淺談淀粉樣變性腎病的染色方法體會

朱淑玲

【摘要】 目的 探討淀粉樣變性腎病的染色方法及體會。方法 對15例淀粉樣變性腎病患者的活檢標本進行常規染色、剛果紅、高錳酸鉀氧化剛果紅染色后以偏振光顯微鏡觀察， 同時予以免疫熒光、免疫組化染色， 使用透視電鏡觀察， 分析淀粉樣變性腎病的染色方法及效果。結果 15例標本可見淀粉樣蛋白沉積區HE呈均質、淡染的嗜伊紅狀， PASM染色呈毛刷樣結構， 剛果紅染色呈磚紅色、偏振光下呈青綠色。免疫組化染色中AA染色均為陰性， κ染色顯示14例為陰性， λ染色顯示14例為陽性。電鏡下觀察有纖維狀結構且排列紊亂。結論 對淀粉樣變性腎病需采用多種染色方法結合效果較好， 使用堿性剛果紅染色較為便利使用， 使用免疫組化染色后透視電鏡觀察有助于發現早期不典型病變。

【關鍵詞】 淀粉樣變性腎?。徊±砑夹g；染色方法

DOI：10.14163/j.cnki.11-5547/r.2016.05.088

腎臟是淀粉樣變性常見的受累器官， 約占腎活檢的1.25%， 多發生于年齡在50歲以上的老年人群中。淀粉樣變性腎病是指淀粉纖維大量沉積于腎臟引起的病變， 隨著我國人口老齡化的進程不斷加快， 其發病率也呈逐年上升的趨勢[1]。而關于淀粉樣變性腎病的診斷率一直較低， 確診率低， 更需要探尋更佳的病理技術進行診斷。本文主要探討淀粉樣變性腎病的染色方法及體會， 旨在提高病理技術， 報告如下。

1 資料與方法

1. 1 一般資料 選取本院2012年3月～2014年12月收治的淀粉樣變性腎病患者的活檢標本共15例作為本次實驗的實驗標本。

1. 2 方法

1. 2. 1 對15例標本進行常規染色及特殊染色。①標本的常規處理。首先使用10%福爾馬林進行固定， 并給予梯度酒精脫水， 每個步驟進行30 min， 使用二甲苯透明10 min×2， 給予60℃浸蠟后進行石蠟包埋。切片厚度為5 μm， 并置于45℃水浴展開， 干燥時間為20 min。脫蠟至水。②染色配置分別為：HE、儲備液、堿性工作液、堿性剛果紅工作液、酸性高錳酸鉀溶液、5%草酸溶液。③堿性剛果紅染色方法：使用mayer氏蘇木素液進行內染色10 min后蒸餾水洗， 給予鹽酸乙醇分化再用蒸餾水洗， 隨后放入到堿性工作液內進行染色20 min， 再放入堿性剛果紅工作液內20 min， 進行無水乙醇三次脫水， 二甲苯透明后固封。④酸性高錳酸鉀氧化剛果紅染色。

1. 2. 2 免疫組織化學染色。首先對標本進行常規處理， 包括對標本進行固定、以石蠟包埋、冰凍切片、脫蠟至水、抗原修復并TBS洗5 min×3。再利用3%雙氧水阻斷內源性過氧化物酶， TBS洗5 min×3。其次， 進行抗體顏色， 使用抗鼠抗人淀粉樣蛋白A、兔抗人輕鏈蛋白κ、兔抗人清點蛋白λ， 孵育1 h；TBS洗5 min×3；滴入EnVision， TBS洗5 min后加色源底物DAB。使用蒸餾水漂洗， 進行蘇木素的對比顏色， 封片， 觀察。標本使用偏振光顯微鏡觀察和透視電鏡觀察。

2 結果

2. 1 15例淀粉樣變性腎病患者的標本通過HE切片可以觀察到特殊蛋白沉淀， 出現腎小球的局部階段性均質粉染， 且無結構；部分標本小動脈壁也有特殊蛋白的沉淀。通過PAS染色顯示為紅色；Masson染色為9例淺綠色、6例粉色；PASM套染Masson染色為灰綠。堿性剛果紅染色出現15例陽性， 光鏡下觀察有腎小球系膜區域和毛細血管壁， 小動脈有磚紅色團塊， 使用偏振光鏡檢查為蘋果綠。使用酸性高錳酸鉀氧化處理后標本仍均為陽性。

