遺傳性凝血因子Ⅴ及Ⅷ聯合缺陷癥的基因診斷

汪安友，劉 欣，吳競生，孫自敏

遺傳性凝血因子Ⅴ及Ⅷ聯合缺陷癥的基因診斷

汪安友，劉 欣，吳競生，孫自敏

目的 對2例遺傳性凝血因子Ⅴ及Ⅷ聯合缺陷癥（F5F8D）患者家系進行基因診斷分析。方法 常規凝血功能檢測活化部分凝血活酶時間（APTT）、凝血酶原時間（PT）、凝血因子Ⅴ活性（FV：C）及凝血因子Ⅷ活性（FⅧ：C）；聚合酶鏈式反應（PCR）法測序分析LMAN1及MCFD2基因全外顯子序列。結果 患者1的APTT及PT分別為78.7 s、21.1 s，FⅧ：C降至23.8%，FV：C為6%；其MCFD2基因3號外顯子存在純合突變，第242堿基位點腺嘌呤突變為胞嘧啶（A＞C），導致氨基酸序列第81位天冬氨酸突變成丙氨酸（Asp81Ala）。患者2的APTT及PT分別為78.5 s、19.6 s，FⅧ：C及FV：C分別為24.8%、9.6%；其LMAN1基因12號外顯子第1456堿基位點存在鳥嘌呤-胸腺嘧啶-鳥嘌呤純合缺失（1456delGTG），導致氨基酸序列第486位纈氨酸（Val）缺失。結論 國內首次報道兩種新型的MCFD2及LMAN1基因突變，導致兩種不同臨床表型的遺傳性F5F8D。

凝血因子V；凝血因子VIII；LMAN1；MCFD2；突變

遺傳性凝血因子V及Ⅷ聯合缺乏癥（inherited coagulation factor V andⅧdisease，F5F8D）是一種罕見的常染色體隱性遺傳性疾病，發病率約為百萬分之一，男女均可發病。目前國際上報道的病例主要集中于中東地區。患者臨床主要表現為有輕至中度的出血傾向，實驗室檢測通常為凝血酶原時間（prothrombin time，PT）及凝血活酶時間（activated partial thromboplastin time，APTT）延長，同時伴有凝血因子V及Ⅷ的活性下降，檢測后發現多在5%～30%［1-2］。研究［3-4］證實遺傳性F5F8D與凝血因子Ⅴ及Ⅷ自身基因無關，主要由細胞內自內質網至高爾基體相關的轉運蛋白LMAN1及MCFD2基因突變引起。目前國際上已報道的LMAN1及MCFD2基因不同類型突變導致遺傳性F5F8D的共計49種［1-2］，國內總共報道過4個完整F5F8D家系研究［5-6］，均未發現新型LMAN1及MCFD2基因突變。該研究首次發現2例來自不同家系的疑似遺傳性F5F8D患者，對這兩個家系做了基因診斷分析，最終確診了該2例遺傳性F5F8D，其基因突變類型均為國內首次發現，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 研究對象 家系1資料：先證者，男，30歲，因外傷導致顱內出血就診于我院急診，常規凝血功能檢測提示APTT、PT均延長，經凝血因子活性檢測，臨床診斷為凝血因子Ⅴ及Ⅷ聯合缺陷，后經基因診斷分析，明確診斷為遺傳性F5F8D。先證者父母系近親結婚，其父親及大姐為雜合子攜帶者，其母親因已病逝，推測為雜合子攜帶者。家系遺傳學圖譜見圖1。家系2資料：先證者，女，35歲，因不孕癥就診我院門診，無明顯出血傾向，常規凝血功能檢測提示APTT、PT均延長，經凝血因子活性檢測，臨床診斷為凝血因子Ⅴ及Ⅷ聯合缺陷，同樣經基因診斷分析，明確診斷為遺傳性F5F8D。先證者父母系近親結婚，母親及姐為雜合子攜帶者，其父親因已去逝，推測為雜合子攜帶者。家系遺傳學圖譜見圖2。

圖1 家系1遺傳學圖譜（箭頭代表先證者）

1.2 方法

1.2.1 凝血功能及凝血因子活性檢測 0.129 mol/L枸櫞酸鈉作為抗凝劑，靜脈采集血液標本，3 000 r/m離心10 min，分離血漿。采用STAGO公司半自動血凝儀常規檢測患者及家系成員外周凝血功能PT、APTT指標。STAGO公司凝血因子檢測試劑盒檢測分析患者具體凝血因子活性指標。

