高溫和鹽脅迫下硅對辣椒CaMADS-box基因表達的影響

魏小春,李 艷,姚秋菊,原玉香,趙艷艷,王志勇,姜 俊,段俊枝,蔣武生,張曉偉

(1.河南省農業科學院 園藝研究所,河南 鄭州 450002;2.駐馬店市農業科學院,河南 駐馬店 463000;3.河南省農業科學院 農業經濟與信息研究所,河南 鄭州 450002)

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高溫和鹽脅迫下硅對辣椒CaMADS-box基因表達的影響

魏小春1,李 艷2,姚秋菊1,原玉香1,趙艷艷1,王志勇1,姜 俊2,段俊枝3,蔣武生1,張曉偉1

(1.河南省農業科學院 園藝研究所,河南 鄭州 450002;2.駐馬店市農業科學院,河南 駐馬店 463000;3.河南省農業科學院 農業經濟與信息研究所,河南 鄭州 450002)

為了探索非生物脅迫下硅對辣椒CaMADS-box基因表達的影響,以豫椒101為材料,在對辣椒CaMADS-box基因片段同源克隆的基礎上,對其編碼的部分蛋白進行氨基酸同源性分析、理化性質預測、亞細胞定位預測和進化樹分析,探討了硅處理后辣椒CaMADS-box基因在高溫脅迫、鹽脅迫下表達量的變化,結果表明,克隆得到的CaMADS-box基因所編碼的蛋白為親水性蛋白,含有MADS結構域,屬于MADS基因家族,亞細胞定位在細胞核中,分子進化樹表明其與茄屬和煙草屬親緣關系最近,相似性達到67%。熒光定量分析表明,CaMADS-box基因在高溫脅迫和鹽脅迫后表達量都呈現出先升高后下降的模式,高溫脅迫下48 h達到峰值,而鹽脅迫在24 h達到峰值,硅處理能夠誘導CaMADS-box基因表達,在高溫脅迫和鹽脅迫下都在12 h達到高峰值,這表明CaMADS-box是一個硅快速響應基因,推測硅處理在緩解辣椒高溫脅迫和鹽脅迫等非生物脅迫方面具有重要作用。

硅;辣椒;CaMADS-box基因;非生物脅迫;表達分析

辣椒(CapsicumannuumL.),是原產于中拉丁美洲熱帶地區的大眾化蔬菜,在中國的種植面積居世界首位。MADS-box是一個保守性很強的DNA結合結構域,由于其最早在酵母MCM1基因、擬南芥AG基因、金魚草DEF基因和人類血清應答因子SRF基因中發現,取這4個基因的首字母縮寫,具有此結構的功能基因被命名為MADS-box基因[1]。MADS-box轉錄因子在真核生物中廣泛參與各種重要的生命活動,比如:生物生長發育、信號傳導及抗性調節等[2-4]。在植物中除參與花器官發育與形成的調節,還參與諸如根和葉的生長、果實的發育與成熟和各種脅迫應答反應等[5-9]。

硅作為植物生長發育的有益元素,不僅可以促進作物生長,而且可以通過提高作物過氧化物酶、過氧化氫酶、超氧化物歧化酶等保護酶的活性來提高作物抗性,緩解鎘、鋁、錳等重金屬對作物的毒害,最終提高作物的質量和產量[10]。目前有關硅對辣椒MADS-box轉錄因子在非生物脅迫下表達分析的研究還未見報道。為此,本研究以豫椒101為試驗材料,根據辣椒基因組數據庫中MADS-box基因的序列在5′UTR及3′UTR設計引物,克隆辣椒CaMADS-box基因,經相關生物信息學軟件對其編碼蛋白進行序列分析、亞細胞定位、系統進化樹分析和實時熒光定量表達研究,并探討辣椒CaMADS-box轉錄因子高溫和鹽脅迫下硅處理對其表達的影響,以期闡明該基因的功能,為進一步研究硅在緩解辣椒高溫和鹽脅迫方面提供理論依據。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

豫椒101由河南省農業科學院園藝研究所蔬菜育種課題繁育。完全營養液為Hoagland配方。基質包含有機質、速效氮、速效鉀、速效磷、有效硅等,含量分別為219.0，1.8，1.7，0.1，53.3 g/kg,pH 值5.5。

