丹參酮I對2型糖尿病ICR小鼠抗糖作用的研究

吳 勝，蔡雙鵬，李小楓，黃 成，李 俊

◇藥學研究◇

丹參酮I對2型糖尿病ICR小鼠抗糖作用的研究

吳 勝1，2，3，蔡雙鵬1，2，3，李小楓1，2，3，黃 成1，2，3，李 俊1，2，3

目的 觀察丹參酮I對高脂高糖飲食結合多次小劑量鏈脲佐菌素（STZ）注射誘導的2型糖尿病（T2DM）模型ICR小鼠肝臟的影響并分析其可能的作用機制。方法 制備小鼠T2DM模型，隨機分為模型組、丹參酮I（高劑量、中劑量、低劑量）組、二甲雙胍（Met）組和吡格列酮（Pio）組，隨后這6組繼續給于高脂高糖飼料喂養3周，每天注射相應濃度的藥物，同時，對7組（包括正常組）小鼠每周測一次空腹血糖和體重。3周末，取小鼠肝臟，運用HE染色觀察各組的病理變化，免疫組化法和Western blot法檢測各組蛋白酪氨酸磷酸酶1B（PTP1B）、蛋白激酶B（Akt）、P-Akt蛋白表達水平。結果 丹參酮I高劑量組可以降低T2DM ICR小鼠的血糖（P＜0.05），增加其體重（P＜0.05）。丹參酮I 3個劑量組肝組織中未見明顯細胞質腫脹和細胞核固縮現象，且組織中炎癥較輕。免疫組化法結果顯示，丹參酮I高劑量組可以降低T2DM ICR小鼠肝臟組織中PTP1B蛋白的表達（P＜0.05）。Western blot法顯示，丹參酮I中劑量組和高劑量組可以降低T2DM ICR小鼠肝臟組織中PTP1B蛋白的表達（P ＜0.05），各組中Akt的表達均無明顯差異，丹參酮I高劑量組可以提高 T2DM小鼠肝臟中 P-Akt的蛋白表達（P＜0.05）。結論 高劑量的丹參酮I可以降低 STZ誘導的T2DM小鼠的空腹血糖水平和肝損傷，同時降低肝臟PTP1B的表達，提高肝臟P-Akt的表達。

2型糖尿病；丹參酮I；鏈脲佐菌素；動物模型；PTP1B

丹參酮I是以丹參中所含的脂溶性成分丹參醌Ⅰ分離得到的單體，國內外對其的研究包括抗關節炎作用［1］、抗乳腺癌作用［2］、抑制線粒體凋亡［3］等等，目前很少有其在糖尿病方面作用的研究。而同樣是丹參中脂溶性成分的丹參酮Πa則在抗糖尿病方面報道的文獻比較多。肝臟及其外周組織是胰島素作用的靶組織，也是糖脂代謝最重要的器官之一，以小鼠肝臟組織為受試對象，對抗糖尿病研究有重要意義。糖尿病是一種以高血糖為特征的代謝性疾病，常伴隨著外周組織對胰島素敏感性的降低和胰島素信號通路的調控紊亂。對胰島素受體，胰島素受體底物以及其他下游分子的蛋白質酪氨酸磷酸化進行可逆調節，是胰島素信號通路中一個重要的調控機制。蛋白酪氨酸磷酸酯酶1B（protein tyrosine phosphatase 1B，PTP1B）是PTP家族中早被純化和確定生物學特性的蛋白酪氨酸磷酸酯酶，對胰島素受體及其底物的磷酸化水平起著重要的負調控作用。該研究用小鼠模擬人類2型糖尿病（type 2 diabetes mellitus，T2DM）的發病過程［4］，觀察丹參酮I在抗糖尿病方面的作用，探討其在動物體內可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 清潔級雄性ICR小鼠，18～22 g，購自安徽醫科大學實驗動物中心，實驗動物飼養于安徽醫科大學動物房，室溫（25±2）℃，濕度（55±5）%，開始實驗前，動物正常飲食飲水，適應環境1周，每天保持12 h的晝夜循環。所有實驗操作符合安徽醫科大學動物實驗倫理委員會的要求。

