高效液相測定雞肉中糖皮質激素的方法

李曉丹+張學青+馮靜+王娜+閆師杰

摘 要：優化了雞肉中糖皮質激素殘留的液相色譜分析方法。采用甲醇、二氧六環、乙腈∶水∶甲酸（30∶70∶0.1）、乙酸乙酯做提取劑，提取樣品中的地塞米松與潑尼松龍，使用了10%乙腈/水和乙腈飽和的正己烷作為凈化劑，采用超聲分離法提取激素，通過液相色譜進行分析。本試驗研究了流動相條件、體積流量、提取溶劑、凈化溶劑等條件對地塞米松和潑尼松龍這兩種目標物檢測狀況的影響，確定最佳流動相比例為30∶70，最佳體積流量為1 mL·min-1，最佳提取劑為乙腈∶水∶甲酸（30∶70∶0.1）混合液，其加標回收率達到98.3%。在雞肉樣品中，潑尼松龍的線性范圍為0.1～10 μg·L -1，RSD為0.1%，檢出限約為10 ng；地塞米松的線性范圍為0.5～10 μg·L -1，RSD為0.2%，檢出限約為10 ng，相對標準偏差均為0.99左右。

關鍵詞：液相色譜法；雞肉；地塞米松；潑尼松龍

中圖分類號：Q95-3 文獻標識碼：A DOI 編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2016.09.013

Abstract ：The analysis method of chicken glucocorticoid residues by liquid chromatography was established in this paper. Methanol， dioxane， acetonitrile∶ water∶ formic acid （30∶70∶0.1） and ethyl acetate were used to extract the dexamethasone and prednisolone in samples. 10% acetonitrile/water and acetonitrile saturated n-hexane were used as purifying agent. Hormone has been extracted by ultrasonic separation method. The test solution has been analyzed by liquid chromatograph， using C18 chromatographic column separation and external standard method to quantify. This experiment focused on the effect of targets detection status of dexamethasone and prednisolone in terms of the mobile phase conditions， the volumetric flow， the extraction solvent， the purification solvents and other factors. So it was confirmed that the optimum mobile phase ratio was 30∶70， the optimal volumetric flow was 1 mL·min-1 and the best extraction agent is mixed liquor， acetonitrile∶ water∶ formic acid （30∶70∶0.1）， where the recovery rate has reached 98.3%. In the chicken samples， the linear range of prednisolone was 0.1～10 μg·L-1 and the RSD was 0.1% where the detection limit was about 10 ng； the linear range of dexamethasone was 0.5～10 μg·L-1and the RSD was 0.2% where the detection limit was about 10 ng， the relative standard deviation was about 0.99.

Key words： liquid chromatography； dexamethasone ； prednisolone； chicken

現代社會中畜牧業可以為人類提供極其豐富的肉、禽、奶、蛋等畜產品，但隨著畜牧業的發展和社會經濟的增長，畜產品中的藥物殘留污染已經成為一大社會問題，對人類身體健康的公共衛生造成了較大的危害[1]。有研究表明，人類常見的癌癥、畸形、抗藥性、青少年早熟、中老年心血管疾病等問題均與畜禽產品中的抗生素、激素等藥物的殘留有關[2]。其中，糖皮質激素在醫學上可用于治療過敏、哮喘等疾病，合成糖皮質激素如倍他米松、地塞米松等，具有很強的抗炎作用，在獸醫中被廣泛用于治療呼吸道、胃腸疾病等[3]。然而，很多不法分子在經濟利益的驅使下超量使用這些藥物以便縮短育肥期、降低飼料成本，或者給畜禽注射激素藥物，讓其增肥增重從而達到促進動物的生長和提高瘦肉率的效果[4]。因此，各國對動物源性食品中糖皮質激素殘留量的檢測都十分重視。目前，測定食品中糖皮質激素殘留的方法主要有氣相色譜法（GC）[5]、高效液相色譜法 （HPLC）、氣相色譜-質譜法（GC-MS）和液相色譜-質譜法（LC-MS）等[2]。本試驗利用高效液相色譜法對樣品前處理過程中雞肉中糖皮質激素提取劑進行了篩選，并優化了高效液相色譜儀檢測條件，從而確定一種效率較高、準確度較好的方法對糖皮質激素進行檢測。

1 材料和方法

1.1 材 料

雞肉購于天津市西青區紅旗農貿市場，地塞米松標準品（Dexamethasone）和潑尼松龍標準品（Prednisolone）購于北京中科質檢生物技術有限公司。endprint

1.2 方 法

1.2.1 雞肉中糖皮質激素提取劑的選取 本試驗分別選用了甲醇[4]、二氧六環[6]、乙腈∶水∶甲酸（30∶70∶0.1）[7]和乙酸乙酯4種提取劑。分別稱取地塞米松和潑尼松龍兩種糖皮質激素標準品，用甲醇溶解并稀釋至每1 mL各含10 μg的溶液，制為混合標液。

稱量（2±0.05） g 樣品，加入分別含有10 μg·mL-1的地塞米松和潑尼松龍混合標液，放置1 h使其充分滲透到雞肉中后進行研磨[8]，并分別加入甲醇/二氧六環/乙腈∶水∶甲酸（30∶70∶0.1）50 mL或乙酸乙酯20 mL，并轉移到錐形瓶中，放入超聲震蕩儀中震蕩20 min，隨后進行過濾，于40 ℃水浴鍋中水浴至干[9]。取出后，加5 mL提取劑溶解殘渣，轉移至離心管，加入2 mL10%乙腈/水和2 mL經乙腈飽和的正己烷，漩渦混合，靜置，待分層后取下層溶液15 000 r·min-1離心5 min[10]，0.45 μm微孔濾膜過濾，用高效液相色譜法進行檢測，計算其加標回收率，加標回收率最高的提取劑為試驗選用的最優提取劑。

