五個綿羊群體KAP11-1基因核苷酸序列變異分析

朱建勛,王繼卿,胡 江,劉 秀,李少斌,閆 偉,羅玉柱

(甘肅農業大學 動物科學技術學院,甘肅省草食動物生物技術重點實驗室,甘肅 蘭州 730070)

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五個綿羊群體KAP11-1基因核苷酸序列變異分析

朱建勛,王繼卿,胡 江,劉 秀,李少斌,閆 偉,羅玉柱

(甘肅農業大學 動物科學技術學院,甘肅省草食動物生物技術重點實驗室,甘肅 蘭州 730070)

為了分析綿羊KAP11-1基因的核苷酸序列變異,采用PCR-SSCP方法和DNA測序技術檢測了歐拉羊、甘肅高山細毛羊、灘羊、湖羊和青海細毛羊5個群體(749只個體)KAP11-1基因的單核苷酸多態性,同時分析了等位基因頻率、遺傳雜合度、有效等位基因數和多態信息含量等群體遺傳特征。結果表明,5個綿羊群體的KAP11-1基因中共檢測到c.93C/T、c.240G/A、c.285C/G/A和c.331A/G 4個單核苷酸多態位點,且c.331A/G為非同義突變。等位基因A在5個群體中出現的頻率最高(87.70%),為優勢等位基因,其次為等位基因B(基因頻率為11.03%),等位基因C和D的頻率最低(分別為0.53%和0.74%)。群體遺傳學分析結果表明,灘羊KAP11-1基因的遺傳雜合度、有效等位基因數和多態信息含量均高于其余4個群體。KAP11-1基因作為羊毛經濟性狀的主要候選基因之一,其核苷酸序列的變異導致KAP11-1中相應氨基酸的改變,最終可能會影響羊毛纖維的結構和羊毛主要經濟性狀。

綿羊;KAP11-1基因;核苷酸序列變異;PCR-SSCP;單核苷酸多態性

羊毛纖維的主要結構由角蛋白(Keratins)和角蛋白關聯蛋白(Keratin-associated proteins,KAPs)構成。大量的角蛋白聚集成束形成8～10 nm的角蛋白中間絲(Keratin intermediate filaments,KIFs),KAPs則通過大量的二硫鍵交聯形成半剛性基質嵌入到KIFs的半胱氨酸殘基中[1]。KAPs最典型的特征是結構中含有較高比例的半胱氨酸或甘氨酸/酪氨酸殘基,并根據其含量的不同分為3類,分別是高硫角蛋白關聯蛋白(HS-KAPs,≤30 mol% Cysteine)、超高硫角蛋白關聯蛋白(UHS-KAPs,>30mol% Cysteine)、高甘氨酸/酪氨酸角蛋白關聯蛋白(HGT-KAPs,35～60 mol% Glycine/Tyrosine)[1]。目前,共發現和命名了27個KAPs家族成員,其中KAP1～3、KAP10～16和KAP23～27屬于HS-KAPs;KAP4、KAP5、KAP9和KAP17屬于UHS-KAPs;KAP6～8和KAP18～22屬于HGT-KAPs[2]。

KAPs基因是編碼羊毛纖維的重要結構基因,長度較小(約600～1 500 bp),一般包含一個單獨的外顯子,且外顯子被一些介入序列隔開[3]。研究表明,KAPs基因與羊毛的質量和產量存在相關性[4],因此可以找到一些與毛用性狀密切相關的分子遺傳標記,為綿羊品種改良提供繁殖新技術。艾買提·買買提[5]通過對KAP9-2基因位點不同基因型與剪毛量的相關性分析發現,AA、AB、BB和CC基因型對應羊只個體的剪毛量差異顯著(P<0.05),推測KAP9-2基因可作為中國美利奴羊(新疆型)剪毛量的有效分子標記。Parsons等[6]研究發現KAP6和KAP8與羊毛產量和纖維直徑有明顯的相關性,并推測在KAP6和KAP8同一區域可能存在著控制羊毛纖維直徑的主效基因。Cockett等[7]進一步證實了KAP6和羊毛纖維直徑之間的相關性。孫福亮等[8]發現新吉細毛羊KAP13-1基因的CC基因型對應個體的產毛量顯著高于TT基因型(P<0.05),NN基因型對應個體的產毛量和羊毛拉伸長度顯著高于MM基因型(P<0.05),認為可通過提高CC和NN基因型的頻率來增加新吉細毛羊的產毛量和羊毛拉伸長度。