圖2 家系2遺傳學圖譜（箭頭代表先證者）

1.2.2 基因測序分析 0.129 mol/L枸櫞酸鈉作為抗凝劑，靜脈采集患者及其家系成員、健康對照外周血標本，外周血基因 DNA提取試劑盒提取基因DNA。PCR法擴增LMAN1及MCFD2基因所有外顯子序列：藥物設計參照文獻［7］，PCR法擴增反應體系：50 μl，Taq buffer 5 μl，25 mmol/L MgCl25 μl，10 mmol/L dNTP 1 μl，10 ng DNA模板1 μl，上下游引物各1 μl，Taq DNA聚合酶5 U/μl 0.5 μl及滅菌蒸餾水35.5 μl。PCR法擴增反應條件：95℃預變性3 min，94℃變性30 s，60℃退火35 s，72℃延伸40 s，10個循環，每個循環退火溫度下降0.5℃，94℃變性30 s，55℃退火35 s，72℃延伸40 s，25個循環，72℃延伸3 min。PCR擴增產物經瓊脂糖凝膠電泳、割膠純化后送上海生工測序分析。

2 結果

2.1 實驗室凝血功能檢測及臨床出血表現 通過檢測先證者1凝血功能及凝血因子活性發現，其APTT 78.7 s及PT 21.1 s均顯著延長，FVIII：C減低為23.8%，FV：C減低為6%，其余凝血因子活性均未見異常；各家系成員的凝血功能指標檢測結果及臨床出血傾向見表1。

通過檢測先證者2凝血功能及凝血因子活性發現，其APTT及PT分別為78.5 s、19.6 s，FⅧ：C降至24.8%，FV：C為9.6%，其余凝血因子活性均未見異常；各家系成員的凝血功能指標檢測結果及臨床出血傾向見表2。

2.2 基因檢測分析 家系1：通過測序檢測分析發現先證者1的MCFD2基因所有外顯子，分析先證者1在該基因的第3號外顯子處檢測到1個純合突變：g.242 A＞C，該位點突變直接導致第81位天冬氨酸突變成丙氨酸（Asp81Ala），先證者1的父親和大姐該位點為雜合突變，50例健康對照均未檢測到該突變位點。先證者1及其家系成員的LMAN1基因均未發現異常突變。見圖3。

家系2：通過測序檢測分析發現先證者2的LMAN1基因所有外顯子，分析先證者2在該基因的第12號外顯子處檢測到1個純合突變：1456delGTG，該位點純合缺失突變直接導致第486位纈氨酸丟失；先證者2的母親和姐姐該位點為雜合缺失突變，50例健康對照均未檢測到該突變位點。先證者2及其家系成員的MCFD2基因均未發現異常突變。見圖4。

表1 先證者1及其家系成員凝血功能檢測及臨床出血表現

表2 先證者2及其家系成員凝血功能檢測及臨床出血表現

圖3 家系1成員中MCFD2基因檢測發現突變位點

圖4 家系2成員中LMAN1基因檢測發現突變位點

3 討論

遺傳性F5F8D首次報道于1954年［8］，該病在中東地區發病率較高，與這些地區的近親結婚率高有關。患者通常自幼有輕至中度的出血傾向，包括發生瘀斑、鼻衄、牙齦出血、女性月經過多，以及外傷或拔牙、外科術后過量出血等。實驗室檢查患者凝血功能指標APTT、PT指標均延長，FV、FⅧ活性水平均降低，多維持在正常人的5%～30%。

目前研究［1］已經證實，該病的分子發病機制與LMAN1或MCFD2基因的突變相關。LMAN1基因位于18q2l，包括13個外顯子，編碼成熟蛋白由510個氨基酸組成；MCFD2基因位于2p21，較LMAN1基因小，包括4個外顯子，其編碼成熟蛋白由146個氨基酸組成。LMAN1或MCFD2基因編碼的蛋白，可以在細胞內相互結合形成一種穩定的Ca2+依賴轉運復合體，主要參與細胞內凝血因子V及Ⅷ從內質網至高爾基體的轉運過程。因此，這2個基因的缺陷可以導致細胞內凝血因子V及VIII自內質網至高爾基體的轉運障礙，從而使血漿中凝血因子V及Ⅷ水平下降，臨床表現為凝血指標的延長，以及不同程度的出血傾向。

