灰樹花菌絲體發(fā)酵培養(yǎng)及提取純化的研究

楊慶偉

（天津現(xiàn)代職業(yè)技術(shù)學(xué)院，天津 300350）

灰樹花菌絲體發(fā)酵培養(yǎng)及提取純化的研究

楊慶偉

（天津現(xiàn)代職業(yè)技術(shù)學(xué)院，天津 300350）

灰樹花菌種經(jīng)過14 d種子培養(yǎng)，發(fā)酵培養(yǎng)90 h時(shí)達(dá)到生物量和多糖含量最大值，分別為8.0，1.4 g/L，并對灰樹花菌絲體進(jìn)行提取純化，得到水溶性多糖組分GF，經(jīng)過Sepadex G200柱層析證明GF為均一組分。

灰樹花；多糖；菌絲體

灰樹花又名千佛菌、貝葉多孔菌、栗蘑蓮花菌、舞茸，隸屬擔(dān)子菌綱、多孔菌目、多孔菌科、樹花屬，是一種珍稀的食用菌。國內(nèi)外許多學(xué)者對灰樹花菌絲體或者發(fā)酵液的營養(yǎng)價(jià)值、藥用價(jià)值進(jìn)行廣泛研究［1］；日本學(xué)者伊藤一雄（1940年） 和廣江勇（1941年）最早從事灰樹花栽培研究，并于1974年栽培馴化成功，產(chǎn)值達(dá)到100億日元，作為香菇、金針菇等食用菌之后的新型食用菌［2］。灰樹花的生產(chǎn)擴(kuò)大化包括固體發(fā)酵和液體發(fā)酵2種，固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)優(yōu)點(diǎn)是可獲得食用和藥用兼得的灰樹花子實(shí)體；缺點(diǎn)是菌絲體生長慢、周期長；液體發(fā)酵培養(yǎng)優(yōu)點(diǎn)是發(fā)酵出的菌絲體要比固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)的子實(shí)體簡便迅速［3］。從灰樹花中提取的胞內(nèi)和胞外多糖等活性物質(zhì)，已成為食品保健品研究的熱點(diǎn)。本文在前期工作基礎(chǔ)上，主要研究灰樹花菌絲體的深層液體發(fā)酵培養(yǎng)、灰樹花菌絲體胞內(nèi)多糖的分離純化，為后續(xù)工作提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

灰樹花菌種；葡萄糖（分析純），天津市北辰驊躍化學(xué)試劑廠產(chǎn)品。

1.2 儀器與設(shè)備

干燥箱，上海市實(shí)驗(yàn)儀器廠產(chǎn)品；SP-2102PC型分光光度計(jì)，上海光譜儀器有限公司產(chǎn)品；搖床，上海欣蕊自動(dòng)化設(shè)備有限公司產(chǎn)品。

1.3 方法

1.3.1 灰樹花菌絲體液態(tài)擴(kuò)大培養(yǎng)

將灰樹花菌種取出，在培養(yǎng)箱（25℃）培養(yǎng)2～3 d，然后將菌種接種到液體種子培養(yǎng)基里進(jìn)行培養(yǎng)（25℃搖床，120 r/min，7 d），再轉(zhuǎn)接到液體種子培養(yǎng)基里進(jìn)行培養(yǎng)（10%一級(jí)種子，25℃搖床，120 r/min，7 d），最后轉(zhuǎn)接到液體發(fā)酵培養(yǎng)基里進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)（10%二級(jí)種子，25℃搖床，120 r/min）。

1.3.2 發(fā)酵培養(yǎng)曲線測定

利用干質(zhì)量法稱菌絲體的干質(zhì)量，并繪出灰樹花菌絲體生長曲線。

1.3.3 灰樹花菌絲體多糖含量測定

根據(jù)苯酚硫酸法的原理［4］，利用標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液制成標(biāo)準(zhǔn)曲線，將烘干后菌絲粉樣品加入到30 mL的85%乙醇中，在60℃水浴中保持1 h，然后離心處理，棄掉上清液，保留沉淀物，并加入200 mL蒸餾水，煮沸1 h，最后過濾，去除殘?jiān)ㄈ葜?00 mL，精確量取0.5 mL，加蒸餾水至2 mL，根據(jù)葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線制作操作流程，測定吸光度，代入回歸方程，求多糖含量。

