轉(zhuǎn)大豆GmPRP和SbPRP基因煙草對(duì)非生物脅迫耐受能力分析

翟 瑩,張 軍,趙 艷

(1.齊齊哈爾大學(xué) 生命科學(xué)與農(nóng)林學(xué)院,黑龍江 齊齊哈爾 161006;2.黑龍江省獸醫(yī)科學(xué)研究所,黑龍江 齊齊哈爾 161005)

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轉(zhuǎn)大豆GmPRP和SbPRP基因煙草對(duì)非生物脅迫耐受能力分析

翟 瑩1,張 軍2,趙 艷1

(1.齊齊哈爾大學(xué) 生命科學(xué)與農(nóng)林學(xué)院,黑龍江 齊齊哈爾 161006;2.黑龍江省獸醫(yī)科學(xué)研究所,黑龍江 齊齊哈爾 161005)

為實(shí)現(xiàn)PRPs基因在植物抗逆基因工程中的應(yīng)用,將大豆中的2個(gè)脯氨酸富集蛋白基因GmPRP和SbPRP構(gòu)建到植物表達(dá)載體pRI101上,通過(guò)葉盤法轉(zhuǎn)化煙草。共獲得GmPRP陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因煙草2株,SbPRP陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因煙草4株。對(duì)轉(zhuǎn)基因煙草植株進(jìn)行高鹽、干旱和低溫脅迫處理。結(jié)果表明,高鹽處理后,SbPRP轉(zhuǎn)基因煙草的脯氨酸含量和可溶性糖含量分別顯著和極顯著高于野生型,丙二醛含量極顯著低于野生型。干旱處理對(duì)GmPRP和SbPRP轉(zhuǎn)基因煙草脯氨酸含量、可溶性糖含量和丙二醛含量的影響均不明顯。低溫處理后,GmPRP和SbPRP轉(zhuǎn)基因煙草的脯氨酸含量均極顯著高于野生型,丙二醛含量均低于野生型。由此推測(cè)SbPRP可以提高轉(zhuǎn)基因煙草的耐鹽性和耐寒性,GmPRP可以提高轉(zhuǎn)基因煙草的耐寒性,為后續(xù)SbPRP和GmPRP的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

大豆;脯氨酸富集蛋白;煙草;抗逆性

大豆(GlycinemaxL.)是我國(guó)重要的經(jīng)濟(jì)作物,然而環(huán)境因子(例如干旱、鹽堿、極端溫度)和病蟲(chóng)害等每年都會(huì)影響大豆的產(chǎn)量。大豆也是分子生物技術(shù)應(yīng)用最為成功的作物之一,其轉(zhuǎn)基因品種的種植面積和比例一直位居大田作物之首[1]。所以,能否發(fā)掘有效的抗逆候選基因就成為大豆抗逆分子育種的關(guān)鍵之一。

植物細(xì)胞壁中結(jié)構(gòu)蛋白含量最豐富的主要有5類:富含羥脯氨酸糖蛋白(Hydroxyprolin-rich glycoproteins,HRGPs)、茄科凝集素(Solanaceous lectins)、阿拉伯半乳糖蛋白(Arabinogalactan proteins,AGPs)、甘氨酸富集蛋白(Glycine-rich proteins,GRPs)和脯氨酸富集蛋白(Proline-rich proteins,PRPs)[2-3]。這些結(jié)構(gòu)蛋白在植物細(xì)胞壁的形成及應(yīng)對(duì)環(huán)境脅迫過(guò)程中發(fā)揮非常重要的作用[4]。其中,PRPs為一類富含脯氨酸和羥脯氨酸的蛋白,它們中的一部分結(jié)構(gòu)較為特殊,N 端為信號(hào)肽序列,中間為脯氨酸富集區(qū),C 端為含有8個(gè)保守半胱氨酸元件(8CM)的區(qū)域[5]。此類蛋白可在植物發(fā)育及應(yīng)對(duì)生物及非生物脅迫時(shí)發(fā)揮功能。研究表明,草莓中的HyPRP基因與果實(shí)生長(zhǎng)和成熟過(guò)程中的多酚固定相關(guān)[6]。木豆中的CcHyPRP基因能夠賦予酵母和擬南芥多種非生物脅迫(干旱、高鹽和高溫)抗性[7]。OsPRP3的過(guò)量表達(dá)可以提高轉(zhuǎn)基因水稻抗冷性,因?yàn)樗诤錀l件下可以提高細(xì)胞壁的完整性[8]。而芝麻SiPRP和海島棉GbHyPRP1則受病菌誘導(dǎo)后下調(diào)表達(dá)[9-10]。