1.2 試驗方法

1.2.1 辣椒苗的準備 供試辣椒種子用紗布包好,先在55 ℃的熱水中溫湯浸種20 min,然后室溫條件下充分吸水6～8 h,播于營養缽(6 cm×8 cm),每穴1～2粒種子。待子葉出土即放于光照強度為300～600 μmol/(m2·s)的人工氣候箱內培養,生長溫度控制在25 ℃/18 ℃(晝/夜) 。出苗后澆1/2 營養液,每缽留壯苗1棵,長至4葉1心時轉苗至大營養缽(10 cm×10 cm)。當幼苗第5片真葉展開時移入人工氣候箱進行處理。1.2.2 材料處理 高溫脅迫處理:當植株6～8片真葉展平時,將穴盤放入預先升溫到45 ℃的光照培養箱內(光照強度為160 μmol/(m2·s))進行高溫處理。高溫處理方法如下,定植8 d 后,置于溫度為(45±2)℃(晝)/(35±2)℃(夜)、光強為60 mmol/(m2·s)、光周期為12 h/12 h的培養箱進行高溫處理。高溫脅迫下的硅處理:高溫脅迫處理同上,設置1 CK(不加硅、不高溫處理);2 高溫,(45±2)℃(晝)/(35±2)℃(夜);3 加硅、加高溫(K2SiO31.5 mmol/L+(45±2)℃(晝)/(35±2)℃(夜)) 3 個處理,每個處理重復3次,每個重復9 株。不加硅處理中加入1.0 mmol/L的K2SO4溶液,以平衡鉀離子。鹽脅迫處理:當植株6～8片真葉展平時,設置1 CK(不加氯化鈉);2 加氯化鈉(NaCl 150 mmol/L)2個處理,每個處理重復3次,每個重復9 株。鹽脅迫下的硅處理:鹽脅迫處理同上,設置1 CK(不加硅不加氯化鈉);2 加氯化鈉(NaCl 150 mmol/L);3 加硅加氯化鈉(K2SiO31.5mmol/L+NaCl 150 mmol/L) 3 個處理,每個處理重復3次,每個重復9 株。不加硅處理中加入1.0 mmol/L的K2SO4溶液,以平衡鉀離子。

每處理27株,處理時間為0，6，12，24，48，96 h。未處理材料為對照。取樣后立即浸入液氮中,并放入-80 ℃超低溫冰箱保存。

1.2.3 辣椒總RNA提取和cDNA合成 總RNA的提取采用TRIzol法(USA)。

cDNA合成采用Thermo Scientific公司cDNA合成試劑盒RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit。

1.2.4MADS-box基因cDNA全長克隆 根據辣椒基因組數據庫(http://peppergenome.snu.ac.kr/)中MADS-box基因(CA08g07400)的序列在5′UTR及3′UTR設計引物(表1),委托Invitrogen生物工程技術服務有限公司合成。以cDNA第1鏈為模板,用MADS-box基因引物進行PCR擴增。PCR反應條件為:95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，57 ℃ 1 min，72 ℃ 2 min,共35個循環；最后72 ℃延伸10 min。

表1 引物序列信息

PCR反應產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后回收,回收片段與PMD19-T載體(TaKaRa公司)連接,熱擊法轉化DH5α大腸桿菌感受態細胞,挑選陽性單克隆送公司測序,得到目的片段序列。Marker DL2000購自北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司。

1.3 序列分析

利用ClustalX2 軟件對克隆的CaMADS-Box基因的核苷酸和氨基酸序列與其他物種的對應序列進行比對分析;根據所得的cDNA序列,對基因所編碼的氨基酸蛋白進行同源序列比對,并結合MEGA 4.0構建進化樹;利用軟件ProtParam(/)對CaMADS-Box基因編碼的氨基酸組分、分子量和等電點進行分析;利用軟件ProtScale(http://web.expasy.org/protscale/)分析氨基酸序列的親/疏水性;利用軟件SOPMA(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/secpred_sopma.pl)對蛋白質二級結構進行預測;利用軟件BaCelLo(http://gpcr2.biocomp.unibo.it/bacello/pred.htm)進行亞細胞定位的預測。

1.4 實時熒光定量分析

對各個處理后的辣椒葉片提取總RNA,并反轉錄為第1鏈cDNA(TaKaRa反轉錄試劑盒PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser)。儀器為羅氏公司LightCycler? 96實時熒光定量PCR儀。反應體系為20.0 μL,含有10.0 μL 2×SYBR? Premix ExTaqTM(Tli RNaseH Plus),2.0 μL cDNA,上下游引物(q-MADS-boxF及q-MADS-boxR)各1 μL(引物濃度10 μmol/L)(表1),6 μL ddH2O。運行程序為:95 ℃預變性30 s；95 ℃變性5 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s,40 次循環；72 ℃延伸60 s。每個樣品3 次重復。

以Actin基因為內參,引物用cACTINF228和cACTINR384;MADS-box基因片段為目的片段,擴增引物為qMADSF166和qMADSR364。采用2-ΔΔCT法計算基因相對表達量[11]。