1.3.4 灰樹花菌絲體多糖提取純化

發(fā)酵結(jié)束后，利用布式漏斗抽提發(fā)酵培養(yǎng)基，利用烘箱烘干制成干菌絲粉（溫度50℃），將菌絲粉在冰水浴下超聲波浸提10 min，稀釋制成質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%溶液，80℃水浴6 h，取上清液將3倍體積95%乙醇與上清液混合，在冰箱中保存12 h，以轉(zhuǎn)速4 500 r/min離心取沉淀利用Sevage法去蛋白，大孔樹脂吸附，超濾并冷凍干燥得到水溶性多糖組分GF。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵培養(yǎng)曲線測定結(jié)果

灰樹花經(jīng)過一級(jí)種子培養(yǎng)、二級(jí)種子培養(yǎng)，轉(zhuǎn)接做發(fā)酵培養(yǎng)，測定發(fā)酵曲線。

灰樹花發(fā)酵菌絲體及多糖含量曲線見圖1。

圖1 灰樹花發(fā)酵菌絲體及多糖含量曲線

由圖1可知，灰樹花菌絲體在液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)過程中，90 h以前菌絲體逐漸增長，90 h以后進(jìn)入穩(wěn)定期，在90 h左右菌絲含量最高，菌絲體干質(zhì)量為8.014 g/L。

在發(fā)酵培養(yǎng)90 h，多糖含量最高，為1.432 g/L。在90 h以后發(fā)酵進(jìn)入穩(wěn)定期，但是菌絲體多糖含量在發(fā)酵90 h以后逐漸下降。這是由于灰樹花菌絲體在進(jìn)入穩(wěn)定期以后開始分泌次級(jí)代謝產(chǎn)物，導(dǎo)致菌絲體多糖部分被代謝掉。

2.2 灰樹花水溶性多糖（GF）含量及純度分析結(jié)果×100%=0.66%. GF Sephadex G200凝膠過濾圖譜見圖2。

圖2 GF Sephadex G200凝膠過濾圖譜

GF柱層析分析，葡聚糖凝聚層析是分子排阻層析。根據(jù)分子篩的原理，依據(jù)分子量大小不同的化合物，在色譜柱中流速不同，將不同分子量的組分分離出來。Sephadex G200的分離范圍5～60 kDa。由圖2可知，菌絲體水溶性多糖GF是一種均一組分。

3 結(jié)論

本文主要目的是研究灰樹花菌絲體發(fā)酵培養(yǎng)產(chǎn)量最大化的時(shí)間，經(jīng)過以上工藝進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)90 h，菌絲體的生物量和菌絲體多糖含量達(dá)到最大值，分別為8.014，1.432 g/L，為灰樹花菌絲體發(fā)酵生產(chǎn)提取理論依據(jù)。經(jīng)過以上的提取工藝對灰樹花進(jìn)行提出純化，得到的水溶性多糖GF為均一組分，為后續(xù)灰樹花菌絲體多糖的活性研究提供基礎(chǔ)。

［1］劉振偉，史秀娟．灰樹花的研究開發(fā)現(xiàn)狀 ［J］.食用菌，2001（4）：6-7.

［2］鄭云甲.遷西灰樹花考察初報(bào) ［J］.食用菌，1986（1）：5-6.

［3］張松.食用菌學(xué) ［M］.廣州：華南理工大學(xué)出版社，2000：90-91.

［4］徐志祥．灰樹花深層培養(yǎng)和誘變育種研究及海藻糖合成酶基因的克隆、表達(dá) ［D］.廣州：中山大學(xué)，2003．◇

Study on the Fermentation Culture and Purification of Grifola frondosa Mycelia

Yang Qingwei
（Tianjin Modern Vocational Technology College，Tianjin 300350，China）

After 14 days of Grifola frondosa seed culture，the maximum value of the biomass and polysaccharide content is 8.0，1.4 g/L on the 90 hours fermentation，respectively.GF is isolated and purified from the mycelium of Grifola frondosa，and the water soluble polysaccharide fractions are obtained by Sepadex G200 column chromatography.The GF is homogeneous.

Grifola frondosa；polysaccharide；mycelia

Q539

A

10.16693/j.cnki.1671-9646（X）.2016.01.003

2015-12-02

楊慶偉（1983— ），男，碩士，講師，研究方向?yàn)槭称飞锛夹g(shù)。