大豆中的SbPRP可被病毒感染、高鹽、干旱以及植物激素等調(diào)節(jié),但其是否能提高轉(zhuǎn)基因植物的抗逆性并未見(jiàn)報(bào)道[11]。大豆中的另一個(gè)脯氨酸富集蛋白基因GmPRP為筆者前期所克隆,實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果顯示其可被干旱、高鹽、低溫、乙烯及ABA等誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)[12]。本試驗(yàn)將大豆GmPRP和SbPRP基因構(gòu)建植物表達(dá)載體并轉(zhuǎn)化煙草,對(duì)轉(zhuǎn)基因煙草的非生物脅迫耐受性進(jìn)行鑒定,為它們的進(jìn)一步應(yīng)用奠定基礎(chǔ)理論,并為篩選大豆優(yōu)良抗逆基因提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

大豆品種合豐46、煙草品種NC89、大腸桿菌DH5α菌株及根癌農(nóng)桿菌EHA105菌株均由齊齊哈爾大學(xué)遺傳研究室提供。植物表達(dá)載體pRI101購(gòu)自大連寶生物工程公司。所用引物均由上海生工生物工程公司合成。

1.2 植物表達(dá)載體構(gòu)建

采用Plant RNAzol試劑(鼎國(guó)生物公司)提取大豆葉片總RNA,按照cDNA第一鏈合成試劑盒(鼎國(guó)生物公司)說(shuō)明書(shū)合成第一鏈cDNA,-20 ℃保存?zhèn)溆谩８鶕?jù)GmPRP(GenBank登錄號(hào):JN222914)和SbPRP(GenBank登錄號(hào):AF248055)基因序列設(shè)計(jì)引物,以cDNA為模板,擴(kuò)增目的基因全序列。擴(kuò)增引物如下(下劃線為酶切位點(diǎn)):GmPRP-F:ACGCGTCGACATGGCTTCCAACAAGGTTATTG,SalⅠ;GmPRP-R:GGAATTCTTAATAGCAGACGAAACC CTTG,EcoR Ⅰ;SbPRP-F:ACGCGTCGACATGGCTT

CCAACAAG GTTATTG,SalⅠ;SbPRP-R:GGAATTC

CTATGCACATTGGAAGCC AG,EcoR Ⅰ。退火溫度均為56 ℃。PCR產(chǎn)物經(jīng)切膠回收后連接至pMD-18T載體上,送上海生工生物工程公司測(cè)序。測(cè)序正確后,將目的基因連接到pRI101植物表達(dá)載體上,構(gòu)建成由CaMV35S啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)目的基因表達(dá)的重組載體pRI101-GmPRP和pRI101-SbPRP。重組載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α,提取質(zhì)粒,經(jīng)質(zhì)粒雙酶切鑒定后采用凍融法轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌EHA105。

1.3 轉(zhuǎn)基因煙草植株的獲得

將含有植物表達(dá)載體pRI101-GmPRP和pRI101-SbPRP的農(nóng)桿菌菌液經(jīng)葉盤法轉(zhuǎn)化煙草[13],MS培養(yǎng)基中卡那霉素的篩選濃度為50 mg/L。以具有卡那霉素抗性的煙草轉(zhuǎn)化幼苗葉片cDNA為模板,pRI101-GmPRP和pRI101-SbPRP質(zhì)粒為陽(yáng)性對(duì)照,非轉(zhuǎn)基因煙草葉片cDNA為陰性對(duì)照,進(jìn)行轉(zhuǎn)基因植株的RT-PCR鑒定。單株收獲T0呈陽(yáng)性植株的種子,將其繼續(xù)在含有30 mg/L卡那霉素的MS培養(yǎng)基上進(jìn)行抗性篩選,獲得T1抗性植株。繼續(xù)對(duì)T1抗性植株葉片進(jìn)行RT-PCR檢測(cè),獲得T1陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因植株。

