.269

B

1007-3205(2016)10-1208-04

2015-08-07；

2016-01-08

王亞軍(1974-)，女，滿族，河北豐寧人，河北省豐寧縣醫院副主任醫師，醫學學士，從事婦產科疾病診治研究。