MnSOD-SIRT3在佐劑性關節炎大鼠肝組織中的表達和意義

蘇會萍，張俊強，曹 威，儲海峰，俞 晨，4，李 簡，楊 睿，宋先兵，陳曉宇

MnSOD-SIRT3在佐劑性關節炎大鼠肝組織中的表達和意義

蘇會萍1，2，張俊強1，曹 威1，儲海峰3，俞 晨1，4，李 簡3，楊 睿3，宋先兵5，陳曉宇1

目的 探討肝臟錳超氧化物歧化酶（MnSOD）、去乙酰化酶3（SIRT3）的改變與佐劑性關節炎（AA）大鼠的關系。方法 弗氏完全佐劑（FCA）足趾皮下注射誘導SD大鼠AA，造模后12、19、26 d，分批處死大鼠，計算肝臟指數，檢測血清谷草轉氨酶（AST）；谷丙轉氨酶（ALT）；肝勻漿檢測丙二醛（MDA）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）、超氧化物歧化酶（SOD）的變化；肝組織免疫組化和Western blot法檢測MnSOD、SIRT3蛋白表達變化。結果 與正常組大鼠比較，AA大鼠造模12 d后，肝臟指數升高，血清轉氨酶升高，肝勻漿中MDA升高，GSH-Px、SOD活性下降（P＜0.05，P＜0.01），肝組織中MnSOD、SIRT3蛋白表達下降。結論 AA模型組大鼠存在肝損傷，肝勻漿中氧化應激指標升高，其機制與肝臟中MnSOD和SIRT3表達有一定的關聯。

佐劑性關節炎；錳超氧化物歧化酶；去乙酰化酶3；大鼠

氧化應激性反應是導致類風濕關節炎（rheumatoid arthritis，RA）的一個重要因素，長期治療、生活方式的改變、關節疼痛和功能受限等使RA患者處于應激狀態［1］，機體出現脂質過氧化反應，氧自由基（oxygen free radical，ROS）的生成增加，而清除ROS的能力下降［2］。佐劑性關節炎（adjuvant arthritis，AA）大鼠模型由于和RA在形態學上相似，且造模簡單，是目前較為常用的RA動物模型，常用于RA藥物篩選模型［3］。真核細胞線粒體中含有錳超氧化物歧化酶（manganese superoxide dismutase，Mn-SOD），屬于金屬抗氧化酶，能夠特異性地將超氧陰離子自由基（O-·）2轉化為H2O2和O2。MnSOD主要存在于線粒體，而線粒體是細胞內氧化代謝和產生能量、自由基的重要場所，故其在抗氧化損傷中作用顯著［4］。去乙酰化酶（sirtuins，SIRTs）家族中的SIRT3主要位于線粒體，是具有去乙酰化酶活性的SIRTs，具有調節線粒體的能量代謝和抗氧化應激的作用［5］。肝臟是機體重要的物質代謝場所，肝細胞中線粒體含量豐富。近年來，有文獻［6］報道AA大鼠存在氧化應激性肝損傷，為進一步了解其肝損傷原因，該研究探討AA大鼠機體氧化應激情況以及與肝功能損傷、肝臟中MnSOD和SIRT3表達的聯系，旨在進一步闡明AA大鼠的氧化應激機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與試劑

1.1.1 動物 40只雄性SD大鼠，清潔級，（180± 20）g，購置并飼養于安徽省實驗動物中心，每天光照周期12 h∶12 h，自由飲食水。

1.1.2 試劑 弗氏完全佐劑（FCA）購自美國Sigma公司；羊抗鼠MnSOD、SIRT3多克隆抗體購自美國Abcam公司；兔抗羊生物素-鏈霉卵白素免疫組化檢測試劑盒（SP-9000）、DAB顯色試劑盒購自北京諾博萊德科技有限公司，HE染色試劑盒、ECL化學發光試劑盒購自江蘇碧云天公司；谷草轉氨酶（aspartate transaminase，AST）（貨號：C010-3）、谷丙轉氨酶（glutamic-pyruvic transaminase，ALT）（貨號：C009-2）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）（貨號：A001）、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathion peroxidase，GSH-Px）（貨號：A005）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）（貨號：A003）檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所；BCA蛋白測定試劑盒購自美國Amersham Life Sciences公司。

