酸橙酚類物質的提取工藝?優化及分布和抗氧化活性研究

蔣展沫，孫 杰，易 陽，閔 婷，王麗梅

（武漢輕工大學食品科學與工程學院，湖北武漢 430023）

酸橙酚類物質的提取工藝?優化及分布和抗氧化活性研究

蔣展沫，孫 杰，*易 陽，閔 婷，王麗梅

（武漢輕工大學食品科學與工程學院，湖北武漢 430023）

研究酸橙果實不同部位酚類物質在含量及抗氧化貢獻上的差異。在單因素試驗的基礎上，建立以多酚提取率為響應值的四因素回歸模型，優化酸橙果肉酚類物質的提取工藝。提取測定酸橙不同部位酚類物質含量，采用HPLC-MS法分析其酚類物質組成，并評價其DPPH自由基清除能力、ABTS自由基清除能力和FRAP總抗氧化能力。酸橙果肉多酚提取最佳工藝參數為料液比1∶16（g∶mL），乙醇體積分數46%，pH值2.5，浸提溫度39℃，此條件下的多酚提取率達0.45%。酸橙中酚類物質主要以游離態存在，其中游離酚含量從大到小依次為橙肉＞橙皮＞橙籽，而游離黃酮含量從大到小依次為橙皮＞橙籽＞橙肉；酸橙的DPPH自由基清除能力、ABTS自由基清除能力和FRAP總抗氧化能力從大到小依次為橙肉＞橙皮＞橙籽。

酸橙；酚類物質；提取；分布；抗氧化

酸橙（Citrus aurantium L.） 是蕓香科柑橘屬植物，屬于藥食同源水果，其幼果可用于干制加工中藥材枳實和枳殼，用于寬中下氣、消導積滯和祛痰燥濕等。酸橙幼果的活性成分及其生理功效在食品和醫藥領域已引起廣泛關注，尤其是酚類化合物的抗氧化、抗腫瘤、促進胃腸蠕動等功能活性［1］。然而，酸橙成熟果實的相關研究報道鮮見。酸橙果實成熟后，其氨基酸、糖類和維生素等營養成分含量均顯著增加，但仍存在較重的酸味和澀味，不宜直接食用和加工食品，僅少部分用于加工飼料、果汁和果醬等［2-3］。以酚類化合物為代表的天然活性成分提取開發是酸橙精深加工的重要途徑。

酚類物質具有較強的抗氧化活性，富含該類活性物質的植物資源發掘和篩選一直備受關注［4］。植物不同組織部位中酚類物質在含量、組成和抗氧化活性等方面往往有所差異，其開發利用亦應有所側重。酸橙果皮、果汁和種子中酚類化合物的含量及抗氧化活性雖各有報道，但不同部位之間的差異并不清楚。本研究采用響應面法優化酸橙果肉中酚類化合物的提取工藝，進一步提取分析酸橙不同部位中游離態和結合態酚類物質的含量及抗氧化活性，以期為酸橙天然抗氧化活性成分的提取開發提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料、儀器與試劑

成熟的黃皮酸橙，湖北省荊州市卷橋柑橘專業合作社提供，試驗前分取果肉、果皮和種子，分別粉碎、勻漿后使用。

XFH-D型高速分散器、SB-5200DNT型超聲波清洗儀，寧波新芝生物科技股份有限公司產品；HR7633型飛利浦榨汁機，飛利浦家庭電器有限公司產品；TGLL-16A型臺式高速冷凍離心機，長沙平凡儀器儀表有限公司產品；PHS-25型pH計，上海虹益儀器儀表有限公司產品；UV-1800型紫外可見分光光度計，日本島津有限公司產品；電子天平，梅特勒-托利多儀器上海有限公司產品。

沒食子酸（Gallic acid）、水溶性VE（Trolox）、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）、2，4，6-三吡啶基三嗪（TPTZ）、2，2-聯氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽（ABTS）、蘆丁（Rutin），東京化成工業株式會社產品；FeCl3，Na2CO3，AlCl3·6H2O，NaNO2和福林酚試劑等均為分析純，國藥集團化學試劑有限公司產品。

