肝片吸蟲Fh8明顯增強STEC的Stx1可溶性表達(dá)及Stx1單克隆抗體制備

張雪寒,張碧成,張 強,汪 偉,何孔旺

(江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 獸醫(yī)研究所,農(nóng)業(yè)部獸用生物制品工程技術(shù)重點實驗室,國家獸用生物制品工程技術(shù)研究中心,江蘇 南京 210014)

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肝片吸蟲Fh8明顯增強STEC的Stx1可溶性表達(dá)及Stx1單克隆抗體制備

張雪寒,張碧成,張 強,汪 偉,何孔旺

(江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 獸醫(yī)研究所,農(nóng)業(yè)部獸用生物制品工程技術(shù)重點實驗室,國家獸用生物制品工程技術(shù)研究中心,江蘇 南京 210014)

志賀毒素1(Shiga toxin 1,Stx1),系五聚體蛋白,是產(chǎn)志賀毒素性大腸桿菌(Shiga Toxin-producingEscherichiacoli,STEC)主要的毒素因子,但Stx1體外極不易可溶性表達(dá),旨在克隆和表達(dá)志賀毒素1(Shiga toxin 1,Stx1)A亞基,體外獲得可溶性表達(dá)的Stx1,以研制單克隆抗體。生物信息學(xué)軟件分析Stx1A亞基氨基酸序列,Stx1A1亞基N端為信號肽段,其C端高疏水性和低免疫原性。PCR擴(kuò)增stx1A亞基73～759的687個核苷酸,與肝片吸蟲Fh8基因串聯(lián),克隆到低溫表達(dá)載體pCold Ⅰ 以構(gòu)建重組菌,誘導(dǎo)表達(dá)重組毒素His-Fh8-Stx1A,SDS-PAGE分析蛋白表達(dá)形式。重組毒素His-Fh8-Stx1A免疫Balb/c小鼠,Sp2/0細(xì)胞融合篩選、制備陽性雜交瘤和單克隆抗體。PCR擴(kuò)增Fh8和stx1a亞基并構(gòu)建重組質(zhì)粒pCold Ⅰ-His-Fh8-stx1,重組蛋白在原核細(xì)胞中得到高效表達(dá),且以可溶性形式存在于菌體胞漿中。以重組His-Fh8-Stx1A為免疫原,成功制備3株能穩(wěn)定傳代并分泌Stx1的單克隆抗體(McAb)的雜交瘤細(xì)胞株,取其中1株成功制備高ELISA效價的腹水。Western Blot顯示,純化的單克隆抗體可與重組免疫原His-Stx1A和天然志賀毒素1發(fā)生特異性反應(yīng)。本試驗成功可溶性表達(dá)志賀毒素1A亞基,并獲得多株單克隆抗體,為研制用于檢測STEC的夾心ELISA和膠體金試紙條奠定理論基礎(chǔ)。

產(chǎn)志賀毒素大腸桿菌;志賀毒素1;肝片吸蟲;Fh8;可溶性表達(dá);單克隆抗體

志賀毒素屬于1個定義的蛋白亞家族,即RNA N-糖苷酶,又分為2種:Shiga toxin(Stx 1) 和Stx 2[1]。Stxs是典型的AB模式蛋白毒素,完整的毒素由1個A亞單位(32 kDa)和5個B亞單位(7.7 kDa單聚體)組成[2]。A亞單位具有毒素生化活性,由A1(28 kDa)和A2(4 kDa)2個部分通過二硫鍵連接,B亞單位是受體結(jié)合蛋白,介導(dǎo)與靶細(xì)胞膜受體特異性結(jié)合,致使毒素分子內(nèi)化,其靶細(xì)胞主要為腸黏膜細(xì)胞、血管上皮細(xì)胞、腎和神經(jīng)組織細(xì)胞等[3-5]。

