輻照殺菌全蛋液貯藏期間抗氧化物活性及過敏源特性變化分析

戴 妍，韓兆鵬，范 蓓，盧 嘉，盧曉明

（1.北京德青源農業科技股份有限公司，北京 102115；2.中國農業科學院原子能利用研究所，北京 100193）

輻照殺菌全蛋液貯藏期間抗氧化物活性及過敏源特性變化分析

戴 妍1，韓兆鵬1，范 蓓2，盧 嘉2，*盧曉明1

（1.北京德青源農業科技股份有限公司，北京 102115；2.中國農業科學院原子能利用研究所，北京 100193）

研究了對照組、巴氏殺菌組和輻照殺菌處理組（2，4，6 kGr）對4℃貯藏期間（0，10，20 d）全蛋液抗氧化物活性及卵白蛋白過敏源特性變化影響，抗氧化物活性指標包括羥自由基清除能力、DPPH自由基抑制率和還原力等指標。結果顯示，輻照殺菌處理組（2，4，6 kGr）全蛋液在第10天時DPPH自由基和羥自由基抑制率顯著高于對照處理組（p＜0.05）；第0天和第20天輻照殺菌2 kGr處理組巰基含量與對照組和巴氏殺菌處理組之間無顯著差異（p＞0.05）；SDS-PAGE和Western-blot結果表明，貯藏期間輻照殺菌處理并沒破壞全蛋液中重要過敏源——卵白蛋白。

輻照殺菌；DPPH自由基抑制率；羥自由基清除能力；過敏源；全蛋液

0 引言

食品輻照殺菌（Food irradiation sterilization）——“冷巴氏殺菌”技術是指經一定劑量電離射線60Coγ或137Csγ射線或電子加速器產生的電子束（最大能量10 Mev） 或X射線（最大能量5 Mev）的輻照，殺滅食品中的害蟲，消除食品中的病原微生物及其他腐敗細菌或抑制某些食品中的生物活性和生理過程，從而達到延長食品保質期或達到食品保鮮的目的［1］。現在已經證明，食品輻照殺菌技術是一種有效安全的食品加工方法［2］。自20世紀80年代以來，食品輻照殺菌技術已被成功地應用于殺滅香辛料、鮮蔬食品、冷凍蝦、糧食、畜產品中的微生物等［2-7］。

液蛋產品是將新鮮雞蛋去殼，經過加工處理包裝后的蛋制品總稱［8］。目前，液態蛋殺菌通常采用巴氏殺菌方式，這種殺菌方式會使蛋液中的營養成分和功能特性被破壞，而且并不能有效抑制微生物的污染［9］。黃小波等人［4］認為，全蛋液采用0.4～0.6 kGr劑量輻照殺菌處理，能夠在0～4℃條件下延長全蛋液保鮮期；采用0.4 kGr劑量的輻照殺菌技術處理，對蛋清蛋白液各項理化指標影響不大［3］。食品過敏特性及抗氧化特性是影響食品品質和安全的重要因素，雞蛋、牛奶以及堅果類等是食品原料中主要的過敏源，容易引發人體不良反應［10］。國內外研究表明，食品中的抗氧化物對控制食品酸敗產生、延遲有毒氧化物生成、維持營養品質以及延長食品的貨架期［11］發揮了重要的作用。

目前，國內外學者研究高密度CO2殺菌處理對蛋白液抗氧化物活性和過敏特性的影響仍屬空白。通過設計一組試驗，分別對全蛋液進行如下處理：對照組（不經過任何殺菌處理）；巴氏殺菌（66℃殺菌3.5 min） 處理；輻照處理采用60Coγ輻射源，輻照劑量分別設為2，4，6 kGr。處理完畢后，將蛋液在4℃條件下貯藏，對0，10，20 d的全蛋液抗氧化特性及過敏特性變化進行初步分析。

