灰樹花菌絲體發酵培養及提取純化的研究

楊慶偉

（天津現代職業技術學院，天津 300350）

灰樹花菌絲體發酵培養及提取純化的研究

楊慶偉

（天津現代職業技術學院，天津 300350）

灰樹花菌種經過14 d種子培養，發酵培養90 h時達到生物量和多糖含量最大值，分別為8.0，1.4 g/L，并對灰樹花菌絲體進行提取純化，得到水溶性多糖組分GF，經過Sepadex G200柱層析證明GF為均一組分。

灰樹花；多糖；菌絲體

灰樹花又名千佛菌、貝葉多孔菌、栗蘑蓮花菌、舞茸，隸屬擔子菌綱、多孔菌目、多孔菌科、樹花屬，是一種珍稀的食用菌。國內外許多學者對灰樹花菌絲體或者發酵液的營養價值、藥用價值進行廣泛研究［1］；日本學者伊藤一雄（1940年） 和廣江勇（1941年）最早從事灰樹花栽培研究，并于1974年栽培馴化成功，產值達到100億日元，作為香菇、金針菇等食用菌之后的新型食用菌［2］。灰樹花的生產擴大化包括固體發酵和液體發酵2種，固態發酵培養優點是可獲得食用和藥用兼得的灰樹花子實體；缺點是菌絲體生長慢、周期長；液體發酵培養優點是發酵出的菌絲體要比固態發酵培養的子實體簡便迅速［3］。從灰樹花中提取的胞內和胞外多糖等活性物質，已成為食品保健品研究的熱點。本文在前期工作基礎上，主要研究灰樹花菌絲體的深層液體發酵培養、灰樹花菌絲體胞內多糖的分離純化，為后續工作提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

灰樹花菌種；葡萄糖（分析純），天津市北辰驊躍化學試劑廠產品。

1.2 儀器與設備

干燥箱，上海市實驗儀器廠產品；SP-2102PC型分光光度計，上海光譜儀器有限公司產品；搖床，上海欣蕊自動化設備有限公司產品。

1.3 方法

1.3.1 灰樹花菌絲體液態擴大培養

將灰樹花菌種取出，在培養箱（25℃）培養2～3 d，然后將菌種接種到液體種子培養基里進行培養（25℃搖床，120 r/min，7 d），再轉接到液體種子培養基里進行培養（10%一級種子，25℃搖床，120 r/min，7 d），最后轉接到液體發酵培養基里進行發酵培養（10%二級種子，25℃搖床，120 r/min）。

1.3.2 發酵培養曲線測定

利用干質量法稱菌絲體的干質量，并繪出灰樹花菌絲體生長曲線。

1.3.3 灰樹花菌絲體多糖含量測定

根據苯酚硫酸法的原理［4］，利用標準葡萄糖溶液制成標準曲線，將烘干后菌絲粉樣品加入到30 mL的85%乙醇中，在60℃水浴中保持1 h，然后離心處理，棄掉上清液，保留沉淀物，并加入200 mL蒸餾水，煮沸1 h，最后過濾，去除殘渣，定容至200 mL，精確量取0.5 mL，加蒸餾水至2 mL，根據葡萄糖標準曲線制作操作流程，測定吸光度，代入回歸方程，求多糖含量。

1.3.4 灰樹花菌絲體多糖提取純化

發酵結束后，利用布式漏斗抽提發酵培養基，利用烘箱烘干制成干菌絲粉（溫度50℃），將菌絲粉在冰水浴下超聲波浸提10 min，稀釋制成質量分數4%溶液，80℃水浴6 h，取上清液將3倍體積95%乙醇與上清液混合，在冰箱中保存12 h，以轉速4 500 r/min離心取沉淀利用Sevage法去蛋白，大孔樹脂吸附，超濾并冷凍干燥得到水溶性多糖組分GF。

2 結果與分析

2.1 發酵培養曲線測定結果

灰樹花經過一級種子培養、二級種子培養，轉接做發酵培養，測定發酵曲線。

灰樹花發酵菌絲體及多糖含量曲線見圖1。

圖1 灰樹花發酵菌絲體及多糖含量曲線

由圖1可知，灰樹花菌絲體在液態發酵培養過程中，90 h以前菌絲體逐漸增長，90 h以后進入穩定期，在90 h左右菌絲含量最高，菌絲體干質量為8.014 g/L。

在發酵培養90 h，多糖含量最高，為1.432 g/L。在90 h以后發酵進入穩定期，但是菌絲體多糖含量在發酵90 h以后逐漸下降。這是由于灰樹花菌絲體在進入穩定期以后開始分泌次級代謝產物，導致菌絲體多糖部分被代謝掉。

2.2 灰樹花水溶性多糖（GF）含量及純度分析結果×100%=0.66%. GF Sephadex G200凝膠過濾圖譜見圖2。

圖2 GF Sephadex G200凝膠過濾圖譜

GF柱層析分析，葡聚糖凝聚層析是分子排阻層析。根據分子篩的原理，依據分子量大小不同的化合物，在色譜柱中流速不同，將不同分子量的組分分離出來。Sephadex G200的分離范圍5～60 kDa。由圖2可知，菌絲體水溶性多糖GF是一種均一組分。

3 結論

本文主要目的是研究灰樹花菌絲體發酵培養產量最大化的時間，經過以上工藝進行發酵培養90 h，菌絲體的生物量和菌絲體多糖含量達到最大值，分別為8.014，1.432 g/L，為灰樹花菌絲體發酵生產提取理論依據。經過以上的提取工藝對灰樹花進行提出純化，得到的水溶性多糖GF為均一組分，為后續灰樹花菌絲體多糖的活性研究提供基礎。

［1］劉振偉，史秀娟．灰樹花的研究開發現狀 ［J］.食用菌，2001（4）：6-7.

［2］鄭云甲.遷西灰樹花考察初報 ［J］.食用菌，1986（1）：5-6.

［3］張松.食用菌學 ［M］.廣州：華南理工大學出版社，2000：90-91.

［4］徐志祥．灰樹花深層培養和誘變育種研究及海藻糖合成酶基因的克隆、表達 ［D］.廣州：中山大學，2003．◇

Study on the Fermentation Culture and Purification of Grifola frondosa Mycelia

Yang Qingwei
（Tianjin Modern Vocational Technology College，Tianjin 300350，China）

After 14 days of Grifola frondosa seed culture，the maximum value of the biomass and polysaccharide content is 8.0，1.4 g/L on the 90 hours fermentation，respectively.GF is isolated and purified from the mycelium of Grifola frondosa，and the water soluble polysaccharide fractions are obtained by Sepadex G200 column chromatography.The GF is homogeneous.

Grifola frondosa；polysaccharide；mycelia

Q539

A

10.16693/j.cnki.1671-9646（X）.2016.01.003

2015-12-02

楊慶偉（1983— ），男，碩士，講師，研究方向為食品生物技術。