KAP11-1基因是目前在KAP11基因家族中發現的唯一一個基因,有關該基因的遺傳變異在綿羊、人、牛和小鼠上已有報道[9-12],但在中國綿羊品種上沒有相關研究。因此,本試驗以綿羊KAP11-1基因為候選基因,采用PCR-SSCP方法,結合DNA測序技術,分析該基因在5個中國綿羊群體中的遺傳特征,豐富我國羊毛基因組研究內容,為綿羊毛用性狀的分子標記輔助選擇提供理論基礎依據。

1 材料和方法

1.1 試驗材料及DNA提取

采集5個綿羊品種的749份血樣,包括歐拉羊、甘肅高山細毛羊、灘羊、湖羊和青海細毛羊,具體采樣地點、血樣儲存類型及樣本數量見表1。根據常規采樣要求,每只羊頸靜脈采血2 mL,不加任何抗凝劑,直接滴于FTA卡(Whatman,Middlesex,UK)上,室溫下放置、晾干備用。用Zhou等[13]描述的2步法提取FTA卡中的基因組DNA,用于PCR擴增。

表1 試驗樣本信息

1.2 引物設計和PCR擴增

根據GenBank中綿羊KAP11-1基因序列(登錄號:HQ595347),利用DNAMAN 軟件(version 5.2.10,Lynnon BioSoft,Vaudreuil,Canada)設計特異性引物,擴增該基因部分編碼區序列,目的片段大小為408 bp。上游引物序列為5′-GGATTGGAGGAGAAT

ACACTG-3′;下游引物序列為5′-ACTGCTGGTACGT

CCTGGAG-3′。引物由上海生工生物工程有限公司合成。

PCR反應總體積20 μL,其中Taq預混酶(北京百泰克生物技術有限公司)10 μL,上、下游引物(0.25 μmol/L)各0.4 μL,ddH2O為8.2 μL,基因組DNA為1.2 mm 的FTA卡小圓片1個(約相當于50 ng/μL基因組DNA 1.0 μL)。

PCR反應條件:94 ℃預變性3 min;94 ℃變性30 s,63 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s,共35個循環;72 ℃終延伸7 min,4 ℃保存。PCR擴增產物用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.3 SSCP分析

取2 μL的PCR擴增產物,加入8 μL變性上樣緩沖液(98%去離子甲酰胺,10 mmol/L EDTA,0.025%溴酚藍和0.025%二甲苯氰),95 ℃變性5 min后,立即置于冰水混合物中,迅速上樣于10%的非變性聚丙烯酰胺凝膠(Acr∶Bis=37.5∶1)中,于260 V、18 ℃條件下在0.5×TBE 緩沖液中電泳20 h。

1.4 銀染

電泳結束后,根據Byun等[14]描述的方法銀染聚丙烯酰胺凝膠。

1.5 等位基因序列測定

等位基因測序方法因純合子和雜合子而異。如果SSCP條帶是純合子,用PCR 擴增產物直接測序;如果SSCP條帶是雜合子,按照Gong等[15]描述的方法切膠測序。序列測定由上海生工生物工程有限公司完成。

1.6 數據統計分析

利用DNAMAN 軟件(version 5.2.10,Lynnon BioSoft,Vaudreuil,Canada)比對等位基因核苷酸序列,用GenBank中在線Blast軟件(http://www.ncbi.nlm.nih.goc/)比對本試驗獲得的等位基因序列與綿羊基因組(Genome assembly v3.1,Oar3.1)已有序列的同源性。利用Popgen 32.0軟件計算等位基因頻率、遺傳雜合度(He)、有效等位基因數(Ne)和Hardy-Weinberg平衡定律。采用PIC軟件計算群體多態信息含量(PIC)。在GenBank數據庫中,選取綿羊(HQ595347)、山羊(NM_001285767.1)、牛(NM_001080740.1)、人(NM175858.2)、獼猴(XM_001083627.1)和小家鼠(NM_001113406.1)KAP11-1基因的核苷酸序列,比較物種間核苷酸序列同源性,并根據不同物種間KAP11-1基因的遺傳距離,用MEGA(version 5.0)軟件構建NJ系統發育樹。