1 材料與方法

1.1 試劑及儀器

三羥甲基氨基甲烷、5，5-二硫二硝基苯甲酸、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼、十二烷基硫酸鈉、丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺、甘氨酸、過硫酸銨、N，N，N'，N'-四甲基乙二胺、甘油、β-巰基乙醇、溴酚藍、考馬斯亮藍R-250、DPPH、吐溫-20、雞卵白蛋白（Ovalbumin）抗體、AP-IgG兔抗雞抗體（Amresco，美國）；Urea（Sigma，美國）；lowery蛋白試劑盒、BCIP試劑盒，以及牛血清白蛋白BSA等購于北京索來寶公司；其他試劑均為分析純。

電子天平；Shimadzu UV-1780型紫外可見分光光度計，日本島津產品；SL-Ⅲ型低溫層析冷柜、Eppendorf移液器，美國Eppendorf公司產品；XHF-D型勻漿機、H1850R型高速冷凍離心機、BG電泳儀以及轉印芯、硝酸纖維素膜，北京索來寶公司產品；Tocan gelation image system型凝膠成像儀，南京生物技術公司產品；TS-2型脫色搖床，金壇儀器有限公司產品；Biolabs P7710型蛋白Marker，北京百靈克公司產品。

1.2 試驗方法

1.2.1 原料處理

全蛋液：將殼蛋去殼后，倒入干凈的燒杯中，用XHF-D型勻漿器進行勻漿（以轉速3 000 r/min勻漿30 s），然后直接放入真空包裝袋中封口。對照組直接放入4℃冷柜中貯藏備用；巴氏殺菌處理組直接將包裝袋封口的全蛋液放入66℃水浴鍋，殺菌3.5 min后取出，冷卻到室溫，然后放入4℃冷柜中貯藏備用；輻照殺菌處理組將全蛋液（真空包裝）送至中國農業科學研究院輻照中心處理，采用60Coγ輻射源，用重鉻酸銀劑量計進行劑量跟蹤，輻照劑量設為2，4，6 kGr，每個處理組使用4份全蛋液樣品。處理后的樣品放入4℃冷柜中貯藏備用，取0，10，20 d的貯藏樣品進行相關指標的檢測分析［4，6］。

1.2.2 全蛋液樣品的游離巰基（-SH） 含量（Free sulfhydryl content） 分析［12］

全蛋液溶液（0.5 mg/mL） 與Tris-Gly緩沖液（0.086 mol Tris，0.09 mol/L Gly，0.04 mol/L EDTA，8 mol/L Urea）混合，10 000×g離心10 min（4℃），取上清液，測游離巰基（-SH）的含量：取2 mL上清液加入80 μL Ellman's試劑（4 mg/mL DTNB）后立即混勻，5 min后于412 nm處測吸光度。游離巰基的計算公式如下：

Free sulfhydryl content（-SH）=（73.53×A412）/C（μmol/g蛋白質）。

1.2.3 全蛋液樣品的羥自由基（·OH）清除能力（%）分析

羥自由基（·OH）清除能力的測定方法參考楊瑾等人［12］的方法，具體如下：全蛋液樣品蛋白質量濃度用蒸餾水稀釋至5 mg/mL，蛋白質量濃度用lowery蛋白試劑盒測試。將稀釋后的蛋液用南京建成羥自由基測定試劑盒進行羥自由基（·OH）清除能力（%）的分析，550 nm比色。

羥自由基（·OH）清除力（%）=［對照組OD-測定值OD/對照組OD］×100%.

1.2.4 全蛋液樣品的DPPH自由基抑制率分析

全蛋液樣品的DPPH自由基抑制率參考文獻［13］。全蛋液（0.10 g）迅速與3 mL 0.004%DPPH-乙醇溶液混合，振蕩搖勻。在室溫下放置30 min后，以無水乙醇為空白對照，于517 nm處測定吸光度。吸光度越小，代表其清除DPPH自由基能力越強。