本研究中家系1的先證者為30歲男性，因外傷導致顱內出血急診轉入我院，經實驗室常規凝血功能檢測顯示其APTT、PT指標均有不同程度的延長，進一步臨床檢測了患者相關凝血因子活性，其凝血因子V：C、Ⅷ：C分別降至6%、23.8%。其余凝血因子活性水平均為正常，排除繼發性相關因素后，考慮患者父母系近親結婚，臨床診斷考慮為遺傳性F5F8D。其父母系表兄妹結婚，該病為常染色體隱性遺傳性疾病，對先證者進行LMAN1及MCFD2基因檢測，該患者是由MCFD2基因的第3號外顯子存在g.242 A＞C純合突變，該位點突變直接導致第81位天冬氨酸突變成丙氨酸（Asp81Ala），先證者的父親和大姐該位點為雜合突變，先證者母親因腦出血已病逝，推測其母親該位點亦為雜合突變。目前國際上已發現18種MCFD2基因突變，其中錯義突變僅8種［1，9-11］，本課題組最早于2014年在國際上首次報道Asp81Ala位點錯義突變，該突變為MCFD2基因上迄今為止發現的第9種類型錯義突變［2］。

本研究家系2中的患者為女性，因不孕癥就診，常規檢測意外發現凝血功能指標異常，PT、APTT均延長，同樣伴有凝血因子V及Ⅷ活性下降。但其自幼無出血傾向，且曾經歷婦科手術治療，追問病史未有術中及術后過量出血表現。經基因檢測分析發現：先證者2在LMAN1的第12號外顯子處存在1456delGTG純合突變，直接導致第486位纈氨酸丟失；先證者2的母親和姐姐該位點為雜合缺失突變，其父親因去世，無法采集標本檢測，結合疾病隱性遺傳性規律，推測其父親該位點同樣為雜合缺失突變。目前LMAN1基因的13個外顯子已發現36種不同類型突變，這些突變以無義突變或移碼突變為主，均可導致LMAN1基因編碼蛋白的功能缺失［1，11］。

本研究系在我省首次報道發現2例F5F8D患者，在臨床診療過程中進行了及時的診斷、分析及治療，并進一步對患者家系進行基因診斷分析。在國內首次發現2種新型的LMAN1、MCFD2基因突變，這兩種類型的基因突變導致2種截然不同的臨床表型。盡管先證者1和先證者2檢測結果均提示APTT、PT延長；凝血因子Ⅴ、Ⅷ均存在不同程度減少，但是先證者1臨床出血傾向較明顯，而先證者2并無明顯臨床出血癥狀，更有趣的是先證者2甚至在未進行凝血因子替代治療的情況下，曾經成功經歷了婦科手術，術后未見明顯出血傾向。不同類型的LMAN1、MCFD2基因突變可以導致不同類型的臨床出血表型，這與國外研究［1］報道相一致。至于其機制，很可能是由于LMAN1、MCFD2轉運蛋白的不同功能區域，在參與細胞內凝血因子Ⅴ、Ⅷ轉運過程中發揮作用大小相關，因此進一步的研究LMAN1、MCFD2轉運蛋白的不同結構域的基礎功能很有必要，從而為更好的理解認識遺傳性F5F8D提供依據。

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Gene diagnosis of hereditary coagulation factor V andⅧ deficiency

Wang Anyou，Liu Xin，Wu Jingsheng，et al
（Dept of Hematology，Affiliated Provincial Hospital of Anhui Medical University，Hefei 230001）

Objective To analyze gene diagnosis of the 2 cases with inherited coagulation factor V andⅧdefects （F5F8D）.Methods Routine coagulation function test was used by APTT，PT，FV and FⅧ：C methods；Sequencing analysis all exons of LMANl and MCFD2 genes were detected by PCR method.Results In patient 1，APTT and PT were 78.7s，21.1s；FⅧ：C and FV dropped to 23.8%，6%respectively；the existence of a homozygous mutation of 242 A＞C was detected in exon 3 of MCFD2 gene，which led Asp81 mutation to Ala.In patient 2，APTT and PT were 78.5s，19.6s，FV and FⅧ：C were 24.8%，9.6%respectively；the exon 12 of LMAN1 gene had homozygous deletion in 1456GTG，which caused 486Val deletion.Conclusion Two new MCFD2 and LMAN1 mutations are first reported in the world，resulting in two different clinical phenotypes of hereditary coagulation factor V andⅧdeficiency.

coagulation factor V；coagulation factor VIII；LMAN1；MCFD2；mutation

R 554+.9；R 446.9

A

1000-1492（2016）09-1308-04

時間：2016-8-1 14：07

http：//www.cnki.net/kcms/detail/34.1065.R.20160801.1407.032.html

2016-05-04接收

安徽省自然科學基金（編號：1308085QH129）；安徽高校省級自然科學研究項目（編號：KJ2013Z133）；安徽醫科大學校科學研究基金項目（編號：2012xkj048）

安徽醫科大學附屬省立醫院血液內科，合肥 230001

汪安友，男，博士，主治醫師，責任作者，E-mail：way0623@ 163.com