1.1.3 主要儀器與設備 大鼠足跖容積測量儀YLS-TA（山東醫學科學研究所）；電子天平（德國Sartorius公司）；IX51倒置顯微鏡（日本Olympus公司）；SW-CJ-IF型超凈工作臺（江蘇蘇凈集團）；玻璃勻漿器、AM-1 ACE破碎乳化機（日本Nissel精機制作所）；熒光顯微鏡、RM2235切片機（德國Leica公司）；7020全自動生化分析儀（日立中國公司Hitachi Europe Ltd.）等。

1.2 方法

1.2.1 實驗動物分組和標本收集 隨機將大鼠分為兩組：正常組（10只）、模型組（30只）。模型組于每鼠右后足趾皮內注射0.1 ml FCA致炎，建立AA大鼠模型。將AA模型組隨機均分為3組，分別于致炎后12、19、26 d腹腔注射50 mg/kg戊巴比妥鈉溶液麻醉SD大鼠，剖開腹腔，暴露腹主動脈，抽取約5 ml動脈血置于EP管中，8 000～10 000 r/min離心10 min分離血清，儲存于-20℃冰箱待測AST、ALT活力。破腹后取出肝臟，稱取肝臟濕重，計算肝臟指數，肝臟指數（%）=肝臟濕重/大鼠體重× 100%。留取相同部位肝臟，迅速轉移至液氮中做Western blot法檢測；另取相同部位肝臟置10%福爾馬林溶液中固定。

1.2.2 血清AST、ALT檢測 按照底物法測定AST、ALT試劑盒說明書進行操作，檢測前應用新鮮配置的質控液對生化分析儀進行開機校準，保證測試結果在質控范圍內，進行血清樣本AST、ALT活力的檢測。質控品標號：YZB/皖0213-2012。AST、ALT活力的單位為IU/L。

1.2.3 肝勻漿分光光度計檢測抗氧化指標 取相同新鮮部位的肝組織，以預冷的生理鹽水為勻漿介質，肝組織 ∶生理鹽水按1∶9的比例進行勻漿，勻漿液3 500～4 000 r/min離心10 min，留取上清液，即10%的肝組織勻漿液，置于-20℃冰箱中保存待測。嚴格按照操作程序說明書進行，硫代巴比妥酸（thiobarbituric acid，TBA）法檢測MDA含量；羥胺法檢測SOD活性和比色法測定GSH-Px活性。

1.2.4 免疫組化法檢測肝臟MnSOD、SIRT3蛋白表達 制備SD大鼠肝臟組織切片，石蠟包埋，5 μm厚切片，脫蠟至水，微波中火抗原修復（0.01 mol/L檸檬酸鹽緩沖液），3%H2O2、37℃孵育10 min消除內源性過氧化物酶，正常山羊血清封閉液，滴加羊抗鼠MnSOD、SIRT3多克隆抗體（一抗），4℃孵育過夜，滴加辣根過氧化物酶標記的兔抗羊IgG/HRF二抗，37℃溫箱中孵育30 min，DAB顯色，蘇木精復染，脫水、透明、封片，光學顯微鏡觀察 MnSOD、SIRT3蛋白表達情況。

1.2.5 Western blot法檢測肝組織中MnSOD、SIRT3蛋白表達 液氮中凍存的肝臟組織取樣，并將組織樣品于研缽中研磨成勻漿，按照試劑盒說明書配置組織細胞裂解液，將肝組織裂解研磨成勻漿，提取組織蛋白。根據BCA試劑盒測定總蛋白含量，-80℃冰箱儲存備用。各組取30 μg等量的組織蛋白，煮沸變性，SDS-PAGE進行蛋白分離，將蛋白質電轉至硝酸纖維素膜，10%脫脂奶粉封閉，加入羊抗鼠Mn-SOD、SIRT3多克隆抗體一抗（1∶1 000），4℃過夜。次日用Tris緩沖液（TBST）洗膜后，加入兔抗羊辣根過氧化物酶標記的二抗（1∶2 000），37℃孵育1 h。采用ECL化學發光法進行顯色，以β-actin為內參照，灰度分析軟件Image J作半定量分析。

1.3 統計學處理 應用SPSS 16.0軟件進行分析，計量資料采用表示，組間比較應用單因素方差分析，經過方差齊性檢驗后采用t檢驗，率的比較采用χ2檢驗。

2 結果

2.1 各組大鼠肝指數變化 與正常組比較，模型組大鼠活動減少、體重減輕，肝臟指數明顯增加（F= 2.707，P＜0.05），且隨著造模時間的延長，模型組大鼠炎癥的加重，表現為原發側足趾腫脹進行性加重，且出現漸進性的繼發性足腫脹和前足腫脹，逐漸行動不便、站立不穩，肝臟指數逐漸增加，但12、19、26 d模型各組間差異無統計學意義（F=1.097，P＞0.05）。見圖1。