2 結果與分析

2.1KAP11-1基因的PCR擴增結果

KAP11-1基因的PCR產物經1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測,得到一條特異性較好的電泳條帶(圖1),且片段大小為408 bp,與目的片段大小一致,可以進行下一步的SSCP分析。

M.Marker;1～3.歐拉羊;4～5.甘肅高山細毛羊;6.灘羊;7～8.湖羊;9.青海細毛羊。

M.DNA Marker;PCR products in lane 1-3,lane 4-5,lane 6,lane 7-8 and lane 9 are random individual from Oula sheep,Gansu Alpine Merino,Tan sheep,Hu sheep and Qinghai merino sheep,respectively.

圖1 綿羊KAP11-1基因的PCR擴增檢測圖

Fig.1 PCR amplification ofKAP11-1 gene in sheep

2.2KAP11-1基因的SSCP檢測結果

KAP11-1基因的PCR擴增產物經SSCP分析后,在5個綿羊群體的749只個體中共檢測到4個等位基因(分別命名為A、B、C、D)和6種基因型(AA、BB、AB、AC、AD、BD)(圖2)。經在線Blast軟件比對發現,等位基因A、B、C的核苷酸序列與已提交的綿羊KAP11-1基因的部分序列相同(登錄號:HQ595347、HQ595351、HQ595352),等位基因D為本試驗首次發現。

圖2 綿羊KAP11-1基因的PCR-SSCP檢測結果

4個等位基因中共檢測到4個SNPs位點(表2),占分析位點總數的0.98%。其中轉換位點3個(c.93C/T、c.240G/A和c.331A/G),占核苷酸多態位點的75%;顛換位點1個(c.285C/G/A),占25%。在4個SNPs位點中,c.93C/T、c.240G/A和c.285C/G/A是同義突變;c.331A/G是非同義突變,導致KAP11-1多肽鏈上1個氨基酸的改變(p.Ser111Gly)。

表2 綿羊KAP11-1基因的核苷酸和氨基酸序列變異

注:原始序列指GenBank中綿羊的核苷酸序列(登錄號:HQ595347);-.氨基酸沒有發生變化。

Note:Original sequence refers to the nucleotide sequence of sheep in GenBank (Accession number:HQ595347);-.No amino acid change.

對20種常見氨基酸在綿羊KAP11-1中的數量和摩爾百分比分析發現,在等位基因B編碼的氨基酸序列中,由于存在p.Ser111Gly,使得Ser的數量由原來的30個變為29個,摩爾百分比由原來的18.87%變為18.24%;相應的,Gly的數量由原來的9個變為10個,摩爾百分比由原來的5.66%變為6.29%(表3)。

表3 綿羊KAP11-1中各氨基酸的數量及其在氨基酸序列中所占的比例

注:表中氨基酸的數量和摩爾百分比是利用DNAMAN軟件(version 5.2.10,Lynnon BioSoft,Vaudreuil,Canada)對綿羊KAP11-1基因編碼區(480 bp)編碼的氨基酸(159個)組成分析所得。

Note:The number and mole percentage of amino acids (159) listed in this table were obtained from the coding region (480 bp) of ovineKAP11-1 gene by using DNAMAN software (version 5.2.10,Lynnon BioSoft,Vaudreuil,Canada).