1.1.2 試劑和藥物 豬油、白糖、玉米油、蛋白粉（南通特洛菲飼料科技有限公司）；普通飼料（安徽醫科大學動物中心）；檸檬酸和檸檬酸鈉（上海生物工程有限公司）；檸檬酸緩沖液（檸檬酸：稱取2.1 g加入雙蒸水100 ml配成A液，檸檬酸鈉：稱取2.94 g加入雙蒸水100 ml配成B液。A液與B液以1∶1的比例混合，過濾，用pH計測定pH值，調節pH=4.2～4.5）；鏈脲佐菌素（streptozotocin，STZ）（美國Sigma公司）；血糖儀及其試紙（美國強生公司）；RIPA裂解液（強）、非變性PAGE蛋白上樣緩沖液（5×）、HRP-羊抗兔IgG，BCA蛋白濃度測定試劑盒（上海碧云天生物技術研究所）；PTP1B單克隆抗體，蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）單克隆抗體和磷酸化的蛋白激酶B（phosphorylated protein kinase B，P-Akt）單克隆抗體（北京博奧森生物技術有限公司）；丹參酮I（南京春秋生物工程有限公司）；ECL發光試劑盒（美國Thermo公司）；鹽酸二甲雙胍片（齊魯制藥有限公司）；鹽酸吡格列酮片（江蘇德源藥業）。

1.1.3 主要儀器 熒光正置顯微鏡（Nikon 80i，日本尼康公司）；Western blot檢測全套設備（美國Bio-Rad公司）；GL-20A全自動冷凍高速離心機（湖南儀器儀表總廠離心機廠）；超純水機（美國Millipore公司）；Leica 2135石蠟病理切片機（德國Leica公司）。

1.2 方法

1.2.1 T2DM小鼠模型的制備 普通雄性健康ICR小鼠80只隨機分成兩組：正常組10只，高脂高糖組70只，正常組給于普通飼料，高脂高糖組給于高脂高糖飼料飼養，時間為4周。第4周末，取已經配好的STZ溶液（取適量的STZ溶于檸檬酸緩沖液中，以1%的濃度配制，由于STZ不穩定，所以在快速稱取后用錫箔紙包好置于冰上保存，現配現用，配好的溶液在30 min內注射完畢），對高脂高糖組小鼠按照40 mg/kg的劑量進行腹腔注射，每隔2 d注射1次，連續注射5次（每次注射前禁食禁水過夜）。2周后，測空腹血糖，將血糖值高于13.89 mmol/L的實驗小鼠挑選出來。

1.2.2 動物分組及給藥方法 共有54只小鼠造模成功，再隨機分為6組，每組9只，分別是模型組、丹參酮I（高劑量、中劑量、低劑量）組、二甲雙胍（Met）組和吡格列酮（Pio）組，隨后繼續給于高脂高糖飼料喂養，持續3周。丹參酮I組3個濃度分別是120、60、30 mg/kg（丹參酮I溶解在玉米油中，腹腔注射，現配現用），二甲雙胍濃度是120 mg/kg，吡格列酮濃度是12 mg/kg（片劑研磨成粉末后，充分溶解于蒸餾水中，腹腔注射，現配現用），每天注射相應劑量的藥物。同時，每周測1次體重和空腹血糖。第3周末，取肝臟。

1.2.3 肝臟組織中的蛋白提取 將50～100 mg肝組織剪碎至勻漿器內，加入1 ml裂解液和10 μl PMSF，勻漿20～40次，每隔5 min勻1次，成液裂解30 min，4℃、12 000 r/min離心30 min，上清液轉移至新的EP管中。使用BCA試劑盒進行蛋白定量檢測，各組上清液用裂解液調至相同蛋白濃度，于高壓后的EP管加入5×SDS蛋白上樣緩沖液（蛋白上清液 ∶蛋白上樣緩沖液=4∶1，蛋白上樣緩沖液要離心），混勻，100℃沸水煮10 min，放-20℃凍存。

1.2.4 免疫組化及病理形態學分析 各組的肝臟用4%多聚甲醛溶液固定24 h，常規石蠟包埋，Leica切片機切片，厚4 μm，利用組織芯片技術，將蠟片裱貼于載玻片上，并于65℃中干烤1 h，SP法［7］檢測PTP1B蛋白表達。

1.2.5 檢測肝臟組織中PTP1B、Akt和P-Akt蛋白水平 將提取的總蛋白進行SDS-PAGE電泳，使蛋白轉移至PVDF膜上，轉膜后用5%的脫脂奶粉室溫下封閉3 h，分別加入β-actin（1∶300）、PTP1B（1∶100）、Akt（1∶100）、P-Akt（1∶100）一抗，4℃孵育過夜后TBST洗滌3次，每次15 min，然后加入辣根過氧化物酶（HRP）標記的二抗（1∶10 000），室溫孵育1 h，TBST洗滌3次，每次15 min。最后用ECL發光液進行曝光顯影，Bio-Rad照相系統拍照，并用Image-J軟件分析蛋白的相對表達量。

