miR-210誘導犬BMSCs成血管及成骨向分化的體外實驗研究

王默涵，鄒多宏，周 詠，吳軼群，朱艷秋，何家才

miR-210誘導犬BMSCs成血管及成骨向分化的體外實驗研究

王默涵1，鄒多宏1，周 詠1，吳軼群2，朱艷秋1，何家才1

目的 體外檢測miR-210基因誘導犬骨髓間充質干細胞（BMSCs）成骨和成血管方向分化的作用，探討目的基因雙重調控作用。方法 構建慢病毒載體Lenti-miR-210和Lenti-LacZ，并分別用Lenti-LacZ和Lenti-miR-210轉染 BMSCs。分別在目的基因轉染 BMSCs的第0、1、4、7、14、21天提取mRNA和蛋白，利用RT-PCR和Western blot檢測關鍵性成血管和成骨因子［血管內皮生長因子（VEGF）和核心結合因子2（Runx2）］的表達。同時在目的基因轉染的第21天通過堿性磷酸酶（ALP）和鈣結節茜素紅染色觀察體外骨形成的情況。結果 慢病毒載體Lenti-miR-210和Lenti-LacZ能夠成功轉入BMSCs中，并在目的基因轉染后，miR-210能夠顯著上調BMSCs關鍵性成骨和成血管因子VEGF和Runx2的表達（P＜0.05）；堿性磷酸酶和茜素紅染色顯示，相對于BMSCs組和Lenti-LacZ組，Lenti-miR-210組能夠明顯促進BMSCs的成骨向分化。結論 miR-210可以顯著促進BMSCs向成骨和成血管方向分化，這為將來的體內實驗奠定了基礎。

miR-210；骨髓間充質干細胞；基因轉染；血管生成；骨形成

目前臨床上骨缺損的修復重建仍然面臨挑戰。除了自體骨移植，再生醫學或組織工程骨的研究和臨床應用也日益受到關注。骨髓間充質干細胞（bone mesenchymal stem cells，BMSCs）是再生醫學或骨組織工程常用的種子細胞，其具有自我更新和多向分化的潛能。在骨的發育及再生中，血管生成與骨形成密不可分，并以耦合的形式存在［1］。組織工程骨的研究中，功能性血管網的建立是骨形成的關鍵因素［2］。因此，探索具有雙重調控作用的生長因子已經成為骨組織工程研究領域的熱點和難點。微小RNA（microRNAs，miRNAs）是由20～22個核苷酸組成的單鏈RNA，在細胞的基因調控中具有重要作用［3］，研究［4-5］顯示miRNAs在血管再生和骨修復過程中發揮重要作用，動物實驗［5］表明miR-210有促進血管生成、抑制細胞凋亡的作用，而且其可通過抑制轉化生長因子-β（TGF-β）/activin信號通路促進成骨細胞的分化。基于此，該研究運用基因轉染技術，探討miR-210誘導BMSCs成骨及成血管方向分化的雙重調控作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 選取健康36周齡雄性拉布拉多犬（約15 kg），由安徽醫科大學實驗動物中心提供，在整個實驗過程中對動物的處置均符合醫學倫理學標準。

1.1.2 慢病毒載體的構建 慢病毒載體Lenti-LacZ 和Lenti-miR-210的構建由和元生物技術（上海）有限公司構建、鑒定和提供，病毒滴度為2.33×109TU/ml。病毒包裝完成后，收集病毒原液，超速離心機濃縮，并進行病毒滴度測定，感染復數（multiplicity of infection，MOI）=加入病毒總數/細胞總數，本研究預實驗分別采取MOI值為1、2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22轉染細胞，病毒轉染4～7 d后倒置熒光顯微鏡下觀察細胞形態及綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP）表達情況，確定最佳MOI值。

