長鏈非編碼RNA PANDAR在腎癌中的表達分析及臨床意義

金 露，李一帆，何 韜，胡 佳，劉家駒，桂耀庭，楊尚琪，毛向明，來永慶

長鏈非編碼RNA PANDAR在腎癌中的表達分析及臨床意義

金 露1，2，3，李一帆1，2，3，何 韜2，3，胡 佳2，3，劉家駒2，3，桂耀庭2，3，楊尚琪2，3，毛向明2，3，來永慶2，3

目的 檢測長鏈非編碼RNA PANDAR在腎癌及癌旁組織中的表達水平，探討其在腎癌中的臨床意義。方法 提取48對組織（腎癌及對應癌旁組織）中的總RNA，經逆轉錄獲得cDNA后通過實時熒光定量聚合酶鏈式反應（qRTPCR）方法檢測PANDAR表達量，分析正常組織與腎癌組織中的表達差異，探討其表達水平與患者臨床特征之間的聯系。結果 腎癌組織中PANDAR的表達水平明顯低于配對癌旁正常組織（P＜0.001），標本中共有38例（79.17%）腎癌標本PANDAR表達下調，癌組織中PANDAR表達與患者TNM分期和AJCC分級相關，與患者年齡、性別及腎癌病理類型無明顯相關性（P＞0.05），PANDAR低表達組患者生存率低于高表達組患者（P＜0.05）。結論 PANDAR在腎癌組織中表達明顯下調，且和腎癌TNM、AJCC分級和預后相關，提示其有作為腎癌標志物應用于臨床的可能。

腎癌；腫瘤分期；長鏈非編碼RNA；PANDAR

腎細胞癌（renal cell carcinoma，RCC）又稱腎癌，是泌尿系統常見的惡性腫瘤，約占成人惡性腫瘤的3%［1］。腎癌對放療和化療均不敏感，手術切除是主要的治療方式，但術后復發、轉移率極高［2］。目前在臨床尚無可用于腎癌早期診斷或治療的生物標志物，因此有必要對腎癌的發生機制進行深入研究，以期找到相關腎癌標志物。近年來，長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA）引起了人們的廣泛關注。lncRNA是一類不具有蛋白質編碼功能的RNA，長度在200個核苷酸以上，一般低于20 000個核苷酸［3］。基因組學的研究［4］表明，哺乳動物的基因可以轉錄出大量不具有蛋白編碼功能的RNA，有生物活性并在多種疾病中存在異常表達。另外，LncRNA可在轉錄、轉錄后水平調控基因表達［5］。該研究選擇lncRNA PANDAR（promoter of CDKN1A antisense DNA damage activated RNA）作為研究對象，探討其在腎癌中的臨床意義。

1 材料與方法

1.1 組織標本 選取安徽醫科大學第一附屬醫院和北京大學深圳醫院手術切除的48對腎癌組織及配對癌旁組織，標本均得到醫院醫學倫理委員會批準且患者已簽署知情同意書。每對標本包括腎癌組織及癌旁正常組織（取自根治性腎切除術距腎癌組織＞2 cm的腎組織）各1份，病理切片證實腎癌組織含癌組織80%以上，癌旁組織中無癌組織侵犯。標本切除后保存于-80℃冰箱中備用。患者臨床資料完整（表1），術后均進行了常規隨訪。腎癌臨床分期參考國際抗癌組織（UICC）/美國癌癥聯合會（AJCC）2010年腎癌分期。

1.2 RNA提取 在液氮下碾磨標本組織，加入TRIzol試劑（美國Invitrogen公司），說明書所述提取腎癌標本組織中的總RNA，使用ND-2000/2000c紫外分光光度計測定其濃度，提取后的總RNA保存于-80℃冰箱。

1.3 逆轉錄 根據RNA反轉錄試劑PrimeScriptTMRT reagent Kit（日本TaKaRa公司）說明書所述，取1 μg總RNA，加入反應試劑，使用普通PCR儀完成逆轉錄。反應條件：42℃ 15 min，之后85℃ 5 s。產物稀釋10倍后保存于-80℃。