2 結果與分析

2.1 辣椒CaMADS-box基因的克隆

以辣椒cDNA第1條鏈為模板,用引物MADS-box-F/MADS-box-R擴增出700 bp左右的目的片段(圖1),將目的片段回收后連接轉化,挑取陽性克隆用引物檢測后測序。測序結果顯示該片段與辣椒基因組數據庫中目的片段完全一致,大小為690 bp,該基因從起始密碼ATG到終止密碼TAG具有一個完整的ORF為444 bp,編碼147個氨基酸,命名為CaMADS-box。

M.DL2000。

2.2 辣椒CaMADS-box基因氨基酸序列同源性分析

辣椒CaMADS-box基因所編碼的蛋白質中含有MADS基因家族保守結構域之一MADS區。應用Clustalx-2.1軟件進行多重比對,將辣椒CaMADS-box基因編碼的氨基酸序列與其他物種的MADS-box基因編碼的氨基酸序列進行比對。比對結果表明,辣椒CaMADS-box氨基酸與其他作物MADS-box氨基酸有高度的相似性,屬于MADS-box家族(圖2)。

2.3 辣椒CaMADS-box蛋白理化性質的預測

利用軟件預測辣椒CaMADS-box氨基酸的蛋白質分子質量為16.634 kDa,理論等電點為5.16,分子式為C720H1177N201O235S7。該蛋白質中含量最高的氨基酸為Glu,相對含量達到了14.3%,含量較低的氨基酸有Cys和Tyr,含量僅為0.7%,不含有Pyl、Trp和Sec。其脂肪系數為71.56,其疏水性平均值為-0.727,說明該蛋白為親水性蛋白。

2.4 辣椒CaMADS-box蛋白亞細胞定位預測

利用BaCelLo軟件對辣椒CaMADS-box氨基酸進行亞細胞定位的預測,結果表明其定位在細胞核中(圖3)。

圖2 辣椒CaMADS-box氨基酸序列與其他作物MADS-box氨基酸序列比對

圖3 辣椒CaMADS-box蛋白亞細胞定位預測

蛋白質的多肽鏈通過折疊、螺旋、卷曲等二級結構的作用形成比較穩定的空間結構,利用軟件分析MADS-box的二級結構,發現多個氨基酸參與α-螺旋、無規則卷曲和延伸鏈的二級結構,其中α-螺旋、延伸鏈、β-折疊和無規則卷曲分別占50.34%,17.69%,4.08%,27.89%(圖4)。這4個結構是構成MADS-box蛋白的基本結構。

h.α-螺旋；e.延伸鏈；t.β-折疊；c.無規則卷曲。

采用ProtScale 對MADS-box蛋白質的疏水性進行分析(圖5),整體來看,親水性氨基酸和疏水性氨基酸在整個蛋白質中分布均勻,無明顯的疏水區。

2.5 辣椒CaMADS-box蛋白進化樹分析

使用NCBI中BlastP工具對辣椒CaMADS-box氨基酸序列進行同源性檢索,對檢索到的數據再利用MEGA 4.0軟件構建系統進化樹。結果表明,辣椒CaMADS-box與茄屬和煙草屬親緣關系最近,相似性達到67%。而與葡萄屬及大豆等親緣關系較遠(圖6)。

圖5 辣椒CaMADS-box氨基酸疏水性預測

2.6 辣椒CaMADS-box基因在非生物脅迫下的表達分析

表達分析表明,CaMADS-box基因在高溫脅迫后表達量逐漸升高后下降,在6 h時表達量達到6.5倍,48 h時達到峰值,為對照的12.6倍(圖7-A);高溫脅迫下,CaMADS-box基因在硅處理0 h較高,6 h時表達量降低,在12 h時回升,隨后隨著處理時間的延長后逐漸降低(圖7-B);CaMADS-box基因在鹽脅迫后表達量逐漸升高后下降,在6 h時表達量達到2.5倍,24 h時達到峰值,為對照的3.9倍(圖7-C);鹽脅迫下,CaMADS-box基因在硅處理6 h后表達量緩慢降低,在12 h時迅速升高達到峰值,為對照的5.8倍,24 h后迅速恢復正常(圖7-D)。

圖6 辣椒及其他物種MADS-box蛋白進化樹分析

3 結論和討論

植物MADS-box基因在植物的生長發育過程中發揮著重要的調節作用,迄今為止,已經在植物中發現數以百計的MADS-box基因,該基因通過與其他基因相互作用形成蛋白二聚體或者多聚復合物,進而調控植物的生長發育。

本研究對克隆得到的CaMADS-box基因進行分析,結果表明,其編碼蛋白為親水性蛋白,含有MADS結構域,屬于MADS基因家族,亞細胞定位在細胞核中,分子進化樹表明與茄屬和煙草屬親緣關系最近。熒光定量分析表明,CaMADS-box基因在高溫脅迫和鹽脅迫后表達量都呈現出先升高后下降的模式,不同的是高溫脅迫下48 h時達到峰值,而鹽脅迫在24 h時達到峰值,硅處理能夠誘導CaMADS-box基因表達,在高溫脅迫和鹽脅迫下都在12 h到達表達高峰。