1.1.3 主要試劑和儀器 DMEM培養基、胰蛋白酶、TRIzol RNA抽提試劑盒（Gibco公司，美國）；胎牛血清（FBS）（浙江天杭生物科技有限公司，浙江）；逆轉錄試劑盒、實時熒光定量PCR試劑盒（TaKaRa公司，日本）；成骨及成血管因子［核心結合因子2 （Runt-related transcription factor 2，Runx2）和血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）］抗體（Abcam公司，英國）；堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）檢測試劑盒、RIPA裂解液、蛋白濃度測定試劑盒（碧云天生物技術有限公司，上海）；慢病毒載體 （和元生物有限公司，上海）；茜素紅（Sigma公司，美國）；PVDF膜（Invitrogen公司，美國）；Runx2和VEGF PCR引物［生工生物工程（上海）股份有限公司，上海］。

1.2 方法

1.2.1 犬BMSCs體外培養 用3%戊巴比妥鈉（1 ml/kg）對拉布拉多犬進行靜脈注射麻醉，一側髂骨部位剃毛、消毒、鋪巾。在無菌條件下抽取犬髂骨骨髓約5 ml，完全培養基（含10%FBS、100 U/ml青霉素、100 μg/ml鏈霉素的培養基）制成單細胞懸液，接種至培養皿中進行原代培養，待細胞融合達80% ～90%時，用0.25%胰蛋白酶消化傳代，取生長狀態良好的第2代細胞用于后續實驗。

1.2.2 流式細胞術檢測BMSCs表面標志物 收集第2代對數生長期細胞制成細胞懸液，調整細胞濃度為3×106個/ml分別加入CD34-PE、CD44-FITC、CD45-FITC、CD90-APC單克隆抗體各2 μl，室溫避光孵育1 h，PBS洗2次，加入500 μl PBS重懸細胞，行流式細胞術分析。

1.2.3 犬BMSCs的轉染和實驗分組 根據預實驗結果，當MOI=10時，轉染效率最高，且BMSCs仍然保持增殖狀態，說明該轉染滴度對BMSCs擴增狀態影響很小；實驗分組為BMSCs組、Lenti-LacZ組和Lenti-miR-210組。取對數生長期的細胞按照每孔2 ×105個細胞接種于6孔板中，根據MOI值計算所需要的病毒量加入病毒濃縮液及總濃度為8 μg/ml的聚凝胺。12 h后對細胞進行換液，加入完全培養液，觀察細胞形態及生長情況，并在轉染后的第3～7天運用倒置熒光顯微鏡觀察綠色熒光蛋白表達情況，確定病毒轉染效率。

1.2.4 ALP和茜素紅鈣結節表達的檢測 將狀態良好的BMSCs按照每孔2×105個細胞接種于6孔板中，病毒轉染及分組同1.2.3，完全培養基培養3周，PBS沖洗2次，每次3 min，4%多聚甲醛固定20 min后，PBS沖洗2次，每次3 min，在各自的6孔板中分別加入ALP顯色試劑和2%茜素紅染液染色40 min，雙蒸水沖洗2次，掃描儀下掃描后置于倒置顯微鏡下觀察鈣結節形成情況，檢測BMSCs向成骨細胞的分化。

1.2.5 RT-PCR測定成骨和成血管相關基因mRNA的表達 將狀態良好的BMSCs按照每孔2×105個細胞接種于6孔板中，病毒轉染同1.2.3，分別于轉染后的第0、1、4、7、14、21天采用TRIzol法提取總RNA，逆轉錄成cDNA，并進行PCR擴增。為矯正標本RNA質量及逆轉錄效率的差異，將標本檢測所得的CT值與相應的GAPDH基因CT值相減，進行標準化，實驗重復3次。

1.2.6 Western blot檢測成血管和成骨相關蛋白的表達 將狀態良好的BMSCs按照每孔2×105個細胞接種于6孔板中，病毒轉染同1.2.3，Western blot檢測成血管和成骨相關蛋白的表達。具體方法：①分別于轉染后第0、1、4、7、14、21天收集細胞，RIPA蛋白裂解液提取蛋白；②BCA法測定蛋白濃度后計算含有20～60 μg蛋白的溶液體積，每個樣本以30 μg上樣進行；③取出上樣樣品至200 μl EP管中，加入4×LDS上樣緩沖液使終濃度為1×LDS，然后將樣品置于95℃中水浴10 min，使蛋白變性；④10% SDS-聚丙烯酰氨凝膠電泳分離，常規轉膜、一抗孵育、二抗行抗體雜交，ECL發光、顯影、定影。