圖1 AA大鼠的肝臟指數（，n=10）

2.2 大鼠血清AST、ALT的變化 與正常組比較，各模型組大鼠血清AST、ALT含量明顯升高，差異有統計學意義（F=3.261，P＜0.01）；但12、19、26 d模型各組間差異無統計學意義（F=1.326，P＞0.05）。見圖2。

圖2 AA大鼠的血清AST、ALT的變化（，n=10）

2.3 各組大鼠肝勻漿MDA含量和SOD、GSH-Px活性的影響 與正常組比較，AA模型組大鼠肝勻漿中MDA含量明顯升高（P＜0.01），SOD活性和GSH-Px酶活力單位顯著降低（P＜0.01）。見表2。模型組12、19、26 d間MDA含量、SOD活性和GSHPx酶活力單位比較差異無統計學意義（F=1.602，P ＞0.05）。見圖3。

2.4 免疫組化法檢測大鼠肝臟中MnSOD、SIRT3蛋白表達情況 正常組大鼠肝臟中MnSOD蛋白表達明顯，主要表達于肝細胞胞質和肝血竇內皮細胞上，各模型組大鼠肝臟中MnSOD蛋白表達明顯減弱，陽性主要位于肝血竇內皮細胞上，而肝細胞胞質中減弱，見圖3。肝臟中SIRT3蛋白表達情況類似于MnSOD蛋白表達，正常組大鼠SIRT3蛋白表達明顯，主要表達于肝血竇內皮細胞上，模型組大鼠肝臟中SIRT3蛋白表達明顯減弱，陽性結果主要表達于肝血竇內皮細胞，而肝細胞胞質中表達明顯減弱，見圖4。

表2 大鼠肝勻漿中MDA含量和SOD、GSH-Px活性的影響（，n=10）

表2 大鼠肝勻漿中MDA含量和SOD、GSH-Px活性的影響（，n=10）

與正常組比較：＊＊P＜0.01

組別 MDA（μmol/L） SOD（U/ml） GSH-Px（μmol/L）正常 4.36±0.43 212.62±5.04 183.16±6.27模型（12 d） 11.03±0.96＊＊ 138.24±9.73＊＊ 144.82±9.83＊＊模型（19 d） 11.91±1.24＊＊ 130.08±8.85＊＊ 138.87±9.15＊＊模型（26 d） 12.35±1.27＊＊ 127.61±9.35＊＊ 136.82±9.04＊＊

2.5 Western blot法檢測大鼠肝臟中MnSOD、SIRT3蛋白表達情況 與免疫組化檢測大鼠肝臟中MnSOD、SIRT3蛋白表達結果相似，Western blot結果顯示，正常組大鼠肝臟中MnSOD、SIRT3蛋白高表達，模型組12 d時肝臟組織中有MnSOD、SIRT3陽性表達，19 d、26 d表達呈降低趨勢；通過Image J軟件，利用灰度比值半定量分析表明，AA模型組大鼠肝臟組織中MnSOD/GAPDH、SIRT3/GAPDH與正常組比較差異有統計學意義（F=4.217，P＜0.01）；各模型組間表達差異無統計學意義。見圖4。