1.4 轉(zhuǎn)基因煙草植株非生物脅迫處理

選取T1中RT-PCR目的條帶最亮的轉(zhuǎn)基因株系進(jìn)行非生物脅迫處理。將正常生長(zhǎng)于花盆中的6周齡的野生型煙草和T1轉(zhuǎn)基因煙草用含有400 mmol/L NaCl的水澆透,處理5 h,進(jìn)行鹽害處理;停止?jié)菜?0 d,進(jìn)行干旱處理;煙草連同花盆一起至于4 ℃培養(yǎng)箱中12 h,進(jìn)行冷害處理。每個(gè)處理進(jìn)行3次重復(fù)。脯氨酸含量的測(cè)定采用Bates等[14]描述的方法。丙二醛含量的測(cè)定采用Shao等[15]描述的方法。可溶性糖含量的測(cè)定采用Zhai等[16]描述的方法。

2 結(jié)果與分析

2.1 植物表達(dá)載體的構(gòu)建

通過(guò)RT-PCR分別從大豆葉片中擴(kuò)增出396 bp的GmPRP序列和381 bp的SbPRP序列(圖1)。將GmPRP和SbPRP分別構(gòu)建到植物表達(dá)載體pRI101上,經(jīng)質(zhì)粒雙酶切鑒定(圖2),酶切條帶與期望值一致,說(shuō)明目的基因均已整合進(jìn)植物表達(dá)載體中。將陽(yáng)性質(zhì)粒轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌EHA105即獲得轉(zhuǎn)基因工程菌。

M.DL2000 Marker;1.GmPRP質(zhì)粒雙酶切產(chǎn)物;

2.2 轉(zhuǎn)基因煙草植株的篩選

取無(wú)菌條件下培養(yǎng)的煙草葉片進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化。待抗性芽生長(zhǎng)至1 cm左右時(shí)(圖3-A),將其從愈傷組織中分離并轉(zhuǎn)到生根培養(yǎng)基中。約28～35 d抗性芽長(zhǎng)出根系并逐漸成苗(圖3-B)。經(jīng)RT-PCR檢測(cè)(圖4),共獲得GmPRP陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因煙草2株,SbPRP陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因煙草4株。

圖3 轉(zhuǎn)基因煙草植株篩選過(guò)程

M.DL2000 Marker;1.野生型煙草;2.pRI101-GmPRP陽(yáng)性質(zhì)粒;3.pRI101-SbPRP陽(yáng)性質(zhì)粒;4～5.GmPRP轉(zhuǎn)基因煙草;6～9.SbPRP轉(zhuǎn)基因煙草。

M.DL2000 Marker;1.Wild type tobacco;2.Positive plasmid of pRI101-GmPRP;3.Positive plasmid of pRI101-SbPRP;4-5.Transgenic tobacco ofGmPRP;6-9.Transgenic tobacco ofSbPRP.

圖4GmPRP和SbPRP轉(zhuǎn)基因煙草的RT-PCR檢測(cè)結(jié)果

Fig.4 RT-PCR detection results ofGmPRPandSbPRPtransgenic tobacco plants

2.3 轉(zhuǎn)基因煙草植株的耐鹽性分析

鹽脅迫處理前,野生型煙草和轉(zhuǎn)基因煙草的脯氨酸含量、可溶性糖含量和丙二醛含量均沒(méi)有顯著差別。鹽脅迫處理5 h時(shí),野生型煙草和轉(zhuǎn)基因煙草的脯氨酸含量和可溶性糖含量均升高,且SbPRP轉(zhuǎn)基因煙草的脯氨酸含量和可溶性糖含量分別顯著和極顯著高于野生型(圖5-A、B);野生型煙草和GmPRP轉(zhuǎn)基因煙草的丙二醛含量均升高，SbPRP轉(zhuǎn)基因煙草的丙二醛含量變化不明顯，并且SbPRP轉(zhuǎn)基因煙草的丙二醛含量極顯著低于野生型(圖5-C)。以上結(jié)果表明，SbPRP轉(zhuǎn)基因煙草植株在高鹽脅迫下可以提高脯氨酸和可溶性糖的積累,降低丙二醛的產(chǎn)生,提高耐鹽性。