1.3 統計學處理 使用SPSS 13.0軟件對數據進行t檢驗分析和方差分析，檢測結果均以表示，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 病毒轉染BMSCs效率的結果 根據預實驗結果，目的基因轉染5 d后，基因轉染效率達到最高，當MOI=10 pfu/細胞時，轉染效率最高，且細胞形態為梭形，旋渦狀生長，細胞仍維持增殖狀態，表明該轉染滴度對細胞的擴增影響很小。基因轉染5 d后，熒光顯微鏡下觀察其轉染效率達90%以上。見圖1。

2.2 流式細胞術對BMSCs表面標志物的鑒定結果

流式細胞術分析顯示，BMSCs表面抗原CD44、CD90高度表達，陽性表達分別為97.2%和99.7%，造血干細胞表面抗原CD34和CD45表達陰性，陽性表達分別為0.288%和0.074%。見圖2。

2.3 miR-210對成骨細胞分泌ALP和成骨細胞礦化功能的影響 轉染后21 d，可見培養的BMSCs聚集生長，ALP染色Lenti-miR-210/BMSCs組可見較多的陽性表達，而BMSCs組和Lenti-LacZ/BMSCs組很少表達（圖3A）。茜素紅染色顯示，在聚集生長中心可見點狀染色陽性的鈣化結節，細胞周圍鈣鹽被染成橘紅色。BMSCs組和Lenti-LacZ/BMSCs組僅有較少的鈣結節形成，而Lenti-miR-210/BMSCs組可見較多細胞聚集形成結節（圖3B）。

圖1 目的基因轉染結果 ×100

圖2 犬BMSCs表面標志物陽性表達情況

圖3 犬BMSCs培養21 d后ALP和茜素紅鈣結節染色觀察

2.4 miR-210介導的BMSCs成血管及成骨相關因子mRNA的表達 RT-PCR結果顯示，BMSCs組VEGF和Runx2 mRNA維持低水平少量表達，LentimiR-210/BMSCs組自目的基因轉染后的第4天開始，VEGF和Runx2 mRNA表達顯著增高，監測至第21天仍維持較高水平，與蛋白表達趨勢幾乎一致。轉染后第4、7、14、21天，BMSCs組VEGF和Runx2 mRNA表達均低于 Lenti-miR-210/BMSCs組（P＜0.05）。見圖4。

2.5 miR-210介導的BMSCs成血管和成骨等標志分子檢測 目的基因轉染后的第4天VEGF蛋白過表達，隨著時間延長，蛋白表達持續升高，BMSCs組的VEGF蛋白表達水平和Lenti-miR-210/BMSCs組相比有明顯差異；Runx2蛋白在目的基因轉染后，基因表達趨勢幾乎與VEGF蛋白表達一致。見圖5。

3 討論

本研究顯示miR-210有促進BMSCs骨向和血管向分化的作用，該因子具有雙重調控功能。因為在骨發育和再生過程中，血管生成與骨形成以耦合的形式存在，密不可分，所以在骨組織工程研究中，血管化問題的重要性日益彰顯。當組織工程骨的厚度超過100～200 μm時，在體內構建能為細胞提供氧、營養及去除代謝廢物的功能性血管會面臨重大挑戰［1］。因此，目前血管再生已被認為是骨組織工程繼種子細胞、支架材料、細胞因子3大要素之后的第4大要素。

圖4 RT-PCR檢測目的基因轉染BMSCs后成血管及成骨相關因子的表達

圖5 Western blot檢測相關蛋白表達

研究［6-7］表明miRNAs參與了細胞的凋亡、增殖、衰老、自噬及分化等過程，且能夠通過上調或下調這些過程來調節細胞的生物學功能。miRNAs在血管發生及形成中起著關鍵作用。miR-210在細胞低氧時高表達，是低氧誘導因子1α（HIF-1α）的下游靶基因，HIF-1α驅動著miR-210的過表達和細胞過程（細胞周期調節、線粒體功能、凋亡和血管生成等）［8］。而且HIF-1α可以誘導VEGF的高表達，VEGF促進新血管形成后，新生血管為骨缺損區輸送大量與骨形成相關的生長因子，生長因子成熟后可以演變為新骨［9-10］。研究［11-12］表明，在組織缺血時，miR-210對調控內皮細胞血管化有決定性作用；且miR-210過表達后，其通過抑制TGF-β/activin信號通路傳導促進成骨細胞的分化［5］。因此，探索miR-210的雙重調控作用（成骨和成血管）具有可靠的理論基礎，該假說被本研究所證實。