3 討論

圖3 大鼠肝臟中蛋白表達情況 免疫組化 ×400

圖4 AA大鼠肝臟組織MnSOD、SIRT3蛋白表達

目前，最常用于動物實驗的佐劑為FCA，制備中先將抗原水溶液 ∶油劑（石蠟油）按1∶1混合，然后加入乳化劑（羊毛脂等）構成油包水抗原乳劑，制備成不完全弗氏佐劑，最后在其中加入滅活分枝桿菌的卡介苗，形成FCA［7］。在本研究中，SD大鼠在注射FCA的3 d表現為急性炎癥表現，原發注射側足趾紅腫，關節處于注射1周內表現明顯的腫脹，1周后繼發側表現關節腫脹，14 d關節腫脹進一步發展，嚴重者不能負重，隨著時間的推移，繼發性炎癥進一步發展，說明AA造模成功。肝臟指數檢測結果表明，各模型組之間差異并不明顯。正常組肝臟呈棕褐色、質柔軟，肝臟指數正常，而模型組肝臟體積增大、肝被膜緊張、色澤蒼白混濁，肝臟指數相對于正常組有顯著的增加，表明肝臟受到一定程度的損傷。AST和ALT是反映肝細胞膜損傷的敏感性指標，肝細胞膜損傷后，導致轉氨酶大量進入血液中，引起血清中AST和ALT升高。本研究中，正常組大鼠血清AST、ALT含量均在正常范圍內，各模型組大鼠血清AST、ALT含量明顯升高，與正常組比較差異有統計學意義；但12、19、26 d模型各組間差異無統計學意義。因此，說明足趾注射FCA，引起佐劑性肝損傷。

生物膜脂質過氧化產物MDA的濃度高低可反映出組織細胞受自由基攻擊后氧化損傷的程度，GSH-Px和SOD是廣泛存在于機體的抗氧自由基損傷的重要酶類，GSH-Px能特異性催化還原型谷胱甘肽（GSH）對H2O2的還原過氧化的脂質，因此具有保護細胞膜結構和功能完整性的作用。本研究表明，12、19、26 d模型各組間差異無統計學意義，相對于正常組，AA模型組大鼠肝臟組織勻漿中GSH-Px 和SOD活性顯著升高，而MDA的濃度下降，說明AA模型組大鼠肝臟組織中存在氧化應激作用。過量的氧自由基造成肝細胞膜脂質的過氧化，損傷抗氧化酶，引起GSH-Px和SOD的催化作用降低甚至失活。

MnSOD是機體重要的氧自由基清除劑，是位于線粒體中的酶，有催化超氧陰離子發生歧化反應的作用。線粒體是細胞內氧化還原反應和產生能量的重要場所，同時也是產生自由基的場所，故MnSOD抗氧化損傷的作用顯著［4］。SIRT3是一種去乙酰化酶，有高度保守特性，依賴于煙酰胺腺嘌呤二核苷酸發揮功能，能對線粒體內相關的乙酰化蛋白脫乙酰基，加強ROS清除氧自由基，穩定線粒體，抑制線粒體內ROS的蓄積［5］。SIRT3在線粒體內通過對組蛋白/非組蛋白的去乙酰化作用，調節線粒體內的能量代謝，提高細胞內的ATP含量，可保護細胞，發揮抗氧化應激作用［8］。研究［9］表明，SIRT3通過引起MnSOD 122位賴氨酸殘基脫乙酰化，進而活化Mn-SOD，減少線粒體生成ROS，參與抗衰老等作用。文獻［10］報道，SIRT3作為能量感受器及ROS清除的介導者可能在RA的發病機制中發揮著重要作用。本實驗肝臟組織的免疫組織化學法檢測結果表明，正常組大鼠肝臟中MnSOD蛋白表達明顯，主要表達于肝細胞胞質和肝血竇內皮細胞上，各模型組大鼠肝臟中MnSOD蛋白表達明顯減弱，SIRT3蛋白在肝組織中表達情況類似于MnSOD蛋白表達，表明肝小葉中存在MnSOD-SIRT3相關抗氧化作用。本研究進一步采用Western blot法檢測肝勻漿中Mn-SOD、SIRT3蛋白表達情況，結果與免疫組化法檢測結果相似，正常組大鼠肝臟中MnSOD、SIRT3蛋白高表達，模型組12 d時肝臟組織中有少量MnSOD、SIRT3陽性表達，19、26 d表達呈降低趨勢；灰度比值半定量分析表明，AA模型組大鼠肝臟組織中Mn-SOD/GAPDH、SIRT3/GAPDH明顯較正常組降低，說明肝組織中有MnSOD-SIRT3相關抗氧化作用。

綜上所述，AA模型組大鼠存在肝損傷、血清轉氨酶升高、肝勻漿中氧化應激指標升高，其機制與肝臟中MnSOD和SIRT3表達有一定的聯系。

［1］ Hirao M，Yamasaki N，Oze H，et al.Serum level of oxidative stress marker is dramatically low in patients with rheumatoid arthritis treated with tocilizumab［J］.Rheumatol Int，2012，32（12）：4041-5.

［2］ Kundu S，Ghosh P，Datta S，et al.Oxidative stress as a potential biomarker fordetermining disease activity in patients with rheumatoid arthritis［J］.Free Radic Res，2012，46（12）：1482-9.