1.4 實時熒光定量聚合酶鏈式反應（real-time quantitative polymerase chain reaction，qRT-PCR）檢測PANDAR表達量 根據熒光定量PCR試劑SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ（日本TaKaRa公司）說明書所述，以合成的cDNA為模板，加入反應試劑進行qPCR反應。反應體系包括：模板cDNA 1 μl，2* SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ10 μl，PANDAR正向引物1 μl，PANDAR反向引物1 μl，加無菌蒸餾水至總反應體積20 μl。PANDAR F：5'-CAATGCCTTGCTTCACAGTC-3'，R：5'-TGGGGTTCTTAGAAGTGGTGA-3'；內參選用GAPDH基因，GAPDH F：5'-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3'， R： 5'-GAAGATGGTGGGATTTC-3'。qPCR反應條件：95℃ 2 min預變性；之后95℃ 5 s，60℃30 s，然后70℃ 30 s，共計完成45個循環。

1.5 統計學處理 PANDAR相對表達量采用ΔΔCt法分析，以GAPDH為內參進行標準化處理：ΔCt= CtPANDAR-CtGAPDH，ΔΔCt=ΔCtRCC-ΔCtNormal。通過2-ΔΔCt計算PANDAR在腎癌組織與癌旁正常組織表達量比值，使用SPSS 17.0完成統計分析。采用配對t檢驗分析配對組織間PANDAR表達量的差異；將患者按PANDAR表達水平及臨床特征分組列出四格表，采用χ2檢驗分析；采用Kaplan-Meier法和Log-rank檢驗比較兩組患者生存率差異；P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 PANDAR在腎癌組織中表達下調 48對腎癌組織中共有38例腎癌標本表達量低于配對癌旁組織，腎癌組織與配對癌旁組織中PANDAR表達量比值經對數轉換后如圖1所示，縱坐標為 log2Ratio （T/N），橫坐標以下表示腎癌組織表達量低于配對癌旁組織；腎癌組織中PANDAR表達量明顯低于癌旁正常組織（t=-4.016，P＜0.001），癌旁正常組織中PANDAR表達量是腎癌組織的2.42±0.25倍。

2.2 PANDAR的表達水平和患者臨床分期、分級相關 以腎癌組織中PANDAR的-ΔΔCT平均值-1.27為界將患者分為高表達組、低表達組，其中低表達組26例；根據患者年齡中位數將患者分為高齡組、低齡組。列出四格表，行 χ2檢驗，結果顯示PANDAR表達水平和患者年齡、性別以及腎癌組織類型無關，在TNM分期和AJCC分級較高的患者PANDAR表達水平更低（P＜0.05）。見表1。

圖1 標本組織中PANDAR的表達

圖2 PANDAR低表達組和高表達組患者生存率比較

2.3 PANDAR低表達的患者預后較差 納入研究的患者均進行了常規隨訪，隨訪期內死亡18例（37.5%）。將患者分為高表達組、低表達組，采用Kaplan-Meier法和Log-rank檢驗比較兩組患者生存率，生存曲線見圖2，PANDAR低表達組患者的中位生存時間為58個月，低表達組5年生存率（42.31%）明顯低于高表達組（72.73%）（P＜0.05）。

3 討論

腎癌是預后較差的一種腫瘤，已經發生轉移的腎癌患者五年生存率約為10%［6］，早期診斷對于提高其預后有很大的幫助，因此有必要尋找可用于腎癌早期診斷的生物標志物。雖然截至目前只發現了少數有功能的lncRNA，但綜合現有研究可以發現lncRNA和一系列的生物進程相關，如癌基因的激活、X染色體失活、劑量失活效應、基因的轉錄和翻譯、蛋白質的活性調控等［5］。因此，lncRNA在基因調節中發揮著重要作用。