由于慢病毒載體能高效的整合至靶細胞中長期穩定表達，且慢病毒載體不會產生特異性細胞反應［13］，而在預實驗的結果中表明，慢病毒的轉染對細胞的增殖不會產生顯著影響，因此，本研究利用慢病毒構建miR-210過表達載體，當MOI=10 pfu/時，轉染效率最高，且細胞仍維持增殖狀態，表明該轉染滴度對細胞的擴增影響較小。流式細胞術檢測結果表明本實驗所用的BMSCs符合成體干細胞的特性（BMSCs表面標志物顯示，間充質干細胞表面抗原的CD44和CD90表達為高度陽性，分別為97.2%和99.7%；造血干細胞表面抗原的CD34、CD45為高度陰性，分別為0.288%和0.074%）［14-15］。這為體內外細胞及動物實驗提供了可靠的種子細胞來源。

RT-PCR和Western blot檢測結果顯示，目的基因轉染BMSCs后的第4天，Lenti-miR-210/BMSCs組的Runx2和VEGF標志性成骨和成血管因子出現過表達，持續到第21天。相比BMSCs組及Lenti-LacZ組，目的基因組的成骨和成血管因子的過表達差異有統計學意義，說明外源性miR-210有促進BMSCs血管及骨向分化的雙重調控作用。ALP是骨形成的功能性酶，是成骨細胞分化早期標志，并在成骨細胞的鈣鹽沉積中起關鍵作用［16］。為了進一步驗證上述結果，在目的基因轉染BMSCs的第21天，利用ALP和茜素紅染色。結果顯示，Lenti-miR-210/BMSCs在培養第21天時，ALP和茜素紅染色及鈣結節表達明顯高于其它兩組（BMSCs組和Lenti-LacZ/BMSCs組）。表明Lenti-miR-210能夠促進BMSCs合成和分泌較多的成骨特異性蛋白及基質。本實驗結果進一步證實我們的假說。

［1］ Riddle R C，Khatri R，Schipani E，et al.Role of hypoxia-inducible factor-1α in angiogenic-osteogenic coupling［J］.J Mol Med，2009，87（6）：583-90.

［2］ Zou D，Zhang Z，He J，et al.Blood vessel formation in the tissueengineered bone with the constitutively active form of HIF-1α mediated BMSCs［J］.Biomaterials，2012，33（7）：2097-108.

［3］ van Rooij E，Olson E N.MicroRNA therapeutics for cardiovascular disease：opportunities and obstacles［J］.Nat Rev Drug Discov，2012，11（11）：860-72.

［4］ Patella F，Rainaldi G.MicroRNAs mediate metabolic stresses and angiogenesis［J］.Cell Mol Life Sci，2012，69（7）：1049-65.

［5］ Mizuno Y，Tokuzawa Y，Ninomiya Y，et al.miR-210 promotes osteoblastic differentiation through inhibition of AcvR1b［J］.FEBS Lett，2009，583（13）：2263-8.

［6］ Liu K，Huang J，Xie M，et al.MIR34A regulates autophagy and apoptosis by targeting HMGB1 in the retinoblastoma cell［J］.Autophagy，2014，10（3）：442-52.

［7］ Zhang F，Cui J，Liu X，et al.Roles of microRNA-34a targeting SIRT1 in mesenchymal stem cells［J］.Stem Cell Res Ther，2015，6（1）：1-13.

［8］ Dang K，Myers K A.The Role of hypoxia-induced miR-210 in cancer progression［J］.Int J Mol Sci，2015，16（3）：6353-72.

［9］ Voellenkle C，van Rooij J，Guffanti A，et al.Deep-sequencing of endothelial cells exposed to hypoxia reveals the complexity of known and novel microRNAs［J］.Rna，2012，18（3）：472-84.

