肥料類型及施用方式對香稻香氣2-乙酰-1-吡咯啉含量的影響

莫釗文,范平珊,潘圣剛,王在滿,田 華,段美洋,唐湘如

(1.華南農業大學 農學院,廣東 廣州 510642;2.農業部華南地區作物栽培科學觀測實驗站,廣東 廣州 510642;3.華南農業大學 工程學院,廣東 廣州 510642)

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肥料類型及施用方式對香稻香氣2-乙酰-1-吡咯啉含量的影響

莫釗文1,2,范平珊1,潘圣剛1,2,王在滿3,田 華1,2,段美洋1,2,唐湘如1,2

(1.華南農業大學 農學院,廣東 廣州 510642;2.農業部華南地區作物栽培科學觀測實驗站,廣東 廣州 510642;3.華南農業大學 工程學院,廣東 廣州 510642)

為了探明肥料類型及施用方式對香稻香氣2-乙酰-1-吡咯啉的影響及其生理基礎的影響,以大面積推廣應用的香稻品種玉香油占為研究材料開展大田試驗。試驗設置深施肥和常規手撒施肥2種施肥方式處理,施用碳酸氫銨+過磷酸鈣+氯化鉀處理和復合肥處理2種肥料類型處理,各肥料處理均含有等質量的氮磷鉀養分。研究了香稻成熟期籽粒香氣2AP的含量,分蘗期、孕穗期、揚花期和成熟期香稻葉片的脯氨酸含量、脯氨酸脫氫酶活性、吡咯啉-5-羧酸合成酶活性、鳥氨酸轉氨酶活性和吡咯啉-5-羧酸含量。結果表明,肥料類型、肥料施用方式和兩者互作均顯著影響香稻籽粒香氣2AP含量,其中常規手撒施用碳酸氫銨+過磷酸鈣+氯化鉀肥料處理利于香稻籽粒積累顯著較高的香氣2AP含量,達59.86 ng/g;香稻籽粒香氣2AP含量和成熟期葉片的吡咯啉-5-羧酸含量呈顯著正相關關系(r=0.957 1*)。該研究可為制定香稻濃香施肥技術提供理論參考依據。

肥料類型;施肥方式;香稻;2-乙酰-1-吡咯啉;生理基礎

香稻是稻中珍品,香稻因其具有濃郁香味而深受青睞[1-2]。米香作為衡量水稻稻米品質的一個重要經濟評價指標[3],米香濃郁與否對香米價值影響較大[4]。香米銷售價格和消費量在逐年提高[2],科研人員也越來越重視香稻的資源、育種和栽培技術等多方面的研究,以致力于提高香米香味和產量[5-18]。

香稻稻米香味是衡量香稻稻米品質的1個重要經濟評價指標,大量的研究表明,2-乙酰-1-吡咯啉(2AP)是香稻米香的主要特征物質[19-26]。研究表明,香稻香氣特征物質(2-乙酰基-1-吡咯啉)的可能合成途徑為:以脯氨酸、谷氨酸和鳥氨酸為前體物質,分別在脯氨酸脫氫酶、吡咯啉-5-羧酸合成酶和鳥氨酸轉氨酶的催化作用下形成吡咯啉-5-羧酸,最后形成2AP[13,26-30]。香稻香氣2AP的形成響應不同的環境影響表現復雜[31-32]。已有的研究分析對香稻香氣2AP積累的影響因素及其生理基礎,主要從溫度[33-35]、水分[36-39]、氮[39-42]、鉀[43]、微量元素[40,44-51]、光照[35,52]、生長調節物質[53-55]、栽植密度和收獲時期[31]等方面開展。目前,肥料類型和施肥方式對香稻香氣2AP含量及其形成生理基礎的影響研究鮮有報道。為了探明肥料類型及施用方式對香稻香氣2-乙酰-1-吡咯啉的影響及其生理基礎,本試驗設置深施肥和常規手撒施肥2種施肥方式處理,施用碳酸氫銨+過磷酸鈣+氯化鉀處理和復合肥處理2種肥料類型處理,各肥料處理均含有等質量的氮磷鉀養分。研究了香稻成熟期籽粒香氣2AP的含量,分蘗期、孕穗期、揚花期和成熟期香稻葉片的脯氨酸含量、脯氨酸脫氫酶活性、吡咯啉-5-羧酸合成酶活性、鳥氨酸轉氨酶活性和吡咯啉-5-羧酸含量。