1977年Konowalchuk等[6]首次在大腸桿菌中發(fā)現(xiàn)Stxs以來,經(jīng)歷了30余年的研究,致力于研究預(yù)防性疫苗和治療性制劑保護(hù)人類免于毒素的危害,但目前仍然缺乏有效預(yù)防、治療和檢測手段。現(xiàn)有報道多以StxB為研究靶標(biāo)[7-10],研制抗體和毒素疫苗,而A亞單位因具有毒素生化活性,體外極不易表達(dá)成功,表達(dá)量極低,成為研究領(lǐng)域里的瓶頸。

Fh8是肝片吸蟲在感染早期分泌的蛋白,因其分子量為8 kDa,故命名為Fh8[11-13]。Fh8融合標(biāo)簽是高效的蛋白可溶性表達(dá)增強子,它的分子量小,相比現(xiàn)有的大融合標(biāo)簽具有先天優(yōu)勢。本試驗擬將Fh8與Stx1A融合表達(dá),以期獲得可溶性蛋白,免疫小鼠,制備高滴度單克隆抗體,為研制志賀毒素檢測技術(shù)和致病機(jī)制奠定基礎(chǔ)理論數(shù)據(jù)。

1 材料和方法

1.1 菌株、質(zhì)粒和試劑

大腸桿菌O157:H7(Stx1+ Stx2+)、O26(Stx1+)、O111(Stx2+)、O113(Stx2+)、O145(Stx1+ Stx2+)、O139(Stx2e+)、O138(Stx2e+)、O141(Stx1-Stx2-)、F4(Stx1-Stx2-)、F5(Stx1-Stx2-)、F6(Stx1-Stx2-)、BL21(Stx1-Stx2-)和DH5α(Stx1-Stx2-),以及不同種屬的其他易混淆病原菌,金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus,SA)、鼠傷寒沙門氏菌(Salmonellatyphimurium,ST)、鏈球菌(Streptococcussuis,SS),均由江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院獸醫(yī)研究所保存;BL21(DE3)/pColdⅠ-stx1和BL21(DE3)/pET42a-stx1,均由江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院獸醫(yī)研究所前期自行構(gòu)建;質(zhì)粒pUC57-Fh8、pColdⅠ(AmpR)、志賀毒素1(Stx1)粗提物,由江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院獸醫(yī)研究所保存;PEG4000、HAT、HT、DMSO,購自Sigma 公司;DMEM、小牛血清,Gibco公司;HRP羊抗鼠-IgG,購自博士德生物技術(shù)公司;明膠,購自Sunshine公司;His-Bind Purification Kit,購自Novagen公司;Protein A IgG Purification Kit購自美國Pierce公司;預(yù)染蛋白標(biāo)準(zhǔn)品(BlueRay Prestained Protein Ladder),購自GeneDirex公司。

1.2 細(xì)胞和動物

骨髓瘤細(xì)胞Sp2/0,由江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院獸醫(yī)研究所保存;Balb/c小鼠,由揚州大學(xué)醫(yī)學(xué)中心提供。

1.3 引物設(shè)計

根據(jù)肝片吸蟲Fh8基因序列(GenBank 登錄號:AF213970)和STEC O157∶H7志賀毒素1基因序列(GenBank 登錄號:AY633473.1),分別設(shè)計引物,擴(kuò)增Fh8全長和stx1亞基73～759核苷酸片段,下劃線顯示酶切位點,引物序列如下:

Fh8-F:5-AGGCATATGATGCCTAGTGTTCAAGA G-3NdeⅠ,

Fh8-R:5-TGTGTCGACTGATGACAAAATCGAA AC-3XhoⅠ;

stx1-AF:5-CGCGAATTCTTTACCTTAGACTTC-3XhoⅠ,

stx1-AR:5-GTTGTCGACTGCATTAATGCTTCC-3SalⅠ。

1.4 重組菌構(gòu)建和蛋白表達(dá)