1.2.5 全蛋液樣品的還原力分析

全蛋液樣品的蛋白質量濃度用蒸餾水稀釋至0.5 mg/mL，蛋白質量濃度用lowery蛋白試劑盒測試。取樣品溶液2 mL，加入 2 mL1%的K3（CN）6溶液，置于50℃的水浴鍋中反應80 min，迅速冷卻后離心（3000×g，10 min，20℃），取上清液2 mL，加入2 mL去離子水和0.5 mL質量分數為0.1%的FeCl3溶液，混合均勻后靜置60 min，于700 nm處測定吸光度。吸光度越大，說明樣品的還原力越強［14］。

1.2.6 全蛋液樣品過敏特性分析

特異性過敏源卵白蛋白（Ovalbumin） 的SDSPAGE以及Western blot分析：取全蛋液（0.5 g），加入20 mL蒸餾水，然后使用XHF-D型勻漿機攪拌。攪拌后的蛋液用lowery試劑盒進行蛋白質濃度分析。將全蛋液稀釋至質量濃度為1 mg/mL，然后進行SDS-PAGE分析。

SDS-PAGE采用的分離膠質量分數為12%，濃縮膠質量分數為4%。將全蛋液樣品按1∶5與樣品緩沖液（含有2%SDS，10%甘油，1%β-巰基乙醇，pH值為6.8的Tris-HCl以及0.05%溴酚蘭）混合，混合后的樣品液置于100℃沸水中加熱5 min。取大約含20 μg的蛋清蛋白液上樣（同時使用北京百靈克公司biolabs P7710蛋白marker做對照）。凝膠用小型的BG蛋白電泳儀做分離，采用恒流模式（30 mA）保持2.5 h后，取出凝膠，用硝酸纖維素膜進行BG轉印芯濕轉（轉移緩沖液：Tris 3.03 g，glycine 14.4 g，200 mL甲醇，用去離子水定容至1 L）。轉印電壓100 V濕轉2 h后，用TBST1清洗20 min（TBST1，每 500 mL TBS加入 0.5 mL Tween 20；TBS，Tris 1.211，NaCl 8.76 g，1 mol/L HCl調pH值至7.5，去離子水定容至1 L），用封閉液（TBS 50 mL，Tween 20 25 μL，BSA 1.5 g） 進行封閉。封閉后再用TBST1進行清洗，用封閉液1∶500稀釋1抗（Rabbit anti-ovalbumin），對硝酸纖維素薄膜進行室溫免疫（1 h），然后用TBST1進行清洗，在用封閉液1∶5 000稀釋的2抗AP-rabbit IgG室溫免疫1 h，最后用TBST2（Tris 3.03 g，NaCl 4.38 g，Tween 20 0.5 mL，用HCl調pH值為7.5，定容至500 mL）進行清洗，最后加入底物顯色劑BCIP試劑盒進行顯色與照相［15-16］。

1.2.7 數據處理

用SPSS 16.0數據分析軟件對各指標進行分析，Unpaired Student T-test用于分析各處理組全蛋液各指標顯著性差異（p＜0.05）。

2 結果與分析

2.1 全蛋液樣品游離巰基（-SH）含量分析

全蛋液貯藏期間游離巰基（-SH）含量變化見圖1。

圖1 全蛋液貯藏期間游離巰基（-SH）含量變化

在0～20 d貯藏期間，各處理組游離巰基（-SH）含量呈現先減少后增加的趨勢。對照組、輻照殺菌處理組（2，4，6 kGr）蛋液在第10天游離巰基（-SH）含量（5.48～8.14 μmol/g） 顯著低于（p＜0.05） 其他貯藏期間游離巰基（-SH）含量。當貯藏期達到第20天時，所有處理組游離巰基（-SH） 含量（18. 19～23.63 μmol/g）達到最大。本試驗的研究結論與劉文營［17］對蛋清蛋白液貯藏期間游離巰基的變化趨勢相吻合。

在10～20 d貯藏期間中，輻照殺菌 4 kGr和6 kGr處理組游離巰基（-SH） 含量分別為（5.48，19.97 μmol/g） 和（6.31，18.19 μmol/g） 顯著低于（p＜0.05） 巴氏殺菌處理組（11.88，23.63 μmol/g）。食品中蛋白質氧化可能伴隨著游離巰基（-SH）含量的減少［18］，由于輻照殺菌劑量高于2 kGr時，可能會導致全蛋液中蛋白質氧化加劇，蛋白質之間交聯程度增加，蛋白質發生更大強度的變性與水解等，使得全蛋液游離巰基（-SH）含量的顯著減少［4，17］。