1 材料和方法

1.1 試驗概況與設置

以大面積推廣種植的香稻品種玉香油占為試材,試驗于2014年在華南農業大學農學院教學實驗農場進行,試驗田的土壤理化性質為:有機質21.6 g/kg,全氮為1.11 g/kg,全磷1.18 g/kg,全鉀20.96 g/kg,堿解氮145.38 mg/kg,有效磷74.37 mg/kg,有效鉀81.58 mg/kg,pH值5.44。

香稻種植采用機械穴播方式,水稻穴播機具由華南農業大學研制,播種量為15 kg/hm2,穴播的密度為寬行∶窄行∶株距=35∶15∶15。供試肥料為挪威復合肥(N∶P∶K=15%∶15%∶15%),碳酸氫銨(N 16.7%)、過磷酸鈣(P2O512%)、氯化鉀(K2O 60%)。試驗設置2種肥料類型即碳酸氫銨+過磷酸鈣+氯化鉀(F1)和復合肥(F2),各施肥處理的肥料量均為純氮150 kg/hm2、P2O5150 kg/hm2、K2O 150 kg/hm2。2種施肥方式即深施肥和常規手撒施肥;常規手撒施肥方式處理(M1)為香稻齊苗后采用人工手撒表面施肥法施肥;深施肥處理(M2)的肥料隨水稻播種1次性施入,為水稻植株根旁側位施肥法,施肥深度約為10 cm。小區面積為5×11 m2,3次重復,小區間設置保護行,于3月23日播種,7月9日收獲,施用化學農藥除草劑進行病蟲草防治,大田管理措施均保持一致。

1.2 測定指標與方法

1.2.1 樣品采集 于分蘗期、孕穗期、揚花期和成熟期選取生長一致的代表性植株4蔸帶回實驗室。剪下水稻植株上3片完全展開葉,用液氮固定后保存于-80 ℃用以測定生理指標(脯氨酸含量、脯氨酸脫氫酶、吡咯啉-5-羧酸合成酶、鳥氨酸轉氨酶、吡咯啉-5-羧酸);成熟期取籽粒儲存于-20 ℃用以測定香氣2AP含量。

1.2.2 香稻籽粒香氣2AP含量的測定 稱取約10 g籽粒樣品進行2AP的提取,測定前籽粒用研缽磨碎待測。參考黃忠林等[5]的方法,利用同時蒸餾萃取儀進行蒸餾萃取;采用島津GC-MS QP 2010 plus進行2AP含量測定,GCMS條件:色譜柱為RESTEK Rxi-5ms 長度30 m,內徑0.32 mm,膜厚0.25 μm,進樣口溫度220 ℃,載氣為He 2 mL/min,掃描質量為30～160 m/z,升溫程序為40 ℃保持1 min,以2 ℃/min升溫到65 ℃保持1 min,以10 ℃/min升溫到220 ℃保持10 min。

1.2.3 香稻香氣2AP形成生理特性的測定 脯氨酸含量的測定參考Bates等[56]的方法,脯氨酸含量單位為μg/g(以鮮質量計) 。脯氨酸脫氫酶活性的測定參考Ncube 等[57]的方法,酶活性單位為U/g(以鮮質量計)。吡咯啉-5-羧酸合成酶活性的測定參考Sánchez等[58]的方法,酶活性單位為U/g(以鮮質量計)。鳥氨酸轉氨酶活性的測定參考Chen等[59]的方法,酶活性單位為U/g(以鮮質量計)。吡咯啉-5-羧酸含量的測定參考Wu等[60]的方法,吡咯啉-5-羧酸含量單位為μmol/g(以鮮質量計)。

1.3 數據處理和統計分析

使用Microsoft Office 2010 進行數據整理,并采用Statistic Version 8對數據進行方差分析和相關性分析,多重比較采用最小極顯著差異法(LSD)進行,使用SigmaPlot進行繪圖。

2 結果與分析

2.1 不同施肥方式和肥料類型對香稻籽粒香氣2AP含量的影響

圖1表明,肥料類型(F)、肥料施用方式(M)和兩者互作(F×M)均極顯著影響香稻籽粒香氣2AP含量。對于手撒施肥而言,碳酸氫銨+過磷酸鈣+氯化鉀處理較復合肥有顯著較高的籽粒香氣2AP含量為59.86 ng/g;對于深施肥而言,2種肥料類型的籽粒香氣2AP含量無顯著差異。