1.4.1 重組菌的構(gòu)建 以pUC57-Fh8質(zhì)粒為模板,PCR擴(kuò)增Fh8全長基因,克隆入低溫表達(dá)質(zhì)粒 pColdⅠ;常規(guī)煮沸方法制備STEC O157∶H7模板,PCR擴(kuò)增stx1截短基因片段,克隆到Fh8基因之后,構(gòu)建Fh8-stx1融合基因,轉(zhuǎn)化宿主菌BL21(DE3),構(gòu)建重組菌BL21(DE3)/pColdⅠ-Fh8-stx1。

1.4.2 重組蛋白的表達(dá) 陽性重組菌BL21(DE3)/pColdⅠ-Fh8-stx1過夜培養(yǎng)物,按照2%比例接種LB液體培養(yǎng)基,37 ℃振搖培養(yǎng)2 h(OD600=0.4),加入IPTG,終濃度為0.1 mmol/L,16 ℃繼續(xù)培養(yǎng)9 h。BL21(DE3)/pET42a-stx1和BL21(DE3)/pColdⅠ-stx1菌種,37 ℃過夜培養(yǎng),按照2%比例接種LB液體培養(yǎng)基,37℃振搖培養(yǎng)2 h(OD600=0.4),加入IPTG,終濃度為0.1 mmol/L,30 ℃繼續(xù)培養(yǎng)5 h。離心收集細(xì)菌培養(yǎng)物,PBS緩沖液重懸菌泥,超聲波破碎裂解(功率55%,20 min),12 000 r/min離心10 min,分別收集菌體上清和沉淀,SDS-PAGE分析重組蛋白表達(dá)情況。

1.5 單克隆抗體制備和鑒定

1.5.1 蛋白純化 按照1.4.2中方法誘導(dǎo)重組蛋白,參照 His·BindTMResin 親和層析柱操作說明,純化超聲波菌體上清,獲得高純度可溶性重組蛋白,分子量33 kDa。

1.5.2 小鼠免疫 選用5只6周齡的雄性Balb/c小鼠進(jìn)行免疫,首次腹腔注射等量弗氏完全佐劑乳化的抗原50 μg/只,14 d后腹腔注射弗氏不完全佐劑乳化的等量抗原,再間隔14 d,以等量抗原腹腔注射,當(dāng)小鼠血清效價達(dá)到1∶10 000以上時,常規(guī)方法進(jìn)行細(xì)胞融合,間接ELISA方法篩選雜交瘤細(xì)胞和亞克隆,陽性抗體雜交瘤細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng),腹腔注射Balb/c小鼠,10 d后,腹圍極度膨脹時,取腹水,檢測其ELISA反應(yīng)效價,-20 ℃ 保存。

1.5.3 腹水效價測定和純化 將重組蛋白His-Fh8-Stx1調(diào)整為2 μg/mL 的抗原溶液加入到96 孔ELISA板中,100 μL/孔,4 ℃孵育過夜。將腹水1∶1 000、1∶2 000、1∶4 000、1∶8 000,1∶16 000、1∶32 000、1∶64 000,1∶128 000、1∶256 000、1∶512 000、1∶1 024 000和1∶2 048 000倍比稀釋,100 μL/孔。HRP-羊抗小鼠IgG 1∶20 000稀釋,間接ELISA檢測,測定OD450吸光值。當(dāng)比值(陽性孔/陰性孔)≥2.1時的最大稀釋倍數(shù)的倒數(shù)即為抗體滴度(表1)。收集小鼠腹水,參照Protein A IgG Purification Kit(Pierce公司,美國)進(jìn)行抗體純化。

1.5.4 單克隆抗體特異性 檢測受試菌株包括不同血清型大腸桿菌以及不同種屬的其他易混淆病原菌。上述菌株培養(yǎng)后,12 000 r/min離心5 min,0.01 mol/L PBS重懸,調(diào)整菌液濃度為1×106cfu/mL,超聲破碎(功率50%,2 min),12 000 r/min離心10 min,上清用于包被ELISA板,包被濃度為1 μg/mL,小鼠腹水1∶2 000稀釋,間接ELISA測定OD450吸光值。