2.2 全蛋液樣品羥自由基（·OH）清除率（%）分析

全蛋液貯藏期間羥自由基（·OH）清除率含量變化見圖2。

圖2 全蛋液貯藏期間羥自由基（·OH）清除率含量變化

游離羥基（·OH）的產生可能與生理和病理現象緊密相關。羥自由基（·OH）清除率越高，越容易抑制食品酸敗和細胞癌變的發生［19］。在0～20 d貯藏期間，各處理組羥自由基（·OH）清除率（%）呈現出相應減少的趨勢。原因可能是4℃貯藏期間全蛋液羥自由基抑（·OH）制作用弱于氧化作用，引起相應抗氧化活性能力的下降［19］。第0天時，對照組和巴氏殺菌處理組羥自由基（·OH）清除率（%）分別為79.29%和79.87%，顯著高于所有輻照殺菌處理組（2，4，6 kGr） （p＜0.05）。第10天時，輻照殺菌處理組（2，4，6 kGr）羥自由基（·OH）清除率顯著高于對照組（37.26%） 和巴氏殺菌處理組（37.50%） （p＜0.05）。第20天時，各組均無顯著性差別（p＞0.05）。對照組和巴氏殺菌處理組蛋液羥自由基（·OH）清除率下降較為明顯，試驗結果表明隨著貯藏時間的推移，對照組和巴氏殺菌處理組全蛋液中抗羥基氧化的能力可能在某種程度上低于輻照殺菌處理組。

2.3 全蛋液樣品DPPH自由基抑制率分析

全蛋液貯藏期間DPPH抑制率分析見圖3。

圖3 全蛋液貯藏期間DPPH抑制率分析

食物中DPPH自由基抑制率也是體現抗氧化活性的一個重要指標，DPPH吸光度的下降體現DPPH自由基抑制率的增強［20］。在0～20 d貯藏時間中，對照組、巴氏殺菌組、輻照殺菌處理組（2，4，6 kGr）蛋液樣品中DPPH抑制率呈現出先升高后下降的趨勢，這與Huang B等人［13］研究貯藏期豬肉的DPPH自由基變化趨勢一致。原因可能是由于貯藏期間全蛋液氧化作用弱于水解作用，能夠生成更多的DPPH自由基抑制產物［21］。第10天時，輻照殺菌處理組（2，4，6 kGr）DPPH自由基抑制率的吸光度達到最大值（0.53～0.57），顯著高于對照組。第20天時，所有處理組之間無明顯差別。

2.4 全蛋液樣品還原力分析

全蛋液貯藏期間還原力分析見圖4。

圖4 全蛋液貯藏期間還原力分析

還原力也是表征食品抗氧化活性的相關指標，食品中還原力吸光度越高，其抗氧化能力越強［20］。隨著貯藏時間的延長，所有樣品處理組還原力呈現出下降的趨勢。第20天，所有處理組樣品還原力值（0.45～0.47）顯著低于（p＜0.05）第0天同樣的樣品（0.63～0.65）；第0天，輻照殺菌6 kGr處理組還原力值（0.65）顯著高于（p＜0.05）對照組（0.63）。其余貯藏期各處理組無顯著差異。

圖5 貯藏期間對照組、巴氏處理組、輻照殺菌處理組（2，4，6 kGr）全蛋液電泳分析

圖6 貯藏期間對照組、巴氏處理組、輻照殺菌處理組（2，4，6 kGr）全蛋液Western-blot分析

2.5 全蛋液樣品過敏特性分析

貯藏期間對照組、巴氏殺菌組、輻照殺菌處理組（2，4，6 kGr）全蛋液電泳分析見圖5，貯藏期間對照組、巴氏殺菌組、輻照殺菌處理組（2，4，6 kGr）全蛋液Western-blot分析見圖6。