2. 2 免疫組化染色中， AA染色均為陰性， κ染色顯示14例為陰性， λ染色顯示14例為陽性。電鏡下觀察有纖維狀結構且排列紊亂。κ染色、λ染色陽性表現為小動脈壁、毛細血管壁和（或）腎小球系膜區有團塊沉淀， 直徑為9 nm左右， 且無分支。

3 討論

淀粉樣變性主要可以分為兩種， 即局灶性和系統性淀粉樣變性， 系統性淀粉樣變性主要包括血清淀粉樣物質、免疫球蛋白輕鏈、衰老性、家族性的淀粉樣變性以及透析性的淀粉樣變性；局灶性淀粉樣變性主要包括快速性進展相關的疾?。搜挪〉龋?、帕金斯病以及局灶的免疫球蛋白輕鏈淀粉樣變性。

近年來， 隨著免疫和分子生物學的進展， 臨床上對淀粉樣變性腎病已有較為清晰的認識， 關于淀粉樣蛋白的檢驗技術日趨先進[2]。而對淀粉樣病變的生化研究也分離出17種， 其中以輕鏈蛋白最為常見， 其次為淀粉樣蛋白A。

HE染色是光鏡檢查腎標本中必備的染色方法之一， 能充分顯示腎小管上皮細胞的損傷和炎細胞浸潤程度， 還能顯示腎小球的細胞增生情況[3]。PAS染色不僅具有HE染色的功能， 同時還能很好的顯示基底膜， 辨別內皮細胞、系膜細胞和上皮細胞， 可使檢測者了解基底膜增生情況和毛細血管塌陷情況。PASM染色能清晰的觀察到腎小球各種細胞及免疫復合物的成分和沉積情況， 并能幫助判別膜性腎病、淀粉樣腎病、膜增生性腎小球腎炎[4]。Masson染色較為繁瑣， 但染色效果較好， 可區分腎間質水腫和腎間質纖維化， 顯示腎小球內沉積或聚集的IC或其他血漿蛋白成分。剛果紅主要是觀察腎淀粉樣變性腎病， 染色方法簡單[5， 6]。

在以往的臨床研究中， 免疫組化法一直較多被用于診斷AA型， 并取得較好的效果， 但在診斷AL型時可能會發生輕鏈斷裂的現象， 導致部分抗原決定簇缺失， 對抗體無任何反應， 出現誤診。因此， 在檢測時可應用多種抗體進行免疫組化染色， 將輕鏈蛋白、淀粉樣蛋白A聯合使用， 使得診斷更為準確。

而在病理染色的過程中本研究認為， 堿性剛果紅染色出15例陽性， 且沒有過多的分化步驟， 不會因為過度分化導致染色結果受到影響， 因此更為可靠， 加之使用偏振光顯微鏡使用， 可信度較高。但免疫組化染色使用透視電鏡觀察， 可以更好地發現淀粉樣纖維， 對剛果紅染色不明顯的標本可以做補充觀察。

綜上所述， 對淀粉樣變性腎病需采用多種染色方法結合效果較好， 使用堿性剛果紅染色較為便利， 使用免疫組化染色后透視光鏡觀察有助于發現早期不典型病變。

參考文獻

[1] 張燕， 陳劍， 劉海靜， 等.石蠟切片免疫熒光法在腎病穿刺組織中的應用.北京大學學報（醫學版）， 2011， 43（6）：900-902.

[2] 李敏， 姚梅宏， 曾玲， 等. PASM-Masson染色法在腎穿刺活檢特殊染色中的應用與體會.臨床與實驗病理學雜志， 2014， 30（6）：693-694.

[3] 呂增華， 張楊楊， 朱玉紅， 等.腎穿刺活檢六胺銀染色套染Masson染色方法的改良.臨床與實驗病理學雜志， 2012， 28（11）：1289-1290.

[4] 郭海旺. HE染色和雙酶染色觀察大鼠腎的脈管構筑特點.中國美容醫學， 2012， 21（z2）：47-48.

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[6] 黃燕鳳， 蘇菁， 王海萍， 等.六胺銀加馬松三色雙重染色在腎穿刺活檢組織中的應用.中國基層醫藥， 2012， 19（14）：2183-2184.

[收稿日期：2015-10-29]