2.2 不同施肥方式和肥料類型對香稻葉片香氣形成生理特性的影響

2.2.1 葉片脯氨酸含量 表1表明,在常規手撒施肥方式下,2種類型肥料處理對香稻葉片脯氨酸含量均無顯著影響;在深施肥條件下,施用復合肥料利

于香稻分蘗期和孕穗期提高葉片脯氨酸含量,對揚花期和成熟期對香稻葉片脯氨酸含量均無顯著影響。就均值而言,2種肥料施用方式下各時期的香稻葉片脯氨酸含量均無顯著影響。

**.F值達P<0.01顯著水平;不同小寫字母表示不同施肥方式和肥料類型處理間差異達P<0.05水平。

**.Fvalue atP<0.01 level;Different low case letters represent significant difference atP<0.05 between different fertilizer types and fertilization methods treatments.

圖1 不同肥料類型和施肥方式對香稻籽粒香氣2AP含量的影響

注:同一列數據不同小寫字母表示不同施肥方式和肥料類型處理間差異達P<0.05水平。表2-5同。

Note:Different lowercase letters within the same column represent significant difference atP<0.05 between different fertilizer types and fertilization methods treatments.The same as Tab.2-5.

2.2.2 葉片脯氨酸脫氫酶活性 由表2可知,在常規手撒施肥方式下,復合肥處理顯著提高孕穗期和揚花期香稻葉片脯氨酸脫氫酶活性,對分蘗期和成熟期香稻葉片脯氨酸脫氫酶活性無顯著影響;在深施肥條件下,復合肥處理則顯著降低了孕穗期香稻葉片脯氨酸脫氫酶活性,對分蘗期、揚花期和成熟期香稻葉片脯氨酸脫氫酶活性無顯著影響。就均值而言,2種肥料施用方式下各時期的香稻葉片脯氨酸脫氫酶活性均無顯著影響。

表2 不同肥料類型和施肥方式對香稻葉片脯氨酸脫氫酶活性的影響

Tab.2 Effect of fertilizer types and fertilization methods on proline dehydrogenase activity in leaves of aromatic rice

U/g

2.2.3 葉片吡咯啉-5-羧酸合成酶活性 表3表明,在常規手撒施肥方式或深施肥方式下,2種類型肥料處理對香稻葉片吡咯啉-5-羧酸合成酶活性均無顯著影響;就均值而言,常規手撒施肥方式較深施肥方式顯著提高了孕穗期香稻葉片吡咯啉-5-羧酸合成酶活性。

表3 不同肥料類型和施肥方式對香稻葉片吡咯啉5羧酸合成酶活性的影響

注：不同施肥方式均值間標*號表示差異達P<0.05水平。表5同。

Note:*represent significant difference atP<0.05 between different fertilization methods treatments.The same as Tab.5.

2.2.4 葉片吡咯啉-5-羧酸含量 表4表明,在常規手撒施肥方式或深施肥方式下,2種類型肥料處理對香稻葉片吡咯啉-5-羧酸合成酶活性均無顯著影響;就均值而言,2種肥料施用方式下各時期的香稻葉片脯氨酸脫氫酶活性均無顯著影響。

表4 不同肥料類型和施肥方式對香稻葉片吡咯啉-5-羧酸含量的影響

2.2.5 葉片鳥氨酸轉氨酶活性 由表5可見,在常規手撒施肥方式下,2種類型肥料處理對香稻葉片鳥氨酸轉氨酶活性均無顯著影響;在深施肥條件下,碳酸氫銨+過磷酸鈣+氯化鉀處理顯著提高了孕穗期香稻葉片鳥氨酸轉氨酶活性,對其余時期的葉片鳥氨酸轉氨酶活性均無顯著影響。就均值而言,常規手撒施肥方式較深施肥方式顯著降低了孕穗期和揚花期香稻葉片鳥氨酸轉氨酶活性。

表5 不同肥料類型和施肥方式對香稻葉片鳥氨酸轉氨酶活性的影響

2.3 相關性分析

對籽粒香氣2AP含量和葉片各時期香氣形成生理特性進行相關性分析,結果表明,僅成熟期葉片吡咯啉-5-羧酸含量(以鮮質量計)和籽粒香氣2AP含量呈顯著正相關關系(圖2)。