1.2 酸橙果肉多酚提取工藝優化

1.2.1 工藝流程

稱取3.00±0.05 g果肉勻漿后置于一定體積的乙醇溶液中，以轉速10 000 r/min高速均質處理2 min后，采用0.1 mol/L NaOH溶液或0.1 mol/L HCl溶液調節至適當pH值。料液置于控溫的120 W超聲場中持續浸提一定時間后，離心（4 000 r/min，10 min）、過濾分離濾液，定容至100 mL，混勻后待測。

1.2.2 單因素試驗

（1）料液比。在乙醇體積分數40%，pH值4，浸提溫度50℃，浸提時間20 min的條件下，考察不同料液比（1∶5，1∶10，1∶15，1∶20，1∶25）對多酚提取率的影響。

（2）乙醇體積分數。在料液比1∶15，pH值4，浸提溫度50℃，浸提時間20 min的條件下，考察乙醇溶液不同體積分數（0，20%，40%，60%，80%）對多酚提取率的影響。

（3）pH值。在料液比1∶15，乙醇體積分數40%，浸提溫度50℃，浸提時間20 min的條件下，考察不同pH值（2，3，4，5，6）對多酚提取率的影響。

（4）浸提溫度。在料液比1∶15，乙醇體積分數40%，pH值4，浸提時間20 min的條件下，考察不同提取溫度（20，30，40，50，60℃）對多酚提取率的影響。

（5）浸提時間。在料液比1∶15，乙醇體積分數40%，pH值4，浸提溫度50℃的條件下，考察不同浸提時間（5，10，20，40，60 min）對多酚提取率的影響。

1.2.3 響應面試驗

響應面試驗因素及水平設計見表1。

表1 響應面試驗因素及水平設計

在單因素試驗的基礎上，采用Box-Benhnken中心組合設計四因素三水平試驗。

1.3 酸橙游離態和結合態酚類物質的提取

游離態酚類物質的提取采用響應面法優化的酸橙多酚提取工藝。稱取3.00±0.05 g樣品置于48 mL的46%乙醇溶液中，以轉速10 000 r/min高速均質處理2 min后調節pH值至2.5。料液于39℃下超聲浸提10 min后，經離心、過濾分離濾液。濾渣加入48 mL的46%乙醇溶液并重復以上步驟提取2次，合并濾液。將濾液于45℃下旋轉蒸發濃縮，并用46%乙醇溶液定容至25 mL，置于-20℃保存待測。結合態酚類物質方法提取，定容至10 mL后置于-20℃保存待測。提取制備重復平行3次。

1.4 分析方法

1.4.1 總酚和總黃酮測定

總酚和總黃酮的測定方法參考文獻［4］；多酚提取率（%）以濕基（WW）中所含沒食子當量（GAE）的質量百分比計；酸橙不同部位總酚含量以每100 g濕基中所含沒食子酸當量表示（mg GAE/100 g WW），總黃酮含量以每100 g濕基中所含蘆丁當量（RE）表示（mg RE/100 g WW）。

1.4.2 抗氧化活性評價

DPPH自由基清除能力參考文獻［5］方法測定不同濃度（30，60，90 μg GAE/mL）樣液的DPPH自由基清除率；ABTS自由基清除能力采用文獻［4］方法測定不同濃度樣液的ABTS自由基清除效果；FRAP抗氧化能力采用文獻［4］方法測定不同濃度樣液的FRAP抗氧化作用。

1.5 統計分析

Box-Benhnken中心組合設計和響應面分析采用SAS（V8）軟件處理；采用IBM SPSS19統計軟件進行單因素方差分析，組間0.05水平的統計學差異采用S-N-K檢驗（Student-Newman-Keuls test）。數據均以平均值±標準偏差表示。

2 結果與分析

2.1 各試驗因素對酸橙果肉多酚提取率的影響

各試驗因素對酸橙果肉多酚提取率的影響見圖1。

圖1 各試驗因素對酸橙果肉多酚提取率的影響

由圖1（a）可知，多酚提取率隨料液比的減小而逐漸增大。料液比1∶15時的多酚提取率顯著高于1∶5和1∶10（p＜0.05），但隨著料液比的進一步減小，多酚提取率并未顯著增加（p＞0.05）。由此，選擇酸橙多酚浸提的適宜料液比為1∶10～1∶20。