1.2.2 液相色譜檢測條件的確定 （1）流動相比例的確定。本試驗所用液相色譜為Agilent 6300，色譜條件采用Thermo BDS Hypersil C18色譜柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）； 0.1%甲酸的水溶液作為流動相A，以乙腈作為流動相B，柱溫箱溫度35.0 ℃[11]，檢測器波長范圍200 ～ 240 nm[9]，帶寬4 nm，進樣量20.0 μL，分別對流動相比例A∶B為80∶20、A∶B為70∶30以及A∶B為60∶40進行研究和探討，此時體積流量設定為1 mL·min-1。

（2）體積流量的確定。本試驗探究了當體積流量分別為0.8 mL·min-1或1 mL·min-1時對試驗的影響，從而調整液相色譜條件，使試驗結果更佳。

（3）標準曲線的測定。分別精密稱取適量地塞米松和潑尼松龍兩種糖皮質激素標準品，加甲醇制成每1 mL各含0，2，4，6，8，10 μg的混合標液[11]，取混合標液20 μL注入高效液相色譜儀進行分析。

2 結果與分析

2.1 色譜條件分析

2.1.1 洗脫條件的確定 為探究本試驗中液相色譜的最佳運行條件，試驗時使用地塞米松與潑尼松龍的混合標液對洗脫條件進行分析，每次進樣量為20 μL，試驗結果見圖1～圖3。

當洗脫條件為80%A+20%B時，液相色譜圖沒有明顯的激素峰出現，且基線偏離嚴重，此濃度無法洗脫出地塞米松和潑尼松龍；當洗脫條件變換為70%A+30%B時，出峰清晰且分離時間適宜；當洗脫條件設置為60%A+40%B時，色譜圖中的峰無法分離，看不出有明顯的峰出現，無法確認計算。因而，只有當B和A的比例為3∶7時，出峰清晰且分離時間適宜，選為最適合的洗脫條件（圖4）。

2.1.2 體積流量的確定 體積流量設定為0.8 mL·min-1時，基線偏離較大，且混標分離效果較差；體積流量設定為1 mL·min-1時，雖有少數微小的雜峰波動，但要測定的激素峰分離效果好，基線較平，出峰時間合適，因此，選定1 mL·min-1為最適體積流量。

2.1.3 標準曲線的測定 以地塞米松與潑尼松龍混合標準品溶液進樣量（μg·min-1）為橫坐標，峰面積為縱坐標，繪制標準曲線，見表1。由表1可得出標準曲線的回歸方程、相關系數、線性范圍以及定量限。地塞米松與潑尼松龍的相關系數均大于0.99，表明是高度相關，定量限較小說明此檢測方法具有較靈敏的定量檢測能力，檢測結果準確可靠。

2.1.4 精密度試驗 取10 μg·min-1的地塞米松與潑尼松龍混合標液，連續進樣6次，每次進樣20 μL，測定各峰面積，得出檢出量，見表2。根據公式計算得地塞米松、潑尼松龍的RSD分別為0.1%，0.2%，均小于1.0%，表示此試驗精密度較高，滿足試驗需求。

2.1.5 檢出限確定 取地塞米松、潑尼松龍對照品貯備溶液，用流動相多次稀釋后，注入液相色譜儀進行測定，測定結果見表3。通過公式計算得到這兩種糖皮質激素的檢出限約為10 ng，即相當于添加量為每克劑量0.005 mg。

2.2 雞肉中糖皮質激素最佳提取劑的確定

根據2.1.1和2.1.2中所確立的分離效果較好的洗脫條件和體積流量設置液相色譜條件，檢測 1.2.1中使用不同提取劑分別對雞肉中的地塞米松和潑尼松龍進行提取后的提取液，通過計算得出加標回收率，結果見表4。

根據對加標回收率的比較可以看出，使用乙腈∶水∶甲酸（30∶70∶0.1）做提取劑對地塞米松和潑尼松龍兩種糖皮質激素的提取效率是最高的，在液相色譜條件確定的情況下加標回收率最高，表明損失量最少。

3 結論與討論

本試驗通過HPLC對雞肉中糖皮質激素提取劑進行了篩選，發現甲醇在做提取劑時，由于甲醇極性較強，提取雜質較多，在凈化分層后雖然能有效分離油脂蛋白質，但上層較容易出現掛壁等問題，使得在吸取下層時仍有可能混入少量蛋白質等雜質，因而，在高效液相色譜中易出現雜峰影響判斷。同時二氧六環做提取劑時，有一定的刺激性，操作較為繁瑣，提取、過濾、水浴蒸干等過程盡量要在通風櫥中進行，且其在水浴蒸干過程中耗時較久，較難蒸干。而使用乙酸乙酯做提取劑，雞肉不容易散開而會凝結成團狀，會導致提取效率不夠高，且乙酸乙酯有較強的刺激性氣味，需要在通風櫥中進行操作，增加了試驗的繁瑣性。使用乙腈∶水∶甲酸（30∶70∶0.1）混合液做提取劑時，甲酸有較強腐蝕性和刺激性，要注意穿戴防護服和防護手套，在過程中，由于甲酸的加入會分解肉品中的纖維，使雞肉成粉末狀，使得過濾過程較為艱難，非常容易堵塞濾紙孔，但優點在于對糖皮質激素的提取效率會更高，因而檢測性比較好。

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