2.4KAP11-1基因在5個綿羊群體中的等位基因頻率和基因型頻率

5個綿羊群體KAP11-1基因的基因型頻率和等位基因頻率具有品種差異性(表4)。在歐拉羊、甘肅高山細毛羊、湖羊和青海細毛羊中僅檢測到A和B 2個等位基因及AA、BB和AB 3種基因型。在灘羊中檢測到全部4個等位基因和6種基因型。在5個綿羊群體中,等位基因A出現的頻率最高(87.70%),為優勢等位基因,其次為等位基因B,等位基因C和D出現的頻率最低,兩者之和僅占1.27%。基因型AA在5個綿羊群體中出現的頻率最高 (82.38%),為優勢基因型。

表4 五個綿羊群體KAP11-1基因的基因型頻率與等位基因頻率

2.5KAP11-1基因的雜合度、有效等位基因數和多態信息含量

5個綿羊群體KAP11-1基因的遺傳多態性信息(表5)顯示,灘羊具有較高的遺傳變異,其遺傳雜合度(He)和有效等位基因數(Ne)分別為0.17和1.38。甘肅高山細毛羊上述2個參數均最低,說明在5個綿羊群體中其遺傳變異最小。灘羊KAP11-1基因的PIC值為0.26,屬中度多態,其余4個群體KAP11-1基因的PIC值均小于0.25,呈低度多態。

2.6KAP11-1基因的Hardy-Weinberg平衡檢驗和中性檢驗

5個綿羊群體KAP11-1基因的遺傳平衡檢驗和中性檢驗見表6。5個綿羊群體KAP11-1基因的χ2值和G2值均未達到顯著水平,說明群體處于Hardy-Weinberg平衡狀態(P>0.05)。中性檢驗結果顯示,5個綿羊群體的觀測F值在KAP11-1基因中處于95%的置信區間內,并接近區間上限(U95)。

表5 五個綿羊群體KAP11-1基因的遺傳多態參數

表6 綿羊KAP11-1基因的遺傳平衡檢驗和中性檢驗

2.7KAP11-1基因的核苷酸序列同源性及系統發育分析

綿羊、山羊和牛等6個物種KAP11-1基因的核苷酸序列同源性比較結果見表7。綿羊KAP11-1基因的核苷酸序列與山羊、牛的同源性最高,分別為99.2%和95.4%,與人、獼猴和小家鼠的同源性依次為83.1%,82.9%和80.8%。不同物種KAP11-1基因的核苷酸序列同源性高低與系統發育樹結果一致(圖3)。系統發育樹中,綿羊與山羊、牛的親緣關系最近,在系統發育樹中聚為一支,而與人、獼猴和小家鼠的親緣關系較遠。

表7 六個物種KAP11-1基因核苷酸序列同源性比較結果

圖3 基于KAP11-1基因核苷酸序列構建不同物種的NJ樹

3 討論

羊毛纖維具有高度的組織結構,其纖維的90%由KIFs和KAPs組成,這2種類型的蛋白都由多基因家族編碼。目前國內外大多學者把KAPs基因家族的遺傳變異與羊毛(羊絨)經濟性狀的相關性分析作為研究熱點。張亞妮等[16]以KAP6-1(S1位點)、KAP1-1(S2位點)和KAP1-3(S3和S4位點)為候選基因,研究其多態性與遼寧絨山羊經濟性狀的相關性。試驗結果發現,S1-AB、S1-BB、S3-BB和S4-AB可作為遼寧絨山羊產絨量性狀的優勢標記基因型。Parsons等[6]通過對美利奴羊半同胞家系研究發現KAP6、KAP7和KAP8基因所在染色體區段與羊毛纖維直徑有相關關系。Gong等[17]以320只新西蘭綿羊為研究對象,采用PCR-SSCP技術分析了KAP1-4基因的遺傳多態性,結果在9條等位基因序列中發現了14個SNPs位點,預測該基因可能是綿羊毛用性狀的候選基因。