［3］ 盧錦森，馬中飛，縱何香，等.白藜蘆醇對佐劑性關節炎大鼠血管內皮因子表達的影響［J］.安徽醫科大學學報，2015，50（7）：969-73.

［4］ Brandauer J，Andersen M A，Kellezi H，et al.AMP-activated protein kinasecontrols exercise training-and AICAR-induced increases in SIRT3 and MnSOD［J］.Front Physiol，2015，6：85.

［5］ Lo Gullo A，Mandraffino G，Sardo M A，et al.Circulating progenitor cells in rheumatoid arthritis：association with inflammation and oxidative stress［J］.Scand J Rheumatol，2014，43（3）：184-93.

［6］ Comar J F，Babeto de Sá-Nakanishi A，de Oliveira A L，et al.Oxidative state of the liver of rats with adjuvant-induced arthritis［J］. Free Radic Biol Med，2013，58：144-53.

［7］ Ahmed Y M，Messiha B A，Abo-Saif A A.Protective effects of simvastatin and hesperidin against complete freund's adjuvant-induced rheumatoid arthritis in rats［J］.Pharmacology，2015，96（5-6）：217-25.

［8］ Chen C J，Fu Y C，Yu W，et al.SIRT3 protects cardiomyocytes from oxidative stress-mediated cell death by activating NF-κB［J］. Biochem Biophys Res Commun，2013，430（2）：798-803.

［9］ Chen I C，Chiang W F，Chen P F，et al.STRESS-responsive deacetylase SIRT3 is up-regulated by areca nut extract-induced oxidative stress in human oral keratinocytes［J］.J Cell Biochem，2014，115（2）：328-39.

［10］Cheung K G，Cole L K，Xiang B，et al.Sirtuin-3（SIRT3）protein attenuates doxorubicin-induced oxidative stress and improves mitochondrial respiration in h9c2 cardiomyocytes［J］.J Biol Chem，2015，290（17）：10981-93.

Expression and significance of MnSOD-SIRT3 in adjuvant arthritis of rat liver tissue

Su Huiping1，2，Zhang Junqiang1，Cao Wei1，et al
（1Dept of Histology and Embryology，Anhui Medical University，Hefei 230032；
2Dept of Rehabilitation，Anqing Medical College，Anqing 246052）

Objective To investigate the relationship between the changes of manganese superoxide dismutase（Mn-SOD），sirtuin 3（SIRT3）with adjuvant arthritis（AA）rats.Methods Complete Freund's adjuvant（FCA）of subcutaneous injection of SD rats induced by AA，the AA rats were put to death on the day 12，19 and 26，calculate the liver index，serum aspartate transaminase（AST），alanineaminotransferase（ALT）were detected，methane dicarboxylic aldehyde（MDA），glutathione peroxidase（GSH-Px）and superoxide dismutase（SOD）in liver homogenate were also detected，and MnSOD，SIRT3 protein expression changes were detected in the liver tissue by immunohistochemistry and Western blot.Results Compared with the normal rats，AA rats on the day 12，the liver index，serum transaminase eleations，liver homogenate MDA increased，GSH-Px，SOD activity decreased（P＜0.05，P＜0.01）.The expressions of MnSOD and SIRT3 protein decreased in liver tissue.Conclusion There is liver damage in AA model grouprats，oxidative stress index increases in liver homogenate.The mechanism is related to the expression of MnSOD and SIRT3 in the liver.

adjuvant arthritis；manganese superoxide dismutase；sirtuin 3；rat

R 322.72

A

1000-1492（2016）09-1268-05

時間：2016-8-1 14：07

http：//www.cnki.net/kcms/detail/34.1065.R.20160801.1407.016.html

2016-05-30接收

國家自然科學基金面上項目（編號：81373421）；安徽高校 自然科學研究項目（編號：KJ2015A350）；安徽醫科大學“早期接觸科研”訓練計劃項目（編號：2015-ZQKY-01）

1安徽醫科大學組織胚胎學教研室，合肥 2300322安慶醫藥高等專科學校康復保健教研室，安慶 2460523安徽醫科大學14級“5+3”臨床醫學系，合肥 2300324皖西衛生職業學院護理系，六安 2370005安徽省醫學高等專科學校，合肥230601

蘇會萍，女，碩士研究生； 陳曉宇，男，博士，教授，碩士生導師，責任作者，E-mail：chenxy@163.com