［10］Zou D，He J，Zhang K，et al.The bone-forming effects of HIF-1alpha-transduced BMSCs promote osseointegration with dental implant in canine mandible［J］.PLoS One，2012，7（3）：e32355.

［11］Lou Y L，Guo F，Liu F，et al.miR-210 activates notch signaling pathway in angiogenesis induced by cerebral ischemia［J］.Mol Cell Biochem，2012，370（1-2）：45-51.

［12］Alaiti M A，Ishikawa M，Masuda H，et al.Up-regulation of miR-210 by vascular endothelial growth factor in exvivo expanded CD34+cells enhances cell-mediated angiogenesis［J］.J Cell Mol Med，2012，16（10）：2413-21.

［13］D'Costa J，Mansfield S G，Humeau L M.Lentiviral vectors in clinical trials：Current status［J］.Curr Opin Mol Ther，2009，11 （5）：554-64.

［14］M?dder U I，Roforth M M，Nicks K M，et al.Characterization of mesenchymal progenitor cells isolated from human bone marrow by negative selection［J］.Bone，2012，50（3）：804-10.

［15］Martins A A，Paiva A，Morgado J M，et al.Quantification and immunophenotypic characterization of bone marrow and umbilical cord blood mesenchymal stem cells by multicolor flow cytometry ［C］.Transplant Proc，2009，41（3）：943-6.

［16］寧寅寬，李 強，蔡偉良，等.綠色熒光蛋白標記兔BMSCs體外成骨的定量能譜分析［J］.安徽醫科大學學報，2015，50 （4）：415-8.

miR-210 gene in promoting the formation of bone and blood vessel by canine BMSCs in vitro

Wang Mohan，Zou Duohong，Zhou Yong，et al
（Stomatologic College of Anhui Medical University，The Affiliated Stomatological Hospital
of Anhui Medical University，Key Lab of Oral Diseases Research of Anhui Province，Hefei 230032）

Objective To explore the function of miR-210 gene in promoting the differentiation of BMSCs into bone and blood vessels in vitro.Methods The lentiviral vector carrying miR-210 or green fluorescent protein（GFP）gene （Lenti-miR-210 or Lenti-LacZ）was constructed and then transduced into the canine BMSCs.After transduced with targeted gene，expressions of relative osteogenic and angiogenic factors were detected by RT-PCR and Western blot on day 0，1，4，7，14 and 21.Alkaline phosphatase（ALP）and calcium nodules were detected by ALP staining and alizarin red staining（ARS）on day 21 of transduction.Results The BMSCs were successfully tranduced with miR-210 and GFP recombinant lentiviral vectors.After the targeted gene was transduced，expressions of VEGF and Runx2 at the mRNA and protein levels were significantly increased（P＜0.05）.Results of ALP and ARS staining showed that the targeted gene could induce the osteogenic differentiation of BMSCs more than Lenti-LacZ and BMSCs.Conclusion The miR-210 gene could promote the overexpressions of osteogenic and angiogenic factors，which could lay a foundation for the relative study in vivo in the future.

miR-210；bone marrow mesenchymal stem cells；gene transduction；osteogenesis differentiation；angiogenesis differentiation

Q 7；R 34

A

1000-1492（2016）09-1258-05

時間：2016-8-1 14：07

http：//www.cnki.net/kcms/detail/34.1065.R.20160801.1407.012.html

2016-04-14接收

國家自然科學基金（編號：31370983、81371114、81371190）；安 徽 省 自 然 科 學 基 金 （編 號：1408085MKL29）；安徽省杰出青年科學基金（編號：1508085J08）；高校優秀青年人才支持計劃重點項目（編號：gxyqZD2016058）；安徽醫科大學“青年拔尖人才支持計劃”

1安徽醫科大學口腔醫學院，安徽醫科大學附屬口腔醫院，安徽省口腔疾病研究中心實驗室，合肥 2300322上海交通大學醫學院附屬第九人民醫院口腔種植科，上海 200011

王默涵，男，碩士研究生；何家才，男，教授，主任醫師，博士生導師，責任作者，E-mail：hejiacai@163.com