1.6 Western Blot檢測

志賀毒素1(Stx1)粗提物和重組蛋白Fh8-Stx1A進(jìn)行SDS-PAGE分析,單克隆抗體1∶1 000倍稀釋作為一抗,HRP-羊抗小鼠IgG為二抗,ECL顯色分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 重組菌構(gòu)建和蛋白表達(dá)

依次將肝片吸蟲Fh8全基因和截短的stx1基因A亞基75～759之間687個核苷酸克隆入低溫表達(dá)質(zhì)粒 pColdⅠ,構(gòu)建重組質(zhì)粒,NdeⅠ和SalⅠ雙酶切,可見896 bp的融合基因片段(圖1)。

M.DNA 標(biāo)準(zhǔn);1～3.陽性重組質(zhì)粒pColdⅠ-Fh8-stx1。

雙酶切鑒定正確的重組質(zhì)粒pColdⅠ-Fh8-stx1,轉(zhuǎn)化宿主菌BL21(DE3),獲得重組菌BL21(DE3)/pColdⅠ-Fh8-stx1,IPTG誘導(dǎo)9 h,SDS-PAGE顯示重組蛋白以可溶性形式存在于菌體胞漿,分子量33 kDa(圖2)。BL21(DE3)/pET42a-stx1(圖3)和BL21(DE3)/pColdⅠ-stx1(圖4)表達(dá)重組蛋白以包涵體形式存在于菌體沉淀中,為非可溶性蛋白,分子量分別為53,25 kDa。

M.蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn);1.重組菌BL21/pCold Ⅰ-Fh8-stx1 誘導(dǎo)后的全菌裂解物;2.重組菌BL21/pCold Ⅰ-Fh8-stx1誘導(dǎo)后全菌裂解物的上清;3.重組菌 BL21/pCold Ⅰ-Fh8-stx1誘導(dǎo)后全菌裂解物的沉淀;4.重組菌BL21/pCold Ⅰ-Fh8-stx1誘導(dǎo)前全菌裂解物。

M.Protein Ladder;1.Whole-cell lysate of BL21/pCold Ⅰ-Fh8-stx1 after induction by IPTG;2.Supernatants from whole-cell lysate of BL21/pCold Ⅰ-Fh8-stx1 after induction by IPTG;3.Pellets from whole-cell lysate of BL21/pCold Ⅰ-Fh8-stx1 induction by IPTG;4.Whole-cell lysate of BL21/pCold Ⅰ-Fh8-stx1 before induction by IPTG.

圖2 SDS-PAGE分析重組菌BL21/pColdⅠ-Fh8-stx1蛋白表達(dá)

Fig.2 SDS-PAGE analysis of recombinant protein expression in BL21/pCold Ⅰ-Fh8-stx1

2.2 單克隆抗體檢測

2.2.1 抗體滴度 經(jīng)融合獲得3株單克隆抗體,分別為4D8、2B7和4B9,選取2B7接種小鼠制備腹水,當(dāng)腹水1∶512 000稀釋時,P/N=3.67,抗體滴度為5.12×105(表1)。

M.蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn);1～2.重組菌 pET42a-stx1誘導(dǎo)前全菌裂解物;3.重組菌pET42a-stx1 誘導(dǎo)后全菌裂解物的沉淀;4.重組菌 pET42a-stx1 誘導(dǎo)后全菌裂解物的上清;5.重組菌 pET42a-stx1誘導(dǎo)后全菌裂解物。

M.Protein Ladder;1-2.Whole-cell lysate of pET42a-stx1 before induction by IPTG;3.Pellets from whole-cell lysate of pET42a-stx1 after induction by IPTG;4.Supernatants from whole-cell lysate of pET42a-stx1 after induction by IPTG;5.Whole-cell lysate of pET42a-stx1 after induction by IPTG.