*.P<0.05顯著水平。

3 討論與結論

本試驗中,香稻籽粒香氣對2種肥料類型的響應在2種肥料施用方式下表現具有差異,具體表現為香稻籽粒香氣2AP含量受肥料類型(F)、肥料施用方式(M)和兩者互作(F×M)的極顯著影響；肥料類型和肥料施用方式互作處理中以常規手撒施肥方式施用碳酸氫銨+過磷酸鈣+氯化鉀處理的2AP含量顯著最高，達59.86 ng/g；其他3種肥料類型和肥料施用方式互作處理的香稻籽粒香氣2AP含量相當。

為了探明肥料類型和肥料施用方式處理下香稻香氣特征物質(2-乙酰基-1-吡咯啉)的可能合成途徑，針對香氣2AP形成以脯氨酸、谷氨酸、鳥氨酸和吡咯啉-5-羧酸為前體物質，以脯氨酸脫氫酶、吡咯啉-5-羧酸合成酶和鳥氨酸轉氨酶為催化作用的關鍵酶的觀點[13,26-30]，分析并明確肥料類型和肥料施用方式處理下2AP形成關鍵的生理因素。本試驗對香稻香氣2AP形成生理特性(分蘗期、孕穗期、揚花期和成熟期香稻葉片的脯氨酸含量、脯氨酸脫氫酶活性、吡咯啉-5-羧酸合成酶活性、鳥氨酸轉氨酶活性和吡咯啉-5-羧酸含量)進行研究。①就常規手撒施肥方式而言,復合肥處理顯著提高孕穗期和揚花期香稻葉片脯氨酸脫氫酶活性,推測采用常規手撒施肥方式施用碳酸氫銨+過磷酸鈣+氯化鉀處理具有顯著較高的2AP含量的原因是:香稻葉片各時期的吡咯啉-5-羧酸合成酶活性、鳥氨酸轉氨酶活性和吡咯啉-5-羧酸含量維持較高水平。②就深施肥方式而言,施用復合肥料處理利于香稻分蘗期和孕穗期提高葉片脯氨酸含量,施用碳酸氫銨+過磷酸鈣+氯化鉀處理顯著提高了孕穗期香稻葉片的脯氨酸脫氫酶活性和鳥氨酸轉氨酶活性,推測認為,在深施肥方式下,施用復合肥料處理主要通過維持葉片較高的脯氨酸含量、吡咯啉-5-羧酸合成酶活性和吡咯啉-5-羧酸含量,保證了籽粒較高的2AP含量;而施用碳酸氫銨+過磷酸鈣+氯化鉀處理則通過維持葉片較高的脯氨酸脫氫酶活性、吡咯啉-5-羧酸合成酶活性、鳥氨酸轉氨酶活性和吡咯啉-5-羧酸含量;保證了籽粒較高的2AP含量。③就2個施肥方式比較而言,常規手撒施肥方式較深施肥方式顯著提高了孕穗期香稻葉片的吡咯啉-5-羧酸合成酶活性,顯著降低了孕穗期和揚花期香稻葉片的鳥氨酸轉氨酶活性,并且,成熟期籽粒2AP含量和成熟期葉片吡咯啉-5-羧酸含量呈顯著正相關關系,表明,香稻葉片較高的脯氨酸脫氫酶活性、吡咯啉-5-羧酸合成酶活性促使了較高的吡咯啉-5-羧酸含量的形成積累,最終促使了香稻成熟籽粒積累較高的2AP含量。有研究表明,脯氨酸是2AP形成的重要前體物質[27-28,61-63];Schieberle[1]研究發現,增加脯氨酸和鳥氨酸均能提高2AP,表明2AP形成源于脯氨酸和鳥氨酸;Yoshihashi 等[64]研究表明，2AP的氮源來自脯氨酸和谷氨酸,并認為脯氨酸是2AP合成的主要前體物質,其次為谷氨酸和鳥氨酸;再者,控制脯氨酸代謝的關鍵酶脯氨酸脫氫酶、吡咯啉-5-羧酸合成酶和鳥氨酸轉氨酶活性的變化[65];并且上調吡咯啉-5-羧酸合成酶水平促進吡咯啉-5-羧酸含量的增加,可以提高香氣2AP的含量,因此,吡咯啉-5-羧酸含量水平與吡咯啉-5-羧酸脫氫酶活性直接相關,吡咯啉-5-羧酸是2AP的主要前體物質[28]。綜合本試驗的分析及前人的研究結果,筆者認為肥料類型及其施用方式對香稻籽粒香氣2AP積累影響是以谷氨酸在吡咯啉-5-羧酸合成酶催化作用下形成吡咯啉-5-羧酸進而形成2AP為基本保證,在不同的處理通過脯氨酸含量、脯氨酸脫氫酶活性和鳥氨酸轉氨酶活性的變化來維持吡咯啉-5-羧酸含量在系統中的動態平衡。