由圖1（b）可知，多酚提取率隨乙醇體積分數的增加呈先增大后減小的趨勢。酸橙果肉中酚類物質可能具有相對較寬的極性分布，且大部分與20%～60%乙醇溶液的極性相當，故在此體積分數范圍內表現出較高的多酚提取率，各體積分數之間并無顯著性差異（p＞0.05），但均顯著高于純水和80%乙醇的提取率（p＜0.05）。由此，選擇酸橙果肉多酚浸提的適宜乙醇體積分數范圍為20%～60%。

由圖1（c）可知，隨著浸提液pH值的增加，酸橙果肉多酚提取率發生明顯下降。pH值為2時的多酚提取率最高（p＜0.05），而pH值介于3～5時多酚提取率無顯著差異（p＞0.05）。偏酸條件可能有利于組織中部分與多糖和蛋白以氫鍵和（或）疏水鍵結合的酚類物質解離，故適宜的酸橙果肉多酚浸提pH值范圍為2～4。

由圖1（d）可知，酸橙多酚提取率隨浸提溫度的增加呈先增大后減小的趨勢。浸提溫度40℃時的多酚提取率顯著高于20℃和60℃（p＜0.05），但與30℃和50℃的提取率無顯著差異（p＞0.05）。浸提溫度增加有利于酚類物質溶出，但高溫可能導致酚類物質的分解，故適宜的酸橙果肉多酚浸提溫度范圍為30～50℃。

由圖1（e）可知，在浸提時間5～60 min內的多酚提取率并無顯著變化（p＞0.05），故選定酸橙果肉多酚浸提時間為5min。

2.2 酸橙果肉多酚提取響應面試驗結果

響應面試驗設計及結果見表2，回歸模型方差分析見表3。

表2 響應面試驗設計及結果

表3 回歸模型方差分析

以料液比X1，乙醇體積分數X2，pH值X3，浸提溫度X4為試驗因素，建立以酸橙果肉多酚提取率Y為考察指標的回歸模型如下：

Y=0.437 9+0.003 6X1+0.006 3X2-0.007 4X3-

0.009 8X4-0.017 4X12+0.003 0X1X2-

0.007 7X1X3-0.000 1X1X4-0.016 2X22-0.005 4X2X3-0.002 4X2X4-0.010 6X32-0.004 9X3X4-0.033 7X42.

由表3可知，回歸達到極顯著水平（p＜0.000 1），考察指標Y的決定系數R2值達94.68%，模型擬合較好。逐項顯著性檢驗發現：線性項和平方項對Y值有極顯著影響（p＜0.001），而交互項對Y值影響不顯著（p＞0.05）；線性項中，X2，X3和X4均對Y值有極顯著影響（p＜0.01），而影響程度依次減弱；交互項中僅X1X3顯著影響Y值（p＜0.05）。

采用RSREG Procedure分析回歸模型得到極值點，各因素的編碼值分別為X1=0.235 6，X2=0.306 9，X3=-0.484 2，X4=-0.121 2，響應值Y=0.441 7%。將各因素編碼轉化并取整得到酸橙果肉多酚提取的最佳工藝參數為料液比1∶16，乙醇體積分數46%，pH值2.5及浸提溫度39℃，在此條件下的提取率預測值為0.44%，而實際提取率為0.45%。

2.3 酸橙不同部位酚類物質含量及組成

酸橙不同部位酚類物質含量見圖2。

由圖2可知，酸橙不同部位的多酚和黃酮均以游離態為主，其中橙肉游離酚含量（519.73 mg GAE/100 g WW）顯著高于橙皮（p＜0.05），而橙籽中游離酚含量最低（120.28 mg GAE/100 g WW）；橙皮具有最高的游離黃酮含量（670.65 mg RE/100 g WW），而橙籽中游離黃酮含量顯著高于橙肉（p＜0.05）。

圖2 酸橙不同部位酚類物質含量

2.4 酸橙不同部位的抗氧化能力比較

酸橙果實不同部位的抗氧化能力比較見表4。

表4 酸橙果實不同部位的抗氧化能力比較

由表4可知，酸橙不同部位的抗氧化能力以100 g濕基中所含的TE當量表示。整體而言，酸橙各部位的抗氧化活性主要由其游離酚貢獻，各部位結合酚的DPPH和ABTS自由基清除能力及FRAP總抗氧化能力均顯著弱于游離酚（p＜0.05）。酸橙果肉的游離酚DPPH自由基清除能力、ABTS自由基清除能力及FRAP總抗氧化能力均顯著強于橙皮（p＜0.05），而橙籽的抗氧化能力最弱（p＜0.05）。Garau M等人［3］研究發現，酸橙干燥幼果果皮的抗氧化能力顯著高于果肉。酸橙酚類物質的自由基清除活性與電子貢獻能力有關，主要受B環羥基化和甲氧基化程度及位點影響，而鄰苯二酚B環可能是重要的抗氧化特征結構，其幼果與成熟果實不同部位抗氧化能力強弱不同的物質基礎有待進一步明晰。