1.3 統計學處理 采用SPSS 19.0軟件進行分析，計量資料以表示，多個樣本均數比較采用單因素方差分析。

2 結果

2.1 丹參酮I對STZ誘導的T2DM小鼠空腹血糖的影響 為了觀察丹參酮I對小鼠血糖的影響，給藥后，每周測定其空腹血糖，連續檢測3周。結果顯示，在給藥之前，所有的T2DM小鼠的空腹血糖均高于正常組。從給藥之后的第1周開始，模型組的空腹血糖與丹參酮I高劑量組、Met組、Pio組比較，差異有統計學意義［第1周：F=34.49，P＜0.05；第2周：F=29.82，P＜0.05；第3周：F=41.87，P＜0.05］，并且模型組的血糖在3周內保持穩定。提示制備的T2DM模型較穩定，并且一定濃度的丹參酮I可以降低T2DM ICR小鼠的血糖。見圖1。

2.2 丹參酮I對STZ誘導的T2DM小鼠體重的影響 應用高脂高糖結合多次小劑量STZ誘導的方法建立T2DM模型，結果顯示，第1周時，模型組小鼠體重明顯高于丹參酮I（中劑量、低劑量）組、Met組和Pio組（F=4.03，P＜0.05）；模型組與丹參酮I高劑量組、正常組比較，差異均無統計學意義。從第2周開始，模型組小鼠毛發蓬松，缺乏光澤，活動度顯著減小，體重明顯降低，第3周，模型組小鼠體重明顯低于正常組和丹參酮I高劑量組（F=11.69，P ＜0.05）。提示一定濃度的丹參酮I在一定程度上可以改善T2DM ICR小鼠的癥狀。見表1。

圖1 ICR小鼠在3周內的空腹血糖變化

表1 ICR小鼠在3周內的體重變化（g，）

表1 ICR小鼠在3周內的體重變化（g，）

與模型組比較：*P＜0.05；與正常組比較：#P＜0.05

分組 第1周 第2周 第3周正常 40.58±4.03 41.40±2.70 41.25±1.31模型 41.14±3.54 37.88±2.24 30.53±3.81#丹參酮I高劑量 38.22±2.77 30.29±3.37 36.97±2.28*丹參酮I中劑量 36.25±2.97* 36.10±3.73 32.67±5.33丹參酮I低劑量 35.29±3.71* 34.17±3.40 28.23±4.72 Met 37.59±3.37* 36.48±4.25 37.00±3.00 Pio 36.16±1.62* 35.53±2.05 33.64±1.68

2.3 丹參酮I對STZ誘導的T2DM小鼠肝組織病理形態的影響 HE染色結果顯示，模型組小鼠部分肝臟組織結構中可見細胞質腫脹，細胞核固縮，有局部的細胞壞死，組織中炎癥較其他組嚴重。丹參酮I組肝組織中未見明顯細胞質腫脹和細胞核固縮現象，且組織中炎癥較輕。提示一定濃度的丹參酮I可以降低T2DM ICR小鼠肝臟的損傷。見圖2。

2.4 免疫組化法檢測各組小鼠肝臟組織PTP1B蛋白表達的變化 以PTP1B陽性反應部位積分光密度（integral optical density，IOD）為指標，結果顯示，模型組肝臟組織PTP1B表達最多，其與丹參酮I高劑量組、Met組、Pio組比較，差異有統計學意義（F= 43.75，P＜0.05），與丹參酮I中劑量組、低劑量組比較，差異無統計學意義。提示一定濃度的丹參酮I可以降低T2DM ICR小鼠肝臟組織中PTP1B蛋白的表達。見圖3。

圖2 小鼠肝臟組織形態學染色 HE× 100 A：正常組；B：模型組；C：丹參酮I高劑量組；D：丹參酮I中劑量組；E：丹參酮I低劑量組；F：Met組；G：Pio組