2.4 轉(zhuǎn)基因煙草的耐旱性分析

干旱脅迫處理前,野生型煙草和轉(zhuǎn)基因煙草的脯氨酸含量、可溶性糖含量和丙二醛含量均沒(méi)有顯著差別。干旱脅迫處理10 d時(shí),三者含量在野生型煙草和轉(zhuǎn)基因煙草中均升高,但在野生型煙草和轉(zhuǎn)基因煙草之間并沒(méi)有顯著差別(圖6)。表明GmPRP和SbPRP對(duì)轉(zhuǎn)基因煙草植株的耐旱性沒(méi)有顯著影響。

2.5 轉(zhuǎn)基因煙草的耐寒性分析

低溫脅迫處理前,野生型煙草和轉(zhuǎn)基因煙草的脯氨酸含量和丙二醛含量均沒(méi)有顯著差別。低溫脅迫處理12 h時(shí),野生型煙草和轉(zhuǎn)基因煙草的脯氨酸含量均升高,且2個(gè)轉(zhuǎn)基因煙草的脯氨酸含量均極顯著高于野生型(圖7-A);野生型煙草和GmPRP轉(zhuǎn)基因煙草的丙二醛含量均升高，SbPRP轉(zhuǎn)基因煙草的丙二醛含量變化不明顯，并且2個(gè)轉(zhuǎn)基因煙草的丙二醛含量均低于野生型煙草(圖7-C)。以上結(jié)果表明GmPRP和SbPRP轉(zhuǎn)基因煙草植株在低溫脅迫下可以提高脯氨酸的積累,降低丙二醛的產(chǎn)生,提高耐寒性。

WT.野生型;**.在1%概率水平上差異顯著;*.在5%概率水平上差異顯著。圖6-7同。

圖6 野生型和轉(zhuǎn)基因煙草植株耐旱性分析

圖7 野生型和轉(zhuǎn)基因煙草植株耐寒性分析

3 討論與結(jié)論

植物細(xì)胞壁直接與外界接觸,一旦植物遭受逆境時(shí),首先需要細(xì)胞壁的一系列變化來(lái)適應(yīng)這些不利環(huán)境,因此，可以預(yù)見(jiàn)植物細(xì)胞壁蛋白可能在植物抗逆中發(fā)揮重要作用。研究表明,PRPs基因的過(guò)量表達(dá)能夠提高植物葉片的木質(zhì)化程度,使細(xì)胞壁變厚,因而在細(xì)胞壁的建造和細(xì)胞的防御過(guò)程中發(fā)揮重要作用[17-18]。Deutch和Goodwin等[19-20]認(rèn)為,PRPs可能通過(guò)蛋白的雙功能域在細(xì)胞壁和膜之間起牢固的連接作用,來(lái)確保細(xì)胞的完整性,從而提高植物抗性。相反,將擬南芥中編碼HyPRP的EARLI1基因敲除后,突變植株的細(xì)胞在冷脅迫下更易受到破壞[21]。同樣將擬南芥中的另一個(gè)編碼PRP的SICKLE(SIC)基因敲除后,突變植株與正常擬南芥相比對(duì)冷和鹽脅迫更加敏感[22]。