3 結論

結合單因素試驗和響應面試驗，以多酚提取率為指標優化酸橙果肉酚類物質的提取工藝條件為料液比1∶16，乙醇體積分數46%，pH值2.5及浸提溫度39℃。在此條件下，多酚的實際提取率為0.45%，與預測值的差異小于5%，回歸模型擬合程度較好。各因素影響酸橙果肉多酚提取率的主次順序為浸提溫度＞pH值＞乙醇體積分數＞料液比。酸橙果實中酚類物質主要以游離態形式存在，且不同部位的酚類物質含量存在顯著差異，其中游離酚含量以橙肉＞橙皮＞橙籽，而游離黃酮含量主次順序為橙皮＞橙籽＞橙肉。橙肉具有相對較高的抗氧化能力，在抗氧化功能產品開發方面前景良好。

［1］易陽，王宏勛，何靜仁.酸橙活性成分及其生理功效的研究進展 ［J］.湖北農業科學，2014，53（16）：3 721-3 725.

［2］Ou M.Chinese-English manual of common-used in traditional Chinese medicine［M］.Hong Kong：Joint Publishing Co.，1989：348-349.

［3］Garau M，Carme，Simal Susana，et al.Effect of air-drying temperature on physico-chemical properties of dietary fibre and antioxidant capacity of orange（Citrus aurantium V.Canoneta） by-products［J］.Food Chemistry，2007，104（3）：1 014-1 024.

［4］李青，張名位，張瑞芬，等.5種秈稻品種谷殼中游離態和結合態酚類物質含量及其抗氧化活性比較 ［J］.中國農業科學，2012，45（6）：1 150-1 158.

［5］孫杰，陸雙雙，徐燕燕，等.蓮藕不同部位酚類物質含量、組成及抗氧化活性比較 ［J］.武漢輕工大學學報，2015，34（2）：20-25.◇

Study on the Extraction Technology Distribution and Antioxidant Activity of Phenolic Compounds from Citrus aurantium L.

JIANG Zhanmo，SUN Jie，*YI Yang，MIN Ting，WANG Limei
（College of Food Science&Engineering，Wuhan Polytechnic University，Wuhan，Hubei 430023，China）

This work aims to investigate the differences in the content and antioxidant activity of phenolic compounds from various parts of mature Citrus aurantium L.fruits.Base on signal-factor experiment，the extraction yield of phenolic compounds is used as response value to establish a regression model with four factors.Phenolic compounds from various parts of fruit are extracted for content measurement.Their compositions are detected by HPLC-MS method，and then DPPH and ABTS free radical scavenging capacities and FRAP total antioxidant capacity are evaluated.The optimized parameters for extracting phenolic compounds from Citrus aurantium L.pulp are confirmed as follows：material to liquid is 1∶16（g∶mL），

Citrus aurantium L.；phenolic compound；extraction；distribution；antioxidant activity

TS255.1

A

10.16693/j.cnki.1671-9646（X）.2016.01.010

2015-12-01

武漢輕工大學引進人才科研啟動項目（2013RZ03）。

蔣展沫（1992— ），男，本科，研究方向為農產品加工。

*通訊作者：易 陽（1986— ），男，博士，副教授，研究方向為農產品加工。

ethanol concentration is 46%，pH value is 2.5，and extraction temperature is 39℃.Under such conditions，the extraction yield of phenolic compounds reached to 0.45%.The phenolic compounds of the fruit mainly existed as free，the contents of free polyphenols in various parts are ordered as pulp＞peel＞seed，and the contents of free flavonoids are ordered as peel＞seed＞pulp.The antioxidant abilities of different parts，including DPPH and ABTS free radical scavenging capacities and FRAP total antioxidant capacity，could all be ordered as pulp＞peel＞seed.