圖3 SDS-PAGE分析重組菌BL21/pET42a-stx1蛋白表達(dá)

Fig.3 SDS-PAGE analysis of recombinant protein expression in BL21/pET42a-stx1

M.蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn);1～2.重組菌 BL21/pCold Ⅰ-stx1誘導(dǎo)前全菌裂解物;3.重組菌BL21/pCold Ⅰ-stx1誘導(dǎo)后全菌裂解物的沉淀;4.重組菌 BL21/pCold Ⅰ-stx1誘導(dǎo)后全菌裂解物的上清。

M.Protein Ladder;1-2.Whole-cell lysate of BL21/pCold Ⅰ-stx1 before induction by IPTG;3.Pellets from whole-cell lysate of BL21/pCold Ⅰ-stx1 after induction by IPTG;4.Supernatants from whole-cell lysate of BL21/pCold Ⅰ-stx1 after induction by IPTG.

圖4 SDS-PAGE分析重組菌BL21/pCold Ⅰ-stx1蛋白表達(dá)

2.2.2 抗體純化 小鼠腹水經(jīng)純化后,SDS-PAGE顯示55,25 kDa的重鏈和輕鏈(圖5)。

M.蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn);1.純化的小鼠腹水。

圖6 單抗特異性分析

2.2.3 抗體特異性 大腸桿菌O157∶H7(Stx1+ Stx2+)、O26(Stx1+)、O145(Stx1+ Stx2+)OD450均明顯高于其他菌株(圖6)。

2.2.4 Western Blot 檢測 單克隆抗體與志賀毒素1(Stx1)粗提物和重組Fh8-Stx1a反應(yīng)良好,均出現(xiàn)預(yù)期條帶,分別為25,33 kDa(圖7)。

3 討論

產(chǎn)志賀毒素性大腸桿菌(Shiga toxin-producingEscherichiacoli,STEC) 是重要的食源性病原菌之一,能夠?qū)е氯祟悋?yán)重的疾病,諸如出血性腸炎(Hemorrhagic enteritis,HC)和溶血尿毒綜合征(Hemolyticuremic syndrome,HUS)等,個別患者可因急性和慢性腎功能衰竭而死亡[5]。動物感染一般不引發(fā)明顯的臨床癥狀,但能夠長期甚至終生攜帶[14-15]。污染的肉品、奶制品以及蔬菜等食物是傳播STEC主要的媒介[16]。

M.蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn);1～2.純化蛋白Fh8-Stx1;

志賀毒素是STEC主要的致病因子,是由整合到細(xì)菌基因組中的溶源性噬菌體編碼,包含2個免疫學(xué)上沒有交叉反應(yīng)的型,分別為Stx1和Stx2[17]。盡管Stx1和Stx2蛋白晶體結(jié)構(gòu)具有較高的相似性,但A亞基和B亞基氨基酸水平的同源性僅為32%和27%[18],表明二者的生物學(xué)特性可能存在較大差異,對于它們檢測和防控也應(yīng)區(qū)別對待。根據(jù)毒素與宿主的親和力、細(xì)胞的毒性、動物的致病性以及對腸黏液激活的反應(yīng)性等,Stx1和Stx2又被人為地劃分為多個亞型,Stx1有Stx1a、Stx1c和Stx1d 3個亞型[19-20],而Stx2有Stx2a、Stx2b、Stx2c、Stx2d、Stx2e、Stx2f和Stx2g 7個亞型[21-22]。

目前,研制Stx1的單克隆抗體大多以Stx1B亞基為免疫原而獲得[7-10,23],表現(xiàn)出良好的有效性,但隨著更多亞型的涌現(xiàn),變異位點發(fā)生在A亞基,現(xiàn)有單克隆抗體不能加以區(qū)分。因此,本試驗選取A亞基毒素活性中心為免疫原,研制針對性的單克隆抗體,將特異的檢測各種優(yōu)勢的毒素亞型。