表1 PANDAR表達水平和腎癌臨床分期、分級相關

目前關于lncRNA PANDAR在腫瘤中的相關研究較少，只在肝細胞癌、非小細胞肺癌中有相關報道，且lncRNA PANDAR表達水平均和患者預后相關［7-8］。在腎細胞癌中尚無關于lncRNA PANDAR的研究，本研究首次在腎細胞癌組織中利用qPCR檢測PANDAR的表達。現有關于PANDAR的研究［7-8］主要在非小細胞肺癌和肝細胞癌。研究［8］顯示，在非小細胞肺癌組織中PANDAR表達下調，且表達量和腫瘤分期、腫瘤體積以及患者預后相關。在非小細胞癌細胞中，PANDAR可通過調節Bcl-2的表達影響細胞凋亡。在肝細胞癌中，PANDAR表達上調且表達水平和患者預后、TNM分級相關，且在肝癌細胞中敲除PANDAR可抑制癌細胞的增殖［7］。本研究首次利用qPCR在腎癌及配對癌旁組織中檢測了lncRNA PANDAR的表達，發現PANDAR在腎癌組織中表達明顯下調。且PANDAR在腎癌中的表達和腎癌TNM分期、AJCC分級相關，PANDAR低表達組患者生存率低于高表達組患者，提示PANDAR與腎癌患者預后相關，在腎癌的發生發展中起著一定的作用，有作為腎癌生物標志物應用于腎癌診斷、判斷預后及治療的可能性。但本研究病例數偏少，其所致偏倚不能排除，下一步的研究目標將是擴大樣本量驗證PANDAR的表達，并對PANDAR在腎癌組織細胞中的功能、機制進行研究。

目前在腎癌中關于lncRNA的研究較少，已經發現在腎癌細胞中具有功能的lncRNA有GAS5、MEG3、MALAT1、RCCRT1、HOTAIR［9-14］，其中高表達的MALAT1、RCCRT1發揮著促癌基因的作用，低表達的MEG3、GAS5則發揮著抑癌基因的作用。另外，研究［13］表明RCCRT1的表達水平和腫瘤大小、TNM分級以及淋巴結轉移數量相關。因此lncRNA的異常表達和腎癌的發生以及進展存在著一定的關系。

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Expression and clinical significance
of long non-coding RNA PANDAR in renal cell carcinoma

Jin Lu1，2，3，Li Yifan1，2，3，He Tao2，3，et al
（1The Second Clinical Medical College，Anhui Medical University，Hefei 230032；
2Dept of Urology，Peking University Shenzhen Hospital，Shenzhen 518036；3Guangdong and
Shenzhen Key Laboratory of Male Reproductive Medicine and Genetics，Shenzhen 518036）

Objective To detect the expression level of long non-coding RNA（lncRNA）PANDAR in paired renal cell carcinoma（RCC）and normal tissues and explore PANDAR's clinical significance in renal cell carcinoma. Methods Total RNA was isolated from 48 paired tissues，and the total RNA was used to get cDNA by performing reverse transcription.Then real time quantitative PCR（RT-qPCR）was performed to detect the expression of PANDAR.Statistical analysis was performed to explore the differences of PANDAR's expression level and the relationships between the expression of PANDAR and clinical characteristics.Results The expression level of lncRNA PANDAR was significantly lower in RCC tissues（P＜0.001）than paired normal tissues and PANDAR was downregulated in 38（79.17%）RCC tissues.The results showed that the expression of PANDAR was associated with the TNM and AJCC stage.However，no relationships were found between the expression of PANDAR and patients'age，sex and pathological types of RCC.Overall survival rate of patients with lower expression of PANDAR was significantly lower than patients with higher expression of PANDAR（P＜0.05）.Conclusion In RCC tissues PANDAR is down-regulated，and the expression of PANDAR is associated with prognosis，TNM and AJCC stage of RCC，which indicates that it may be involved in the tumorigenesis and development of RCC.

renal cell carcinoma；neoplasm staging；lncRNAs；PANDAR

R 737.11

A

1000-1492（2016）09-1342-04

時間：2016-8-1 14：07

http：//www.cnki.net/kcms/detail/34.1065.R.20160801.1407.048.html

2016-05-04接收

國家自然科學基金（編號：81101922）；深圳市科技研發資 金知識創新計劃基礎研究項目 （編號：JCYJ20150403091443304）；廣東省重點醫學專科經費

1安徽醫科大學第二臨床醫學院，合肥 2300322北京大學深圳醫院泌尿外科，深圳 5180363廣東省男性生殖與遺傳重點實驗室，深圳 518036

金 露，男，碩士研究生； 來永慶，男，副教授，主任醫師，碩士生導師，責任作者，E- mail：yqlord@163.com