本試驗(yàn)將大豆中已經(jīng)克隆的2個(gè)細(xì)胞壁脯氨酸富集蛋白基因GmPRP和SbPRP轉(zhuǎn)化煙草并對(duì)非生物脅迫處理下轉(zhuǎn)基因煙草的生理指標(biāo)進(jìn)行檢測(cè)。脯氨酸是植物體內(nèi)重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)之一,它不僅能夠提高細(xì)胞的保水能力,還能對(duì)蛋白質(zhì)起一定保護(hù)作用[23]。同樣,可溶性糖的積累也在減輕細(xì)胞滲透脅迫,保護(hù)細(xì)胞膜等方面發(fā)揮重要作用[24]。丙二醛是由活性氧引起的膜脂過(guò)氧化產(chǎn)物,它在植物體內(nèi)的含量可以用來(lái)衡量植物遭受逆境的程度[25]。結(jié)果顯示SbPRP轉(zhuǎn)基因煙草的綜合抗性較好,其通過(guò)提高脯氨酸和可溶性糖的積累,減少細(xì)胞膜的損傷,降低丙二醛的產(chǎn)生,可以提高轉(zhuǎn)基因煙草的耐鹽性和耐寒性,但對(duì)轉(zhuǎn)基因煙草的耐旱性沒(méi)有顯著影響。而GmPRP只能提高轉(zhuǎn)基因植物的耐寒性。這可能與GmPRP和SbPRP對(duì)不同脅迫的響應(yīng)模式不一致有關(guān)[11-12],正如前人所說(shuō),某些條件下脅迫基因表達(dá)水平的上調(diào)可能不足以提高對(duì)脅迫的抗性[26]。

本試驗(yàn)將大豆中的2個(gè)脯氨酸富集蛋白基因GmPRP和SbPRP構(gòu)建植物表達(dá)載體并轉(zhuǎn)化煙草。對(duì)轉(zhuǎn)基因煙草植株進(jìn)行高鹽、干旱和低溫脅迫處理。試驗(yàn)結(jié)果表明,高鹽處理后,SbPRP轉(zhuǎn)基因煙草的脯氨酸含量和可溶性糖含量分別顯著和極顯著高于野生型,丙二醛含量極顯著低于野生型。低溫處理后,GmPRP和SbPRP轉(zhuǎn)基因煙草的脯氨酸含量均極顯著高于野生型,丙二醛含量均低于野生型。由此推測(cè)SbPRP可以提高轉(zhuǎn)基因煙草的耐鹽性和耐寒性,GmPRP可以提高轉(zhuǎn)基因煙草的耐寒性。

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Analysis of Abiotic Stress Resistance Ability of Transgenic Tobacco ExpressingGmPRPandSbPRPfrom Soybean

ZHAI Ying1,ZHANG Jun2,ZHAO Yan1

(1.College of Life Science and Agro-Forestry,Qiqihar University,Qiqihar 161006,China;2.Heilongjiang Institute of Veterinary Science,Qiqihar 161005,China)

In order to realize the application of PRPs genes in plant genetic engineering,theGmPRPandSbPRPfrom soybean were cloned into plant expression vector of pRI101,respectively,and then introduced into tobacco byAgrobacterium-mediated transformation.Two positive transgenic tobacco plants ofGmPRPand four positive transgenic tobacco plants ofSbPRPwere obtained.The transgenic tobacco plants were treated with salt,drought and cold stresses.The results showed that the contents of proline and soluble sugar inSbPRPtransgenic plants were significant higher than wild-type plants and the contents of malondialdehyde inSbPRPtransgenic plants were significant lower than wild-type plants under salt stress.While the contents of proline,soluble sugar,and malondialdehyde inGmPRPandSbPRPtransgenic plants had no significant differences compared to wild-type plants under drought stress.The contents of proline inGmPRPandSbPRPtransgenic plants were both significant higher than wild-type plants and the contents of malondialdehyde inGmPRPandSbPRPtransgenic plants were both lower than wild-type plants under cold stress.These data indicated that the transgenic tobacco plants constitutively expressingSbPRPshowed an increased tolerance to salt and cold stresses and the transgenic tobacco plants constitutively expressingGmPRPshowed an increased tolerance to cold stress,which may provide a way toward the application of them.

Soybean;Proline-rich protein;Tobacco;Stress resistance

2016-07-17

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31301335);黑龍江省教育廳科學(xué)技術(shù)研究項(xiàng)目(12541889);黑龍江省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(C201458)

翟 瑩(1982-),女,吉林省吉林市人,副教授,博士,主要從事大豆分子育種研究。

Q78;S565.03

A

1000-7091(2016)05-0056-06

10.7668/hbnxb.2016.05.009