本試驗條件下,肥料類型、肥料施用方式和兩者互作均顯著影響香稻籽粒香氣2AP含量,手撒碳酸氫銨肥料利于機械穴直播香稻成熟籽粒積累較高的2AP含量。但是,由于施肥量也有可能影響香稻香氣2AP的積累,因此,不同肥料類型、施肥技術以及施肥量均需綜合考慮,這樣對于施肥技術和肥料類型的選擇及其應用才具有更現實的指導作用,這也是未來需要討論和研究的內容。

綜上表明,肥料類型、肥料施用方式和兩者互作均顯著影響香稻籽粒香氣2AP含量,其中手撒施用碳銨肥料利于香稻籽粒積累顯著較高的香氣2AP含量;香稻籽粒香氣2AP含量和成熟期葉片的吡咯啉-5-羧酸含量呈顯著正相關關系。進一步結合肥料類型、施肥技術以及施肥量來開展研究,對于香稻的增香施肥具有重要的現實意義。

致謝:華南農業大學農學院翁健聰和牟之健等同學參加了本研究的部分工作,在此一并致謝。

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Effect of Fertilizer Types and Fertilization Methods on 2-acetyl-1-pyrroline Content in Aromatic Rice

MO Zhaowen1,2,FAN Pingshan1,PAN Shenggang1,2,WANG Zaiman3,TIAN Hua1,2,DUAN Meiyang1,2,TANG Xiangru1,2

(1.College of Agriculture,South China Agricultural University,Guangzhou 510642,China;2.Scientific Observing and Experimental Station of Crop Cultivation in South China,Ministry of Agriculture,P.R.China,Guangzhou 510642,China;3.College of Engineering,South China Agricultural University,Guangzhou 510642,China)

In order to explore the impact of fertilizer types and fertilization methods on 2-acetyl-1-pyrroline(2AP) content in aromatic rice and its physiological characters,the widely used and popular aromatic rice cultivar,Yuxiangyouzhan was used as material in the field trials.The experiment consisted of two fertilization methods i.e.deep application of fertilizer and manual application of fertilizer,and two fertilizer types i.e.the chemical fertilizer ammonium bicarbonate+calciumsuperphosphate+potassium chloride and the compound fertilizer,the nutrient(NPK) content in each treatment with equal quality.The 2AP content in mature grain as well as the proline content,proline dehydrogenase activity,pyrroline-5-carboxylate synthetase activity,ornithine aminotransferase activity and pyrroline-5-carboxylate acid content in leaves at tillering stage,booting stage,flowering stage and maturity were measured.The results showed that fertilizer types,fertilization methods and their interaction significantly affected the 2AP content in mature grains.The manual application of ammonium bicarbonate+calciumsuperphosphate+potassium chloride had the highest 2AP content in mature grains(59.86 ng/g).And the 2AP content in mature grains was in positive correlation with pyrroline-5-carboxylate acid content in leaves at maturity significantly(r=0.957 1*).The results provide theoretical reference for the development of scented rice fertilization technology.

Fertilizers type;Fertilization methods;Aromatic rice;2-acetyl-1-pyrroline;Physiological basis

2016-06-20

國家自然科學基金項目(31271646)

莫釗文(1986-),男,廣東懷集人,博士,主要從事作物栽培與生理研究。莫釗文、范平珊為同等貢獻作者。

唐湘如(1964-),男,湖南寧鄉人,博士,教授,博士生導師,主要從事作物栽培與生理研究。

S511;S223

A

1000-7091(2016)05-0152-07

10.7668/hbnxb.2016.05.023