2.5 Western blot法檢測肝臟組織中PTP1B蛋白水平 模型組PTP1B蛋白表達高于正常組、丹參酮I（中劑量、高劑量）組、Met組和Pio組，差異有統計學意義（F=19.94，P＜0.05）；模型組PTP1B蛋白的表達略高于丹參酮I低劑量組，差異無統計學意義。丹參酮I低劑量組PTP1B蛋白表達明顯高于Met組和Pio組（F=19.94，P＜0.05）；丹參酮I中劑量組與Met組、Pio組比較，差異均無統計學意義；丹參酮I高劑量組與Met組、Pio組比較，差異均無統計學意義。提示一定濃度的丹參酮I可以降低T2DM ICR小鼠肝臟中PTP1B蛋白的表達。見圖4。

2.6 Western blot法檢測肝臟組織中Akt和P-Akt蛋白水平 各組中Akt的表達均無明顯差異。模型組P-Akt的表達明顯低于正常組、丹參酮I高劑量組、Pio組和Met組（F=14.09，P＜0.05）；模型組與丹參酮I（中劑量、低劑量）組比較，差異均無統計學意義。丹參酮I低劑量組P-Akt的蛋白表達明顯低于Met組和Pio組（F=14.09，P＜0.05）；丹參酮I中劑量組P-Akt的蛋白表達低于Met組和Pio組（F= 14.09，P＜0.05）；丹參酮I高劑量組與Met組、Pio組比較，差異均無統計學意義。提示一定濃度的丹參酮I可以提高T2DM小鼠肝臟中P-Akt蛋白的表達。見圖5。

3 討論

圖3 免疫組化法檢測肝組織PTP1B蛋白的表達 SP×400

模型組小鼠注射STZ 3周后，毛發蓬松，色澤灰暗，活動度顯著減小，體重明顯降低。與之相比，丹參酮I高劑量組、Met組和Pio組的上述癥狀較輕。進一步測定各組小鼠的空腹血糖發現，雖然丹參酮I低劑量和中劑量組的空腹血糖未見明顯變化，但高劑量組卻見明顯的降血糖作用，這為進一步研究丹參酮I抗糖尿病作用提供了線索。近年來，丹參酮Πa在糖尿病方面的研究也只是間接的反映其他問題，筆者查閱了大量文獻，并未有其對抗糖尿病的直接探討，例如對T2DM大鼠缺血再灌注損傷的保護作用［5］，改善T2DM大鼠神經功能的損傷［6］，改善糖尿病引起的早期腎病［7］等。藥物的溶解度、給藥方式和老鼠種系等都會影響藥物和受試對象的量效關系。國內外在制備大鼠T2DM模型方面研究較為深入，以小鼠為研究對象的造模研究較少，本研究采用高脂高糖飲食再加上多次小劑量腹腔注射STZ的方法制備T2DM模型小鼠。以玉米油為溶劑［8］，是因為丹參酮I是具有脂溶性的物理性質。以腹腔注射的方式給藥，是因為腹膜面積大，密布血管和淋巴管，藥物吸收能力特強，且腹腔補液時間短，速度快。而在造模過程中所用STZ的給藥劑量、次數以及時間間隔［9］也會影響量效關系，因此，如何選擇合適的條件，對實驗結果都會有很大的影響。

由病理組織芯片［10］觀察，模型組肝臟組織出現的炎癥反應比給藥組嚴重。目前TNF-α、IL-6等是研究的熱點，兩者既是促炎性介質，也是細胞因子，直接或間接激活肝星狀細胞釋放細胞外基質，最終導致肝纖維化，因此肝星狀細胞在肝纖維化中起決定性作用。有文獻［11］報道，IL-6在T2DM及其并發癥的發生發展中起重要作用。而肝纖維化往往也會伴有炎癥的出現，這為進一步研究丹參酮I是否可以抑制肝星狀細胞的激活以及其對T2DM動物肝纖維化［12］發展過程的影響提供了線索。