圖5和圖6分別表示對照組、巴氏殺菌組、輻照殺菌處理組（2，4，6 kGr）全蛋液SDS-PAGE和Western-blot分析。全蛋液蛋白質主要電泳條帶有4條，分子量分別為130，90，60，45 kDa，試驗結果與郝麗芳［22］研究的全蛋液主要蛋白質電泳條帶結果基本吻合。蛋液中的卵黏蛋白（250 kDa）、卵轉鐵蛋白（78kDa）、卵白蛋白（43 kDa）和溶菌酶（14.3 kDa）是前人所鑒定出的主要過敏源［23-25］，試驗全蛋液中鑒定出的過敏源可能為卵黏蛋白（250 kDa）、卵轉鐵蛋白（78 kDa）和卵白蛋白（43 kDa），而最為主要的過敏源蛋白質為卵白蛋白（Ovalbumin）。當貯藏天數超過10 d后，所有處理組全蛋液蛋白質的其他“雜”蛋白（＞80 kDa，＜40 kDa）也能夠為IgG抗體所識別，表明所有處理組蛋液過敏特性增強，貯藏期間所有處理組過敏源卵白蛋白（Ovalbumin；43 kDa）并未發生明顯變化。

3 結論

在4℃貯藏期間對照組、巴氏處理組以及輻照殺菌處理組（2，4，6 kGr）全蛋液清液游離巰基（-SH）含量與DPPH自由基抑制率呈現出升高的趨勢，而還原力和羥基（·OH）清除率（%）則出現了緩慢下降。第10天，輻照殺菌處理組（2，4，6 kGr）的羥自由基（·OH）清除率和DPPH自由基抑制率顯著高于（p＜0.05）對照組。輻照2 kGr殺菌處理組巰基含量略高于輻照4 kGr和6 kGr殺菌處理組，所有處理組過敏源卵白蛋白（Ovalbumin）過敏特性有抗原特性無顯著性差別，因此采用輻照殺菌技術并沒有破壞全蛋液中重要過敏源（卵白蛋白）。

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The Changes of Antioxidation Parameters and Antigenicity Characteristics of Ovalbumin in Refrigerated-Storage Liquid Whole Egg Samples During Irradiation Sterilization Treatments

DAI Yan1，HAN Zhaopeng1，FAN Bei2，LU Jia2，*LU Xiaoming1
（1.Beijing DQY Agricultural Technology Co.，Ltd.，Beijing 102115，China；2.Institute of Atomic Energy Use，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Beijing 100193，China）

In order to investigate the changes of antioxidant parameters and ovalbumin antigenicity characteristics of ovalbumin in whole liquid egg samples of control，pasteurization and irradiation sterilization（2，4，6 kGr） treatments during refrigerated storage at 4℃（0，10，20 days）for about 20 days，the antioxidant parameters include free sulfhydryl content，DPPH radical scavenging ability，hydroxyl radical scavenging ability and reducing powder.The samples of liquid whole egg under irradiation treatments（2，4，6 kGr）had significantly higher（p＜0.05）DPPH and hydroxyl radical scavenging ability than the control group at 10 days.No significant difference（p＞0.05） in free sulfhydryl contents is detected among whole liquid egg samples of control，pasteurization and irradiation 2 kGr sterilization groups.The results of SDS-PAGE and Western-blot show that irradiation sterilization treatments could not destroy the main antigenicity（ovalbumin）in whole liquid egg samples.

irradiation sterilization；DPPH radical scavenging ability；hydroxyl radical scavenging ability；antigenicity；whole liquid egg

TS201.3

A

10.16693/j.cnki.1671-9646（X）.2016.01.001

2015-11-04

蛋制品加工技術研發與產業化示范（2012BAD28B08）；公益性行業（農業）科研專項（201303084）。

戴 妍（1986— ），女，博士，助理研究員，研究方向為蛋品科學與加工技術。

*通訊作者：盧曉明（1982— ），男，博士，高級研究員，研究方向為蛋品科學與加工技術。