良好的免疫原是高質(zhì)量單克隆抗體的保障。在前期研究中,嘗試克隆全長stx1A基因到多個表達(dá)載體中,如pET42a、pET32a和低溫表達(dá)載體pCold I中,只有痕量包涵體表達(dá)。本試驗通過對stx1A氨基酸序列的分析,只擴(kuò)增A亞基的毒素活性中心基因片段,嘗試克隆入多個表達(dá)載體,蛋白表達(dá)量有明顯提高,但仍為非可溶性蛋白。Fh8肽段是肝片吸蟲感染早期分泌的蛋白,具有成為可溶性表達(dá)增強子的先天優(yōu)勢[11-13]。本試驗構(gòu)建Fh8-stx1A融合基因,克隆入低溫表達(dá)質(zhì)粒中,成功過表達(dá),并且為可溶性蛋白,解決了Stx1的體外表達(dá)難題。可溶性重組蛋白Fh8-Stx1A免疫小鼠,經(jīng)過1次融合,獲得3株高滴度單克隆株,其中2B7與Stx2無交叉反應(yīng),是Stx1特異性的單克隆抗體,為研制新的免疫檢測試劑奠定物質(zhì)基礎(chǔ)。

綜上所述,本試驗成功克隆和表達(dá)Stx1的A亞基毒素活性中心,借助Fh8融合標(biāo)簽,獲得可溶性蛋白,免疫小鼠,獲得高滴度且高特異性的單克隆抗體。

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Fasciolahepatica8 Significantly Enhances Soluble Expression of Stx1 from STEC and Stx1 Monoclonal Antibody Preparation

ZHANG Xuehan,ZHANG Bicheng,ZHANG Qiang,WANG Wei,HE Kongwang

(Institute of Veterinary Medicine,Jiangsu Academy of Agricultural Sciences,Key Laboratory of Engineering Research of Veterinary Bio-products of Agricultural Ministry,National Research Center of Veterinary Biologicals Engineering and Technology,Nanjing 210014,China)

Shiga toxin 1(Stx1),AB5 pentamers protein,is one of major virulent factors of Shiga Toxin-producingEscherichiacoli(STEC).The N-terminal fragment of Stx1A subunit encodes a signal peptide,and its C-terminal amino acid sequences presents high hydrophobicity and low immunogenicity by bioinformatics software analysis,and these features lead to expression failure and inclusion of target protein.In this study,our aim is to clonestx1 gene and express soluble protein for development of monoclonal antibodies against Stx1A.The 210 bp ofFh8 gene fromFasciolahepaticawas cloned into pCold Ⅰ withNdeⅠ andXhoⅠ,and the middle fragment between 73-759 ntofstx1Asubunit was amplified,fused withFh8 gene to construct recombinant strain of BL21(DE3)/pCold Ⅰ-Fh8-stx1.His-Fh8-stx1Awas immunized Balb/c mice to prepare positive hybridomas and monoclonal antibodies bySp2/0 cell fusion screening.We successfully constructed a recombinant plasmid pCold Ⅰ-Fh8-stx1a,expressed His-Fh8-Stx1A in prokaryotic cells in soluble form.Three stably secreting anti-Stx1A monoclonal antibodies(McAb) of hybridoma cell lines were developed,one of them was used to prepare high titer ascites.Western Blot assay showed ascites after purified are able to react with recombinant His-Fh8-Stx1A and Shiga toxin 1 crude extract.We successfully prepared soluble Stx1A protein with good antigenicity,and three monoclonal antibodies with high titers,these will lay substantial foundation for future study,i.e.developing sandwich ELISA and colloidal gold test strip to detect STEC.

Shiga toxin-producingEscherichiacoli;Shiga toxin 1;Fasciolahepatica;Fh8;Soluble expression;Monoclonal antibody

2016-07-26

國家自然科學(xué)基金項目(31572503);江蘇省自主創(chuàng)新資金項目(CX(15)1060)

張雪寒(1977-),女,河北高碑店人,副研究員,博士,碩士生導(dǎo)師,主要從事食源性病原微生物風(fēng)險評估和防控技術(shù)研究。

Q78

A

1000-7091(2016)05-0044-06

10.7668/hbnxb.2016.05.007