本試驗首次研究了中國綿羊群體KAP11-1基因的遺傳多態性。在所分析的749只綿羊個體中,共發現了A、B、C和D 4個等位基因,其中等位基因D為本試驗首次發現。KAP11-1基因的等位基因頻率在細毛羊、裘皮羊、羔皮羊等不同毛用綿羊品種中的分布表現出品種差異性,在一定程度上反映了毛用羊品種的生產力方向。在5個綿羊品種中,僅在灘羊中檢測到C和D 2種等位基因。灘羊是我國獨有的輕裘皮用綿羊品種,以生產潔白、美觀、輕便、保暖、耐用的二毛裘皮(灘羊出生后1月齡左右屠宰所得的皮張,其毛股長而彎曲,有“9道灣”之稱。)著稱于世。等位基因C和D可能與灘羊二毛裘皮毛股彎曲數有關。楊麗娟等[18]采用PCR-RFLP分子標記技術,在258只灘羊的KAP1-3基因中檢測到2個等位基因A、B和3種基因型AA、AB、BB。相關性分析表明,BB基因型的毛股彎曲數顯著高于AA和AB基因型(P<0.05),認為可以通過提高BB基因型頻率來增加灘羊二毛裘皮的毛股彎曲數。等位基因B在湖羊中出現的頻率最高,這可能與小湖羊皮(湖羊出生后1～2 d內宰剝的羔皮稱為“小湖羊皮”,毛色潔白光潤,皮質輕柔,花紋呈波浪形,有“軟寶石”之稱。)的特性有關,但目前沒有這方面的研究報道,還需進行相關性分析加以驗證。歐拉羊、甘肅高山細毛羊和青海細毛羊各等位基因頻率差異不大,這可能與上述這3個品種都含有藏綿羊的血統有關。

4個等位基因的編碼區共檢測出4個SNPs位點(c.93C/T、c.240G/A、c.285C/G/A和c.331A/G),其中轉換位點(c.93C/T、c.240G/A和c.331A/G)多于顛換位點(c.285C/G/A)。這是因為SNPs在CG序列上出現的頻率較高,而CpG二核苷酸上的胞嘧啶殘基容易發生甲基化,從而自發脫去氨基形成胸腺嘧啶。同義突變(c.93C/T、c.240G/A和c.285C/G/A)多于非同義突變(c.331A/G),占核苷酸變異位點的75%。同義突變雖然不引起氨基酸的改變,但因為改變了核苷酸序列(三聯體密碼子),有可能影響轉錄后的加工和切接信號的順序,同時降低mRNA的穩定性[19-21],最終影響基因的表達。非同義突變(c.331A/G)導致KAP11-1多肽鏈上1個氨基酸由絲氨酸(Ser)變為甘氨酸(Gly),該變異可能對綿羊的毛用性狀有一定影響,但需要進行相關性分析檢驗其對羊毛性狀的作用。Gong等[9]采用PCR-SSCP方法分析了新西蘭羅姆尼羊KAP11-1基因的遺傳變異,結果在6個等位基因序列中發現了5個SNPs位點(c.69G/T、c.93C/T、c.288C/G/A、c.334A/G和c.426C/T),除c.93C/T外,其余SNPs位點均與本研究結果不同,這可能是由于研究品種不同所造成的。這也說明如果增加綿羊品種的數量,在KAP11-1基因中可能會發現更多的等位基因和SNPs位點,同時也印證了該基因在不同綿羊品種中的分布具有品種差異性。

雜合度(He)、有效等位基因數(Ne)和多態信息含量(PIC)是度量群體遺傳變異的重要指標,不同的遺傳參數體現各群體的遺傳差別,度量數值越高,遺傳變異就越大。在5個綿羊群體中,灘羊的He、Ne和PIC均最大。這說明試驗灘羊在飼養過程中,人工選擇壓力不大,主要經濟性狀在群體內變異較大。同時也反映出該群體選育空間很大,如果育種措施(如表型選擇+后裔測定、分子標記輔助選擇)得當,可使生產性能在較短的時間內有較大的提高,從而使主要表型性狀趨于一致。χ2適合性檢驗表明,KAP11-1基因在5個綿羊群體中處于Hardy-Weinberg平衡狀態(P>0.05),說明在隨機遺傳漂變和人工選擇過程中5個群體的KAP11-1基因處于動態平衡,選擇壓力對該基因的作用不強。