圖4 Western blot法檢測肝臟PTP1B蛋白表達

圖5 Western blot法檢測肝臟Akt和P-Akt蛋白表達

PTP1B和PI3K/Akt信號通路同時作為胰島素信號通路中的影響因子，對胰島素信號的增強或者減弱發揮著重要作用。PTP1B屬于蛋白質酪氨酸磷酸酶家族，拮抗胰島素信號，經免疫組化和Western blot檢測顯示，一定濃度的丹參酮I可以抑制PTP1B在肝臟組織中的表達。PI3K/Akt信號通路協同胰島素信號通路，是作為胰島素的主要信號通路參與體內糖脂代謝病理生理機制的［13］。本研究通過檢測PTP1B下游所調節的P-Akt表達，觀察丹參酮I對肝臟組織中Akt磷酸化水平的影響，Western blot結果顯示，一定濃度的丹參酮I能夠有效地提高肝臟組織中Akt的磷酸化水平，使P-Akt蛋白的表達升高。有文獻［14］報道，PTP1B主要在肌肉和脂肪組織中表達，其過表達與胰島素抵抗現象有相關性。PTP1B可以通過增加表達或提高活性使胰島素受體及受體底物去磷酸化，而對胰島素信號轉導起負性調節作用，最終導致胰島素抵抗［15］。胰島素抵抗易導致2型糖尿病，而胰島素攝取和利用葡萄糖的效率是反映胰島素抵抗強弱的指標，因此，PTP1B抑制劑和胰島素增敏劑成為近年來研究的熱點，本研究探討丹參酮 I對小鼠肝臟組織中PTP1B的表達有重要意義。對 PTP1B抑制劑的研究多是體外實驗，而建立胰島素抵抗模型細胞最經典的是HepG2細胞，其模型建立的方法日趨成熟，丹參酮I對胰島素抵抗模型的HepG2細胞株中PTP1B表達的研究成為下一步的工作。

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Anti-diabetic effect of tanshinone I on ICR mice with type 2 diabetes mellitus

Wu Sheng1，2，3，Cai Shuangpeng1，2，3，Li Xiaofeng1，2，3，et al
（1School of Pharmacy，2Institute for Liver Diseases，Anhui Medical University，
3Anhui Institute of Innovative Drugs，Hefei230032）

Objective To observe the effect of tanshinoneⅠon the liver of ICR mice with type 2 diabetes mellitus （T2DM），induced by high-fat diet combined with several low-dose streptozotocin（STZ）injections and to explore its potential mechanism.Methods Establish the mouse model of T2DM and mice would be divided randomly into the model group，high-dose tanshinoneⅠgroup，medial-dose tanshinoneⅠgroup，low-dose tanshinoneⅠ group，the metformin（Met）group and the pioglitazone（Pio）group.The groups above were fed with high-fat diet and received daily injections of various-dose drugs as previously described for a period of three weeks.Livers were extracted at the end of the third week.Pathological changes by means of hematoxylin and eosin（HE）staining were observed.The protein expression levels of protein tyrosine phosphatase-1B（PTP1B），Akt and P-Akt were detected by the immunohistochemical experiment and Western blot.Results High-dose tanshinoneⅠ could decrease FBG of mice with type 2 diabetes mellitus（P＜0.05）and increase their body weight（P＜0.05）.Cells with cytoplasm tumefied and nucleus pyknosed，necrocytosis and inflammation in tanshinoneⅠgroups could be seen less compared to the modle group.Immunohistochemistry showed that high-dose tanshinoneⅠcould decrease the protein expression of PTP1B in mice with type 2 diabetes mellitus（P＜0.05）.Analysis of Western blot revealed that medial-dose and high-dose tanshinoneⅠcould decrease the protein expression levels of PTP1B in mice with T2DM（P＜0.05）.At the same time，there was no significant difference in the protein expression levels of Akt between the model group and tanshinoneⅠgroups.High-dose tanshinoneⅠcould increase the protein expression levels of P-Akt compared to the modle group（P＜0.05）.Conclusion TanshinoneⅠin high concentration could decrease FBG and relieve the injury of liver in T2DM ICR mice，induced by high-fat diet combined with several low-dose STZ injections.At the same time，it could also decrease their protein expression levels of PTP1B and increase P-Akt expressions.

type 2 diabetes mellitus；tanshinoneⅠ；streptozotocin；animal model；protein tyrosine phosphatase-1B

R 587.1

A

1000-1492（2016）09-1286-06

時間：2016-8-1 14：07

http：//www.cnki.net/kcms/detail/34.1065.R.20160801.1407.024.html

2016-05-04接收

國家自然科學基金（編號：81473268、81273526）；高等學校博士學科點專項科研基金（編號：20123420120001）；安徽省自然科學基金（編號：1408085MKL31）；安徽省科技攻關計劃項目（編號：1301042212）

安徽醫科大學1藥學院、2肝病研究所，3安徽省創新藥物 產業共性研究院，合肥 230032

吳 勝，男，碩士研究生； 李 俊，男，教授，博士生導師，責任作者，E-mail：lj@ahmu.edu.cn