植物MADS-box基因功能的研究,在最開始主要集中在對花器官形成的作用上,例如:花器官從營養到生殖生長過程的轉換，其對光周期的敏感性、開花時間、花粉的發育等[12-15]。研究結果表明,MADS-box轉錄因子除對花器官具有調節作用外,還廣泛參與植物生長發育的各個方面,如頂端分生組織的分化、根的生長發育、果實的發育、光合作用和營養代謝、激素信號轉導及響應脅迫應答等[16-21]。

A.高溫脅迫處理;B.高溫脅迫下的硅處理;C.鹽脅迫處理;D.鹽脅迫下的硅處理。

研究表明,在鹽脅迫及甘露醇脅迫下,玉米ZmMADS-box基因明顯呈現上調趨勢[22]。對水稻花期MADS-box基因研究表明，熱處理(35～39 ℃)下，OsMADS87基因變化明顯，進一步研究表明該基因與胚發育及種子大小有關[23]。對大白菜高豐度表達的BrMADS-box基因進行干旱及鹽脅迫處理后發現,分別有8，6個BrMADS-box基因上調[24]。這說明MADS-box基因不僅在植物花發育過程中起著重要作用,在逆境脅迫中相應也發揮作用。

硅是植物生長的有益元素,特別是它在植物遭受非生物脅迫和生物脅迫時起重要的抗性或對逆境的緩解作用。目前,有關硅在植物遭受非生物脅迫時對MADS-box基因表達變化的研究還比較少。本研究通過辣椒CaMADS-box基因遭受高溫脅迫和鹽脅迫的熒光定量分析發現,CaMADS-box基因在高溫脅迫和鹽脅迫后表達量都呈現出先升高后下降的模式,硅處理能夠誘導CaMADS-box基因提前到達表達高峰,這表明CaMADS-box是一個硅快速響應基因,辣椒硅處理在緩解辣椒高溫脅迫和鹽脅迫等非生物脅迫方面具有重要作用。

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The Effect of Silicon on PepperCaMADS-boxGene Expression under Heat and Salt Stress Analysis

WEI Xiaochun1,LI Yan2,YAO Qiuju1,YUAN Yuxiang1,ZHAO Yanyan1,WANG Zhiyong1,JIANG Jun2,DUAN Junzhi3,JIANG Wusheng1,ZHANG Xiaowei1

(1.Institute of Horticulture,Henan Academy of Agricultural Sciences,Zhengzhou 450002,China;2.Zhu ma dian Institute of Agricultural Sciences,Zhumadian 463000,China;3.Institute of Agricultural Economy and Information,Henan Academy of Agricultural Sciences,Zhengzhou 450002,China)

In order to study the influence of silicon on the expression of pepperCaMADS-boxgene under abiotic stress,such as the high temperature and salt stress,we used pepper 101 as experimental materials,the physical and chemical properties of encoding protein was analyzed,phylogenetic tree was constructed,subcellular localization was predicted through bioinformatics software on the base of the cloning of pepperCaMADS-boxgene.The results showed that the cloned gene encoding protein CaMADS-box was hydrophilic protein,containing MADS domain structure,belonged to MADS gene families.And its subcellular localization was in the nucleus,the molecular evolutionary tree showed that close to Nicotiana,the similarity was 67%.Fluorescence quantitative analysis showed thatCaMADS-boxgene expression after high temperature stress and salt stress were presented first rise after the fall of the model, the difference was to peak at 48 h, under high temperature stress, salt stress peak at 24 h, silicon handle could induce gene expressionCaMADS-box, under high temperature stress and salt stress were expressed at 12 h to reach peak, which suggested thatCaMADS-boxwas a silicon quick response genes, speculated that the silicon handle in alleviating pepper abiotic stress such as high temperature and salt stress plays an important role.

Silicon;CapsicumannuumL.;CaMADS-boxgene;Abiotic stress;Expression analysis

2016-07-08

國家大宗蔬菜產業技術體系豫北綜合試驗站項目(CARS-25-G-27)；農業部黃淮地區(河南)蔬菜科學觀測實驗站(10205020)；河南省重大科技專項(151100110400)

魏小春(1983-),男,河南項城人,助理研究員,博士,主要從事植物生理與分子生物學研究。

張曉偉(1965-),男,河南平輿人,研究員,碩士，主要從事蔬菜育種與分子生物學研究。

Q78

A

1000-7091(2016)05-0007-07

10.7668/hbnxb.2016.05.002