KAP11-1基因的核苷酸序列同源性及系統發育分析結果表明,綿羊與山羊、牛的同源性和親緣關系最近,在系統發育樹中聚為一支,而與人、獼猴和小家鼠的同源性和親緣關系較遠。該結論符合動物分類學上將綿、山羊和牛歸為同一科(牛科或洞角科)的分類方法。

綿羊KAP11-1基因包含由480個核苷酸組成的開放閱讀框(Open reading frame,ORF),共編碼159個氨基酸。其中絲氨酸(Ser)、半胱氨酸(Cys)和蘇氨酸(Thr)含量最高,分別占氨基酸總數的18.87 mol%,12.58 mol%,11.95 mol%。絲氨酸和蘇氨酸是易于發生磷酸化的氨基酸,綿羊KAP11-1中絲氨酸和蘇氨酸殘基數占整個多肽鏈上氨基酸總數的30.82 mol%,潛在磷酸化位點數是其他高硫KAPs基因的2～4倍[9]。磷酸化是蛋白質翻譯后一種最常見和最重要的修飾方式。蛋白質磷酸化作用發生于許多生物化學過程中,如在細胞外信號的傳遞以及細胞內調整代謝過程(包括基因表達、細胞生長、細胞分裂和增殖等)中起著關鍵的調節作用[22-23]。雖然目前對于KAPs蛋白的磷酸化沒有系統的研究結論,但是Ku等[24]指出角蛋白(Keratins)的磷酸化對其組裝可能有較大的影響,Feng等[25]發現酪蛋白磷酸化能對角蛋白起總體修飾作用。

綿羊KAP11-1基因的核苷酸序列變異可能會影響表達、蛋白質磷酸化水平及其結構,最終可能會影響羊毛的質量或產量等毛用性狀,但因缺乏表型數據,有關KAP11-1基因與綿羊毛用性狀的相關性分析有待進一步研究。

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Nucleotide Sequence Variations ofKAP11-1 Gene in 5 Chinese Sheep Populations

ZHU Jianxun,WANG Jiqing,HU Jiang,LIU Xiu,LI Shaobin,YAN Wei,LUO Yuzhu

(College of Animal Science and Technology,Gansu Agricultural University,Gansu Key Laboratory of Herbivorous Animal Biotechnology,Lanzhou 730070,China)

In order to analyze sequence variations ofKAP11-1 gene,single nucleotide polymorphisms (SNPs) of Oula sheep,Gansu Alpine Merino,Tan sheep,Hu sheep and Qinghai merino sheep (a total of 749 individuals) were detected using PCR-SSCP and DNA sequencing techniques in this study.Population genetics characteristics such as allele frequency,genetic heterozygosity,effective number of alleles and polymorphism information content (PIC) were analyzed simultaneously.The results suggested that four SNPs (c.93C/T,c.240G/A,c.285C/G/A and c.331A/G) inKAP11-1 gene of 5 sheep populations were discovered,and c.331A/G was non-synonymous substitution.Allele Aexhibited the highest frequency (87.70%) among five sheep populations,and it was the most common allele,allele B was the next common with the allele frequency of 11.03%,the frequency of allele C and D were the lowest,which were 0.53% and 0.74% respectively.Population genetics results showed that heterozygosity,effective number of alleles and polymorphic information content of Tan sheep were higher than those of another four sheep populations.KAP11-1 gene is one of the major candidate genes of wool economic traits.The nucleotide sequence variations ofKAP11-1 gene will lead to amino acid changes of KAP11-1,then eventually affect wool fibre structure and wool economic traits.

Sheep;KAP11-1 gene;Nucleotide sequence variations;PCR-SSCP;Single nucleotide polymorphism

2016-06-16

甘肅省創新研究群體計劃項目(1210RJIA005);國際科技合作與交流項目(2011DFG33310);甘肅省高校基本科研業務費項目;甘肅農業大學自列課題

朱建勛(1988-),男,甘肅通渭人,碩士,主要從事動物遺傳育種與牛羊生產系統研究。

羅玉柱(1962-),男,甘肅景泰人,教授,博士，博士生導師,主要從事現代生物技術與動物育種應用研究。

Q78;S826

A

1000-7091(2016)05-0101-07

10.7668/hbnxb.2016.05.015