多等溫加速試驗預測重組雞α干擾素的穩定性

高應瑞+劉珂飛+孟鐵健+由天立

摘 要：在3種溫度下對大腸桿菌表達重組雞α干擾素進行了多等溫加速穩定性試驗和2 ℃保存的穩定性考察，預測重組雞α干擾素的穩定性，為制品有效期的確定提供依據。采用多等溫加速試驗， 將制品放在3種不同溫度下孵放， 定期取出樣品， 測定效價， 根據制品的效價下降情況推算其在有效期內的穩定性。結果顯示：用加速降解有關公式可以求出在2 ℃存放1年后的殘余效價為226 492 682單位，下降率為9.9%，與實測值228 000 957單位基本吻合；2年后的殘余效價為203 868 551單位，下降率為18.9%。即2 ℃保存2年后效價保持在80%以上，推算的結果與試驗值較吻合，產品穩定性良好。

關鍵詞：多等溫加速試驗；重組雞α干擾素；穩定性

中圖分類號：Q81 文獻標識碼：A DOI 編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2016.09.014

Abstract： To forecast the stability of the recombinant chicken interferon α products， and to provide basic information for determining the shelf-life of the products， accelerated stability test was conducted at three different temperatures on E.coli expression of recombinant chicken interferon and stored at 2 ℃ for inspection. By accelerated degradation tests， the products of recombinant chicken interferon α were put at three different temperature conditions for incubation. Some samples were taken out regularly during the incubation in order to test the titer， and to estimate the stability of the products during the shelf-life according to the decline of the titer. The result showed that residual valence for one year after the decline rate was 9.9% at 2 ℃， and was conswastent with the measured value， the residual value after two years of decline rate was 18.9%. In other words， stored at 2 ℃ for two years after the titer remained at more than 80%， the result of calculated the recombinant chicken interferon α had good stability during their shelf-life.

Key words： accelerated degradation tests； the recombinant chicken interferon α； stability

傳統的蛋白類藥物，特別是干擾素在水溶液中的穩定性較差。為解決這一難題，在研制過程中，筆者作了多方面的努力， 減少了純化過程中失活， 并在改善成品穩定性方面取得了進展。本研究報道了重組雞α干擾素的穩定性研究結果， 其中包括加速穩定性試驗和2 ℃保存的穩定性考察， 并對加速試驗和實地穩定性考察的相關性作了討論。

1 材料和方法

1.1 重組雞α干擾素

將重組雞α干擾素粗品經多步純化， 比活性達到2.5×108 IU·mL-1以上，加入穩定劑， 除菌、分裝。批號為201103221。

1.2 效價測定方法

用微量細胞病變抑制法[1]。檢測系統為水泡口炎病毒—VSV攻擊病毒。

1.2.1 干擾素溶液的制備 將待測干擾素溶液用含血清的細胞培養液預稀釋3倍，在96孔細胞培養板中，做4倍系列稀釋，共9個稀釋度，每個稀釋度做6孔。

1.2.2 標準品溶液的制備 將標準禽易肽溶液用含血清的細胞培養液預稀釋2倍，在96孔細胞培養板中，做4倍系列稀釋，共7個稀釋度，每個稀釋度做6孔。

1.2.3 常規方法 制水泡口炎病毒接種于96孔板，24 h后，棄去細胞培養板中的上清液，用PBS洗兩次后，分別加入不同濃度梯度的干擾素溶液100 μL，于37 ℃，5%CO2培養24 h，棄去細胞培養板中的上清，將保存好的NDV病毒用不含血清的細胞培養液稀釋至約100 TCID50，每孔100 μL，于37 ℃，5%CO2培養24 h，當病毒對照中細胞病變達90%以上時，進行結晶紫染色，每孔加染色液50 μL，室溫放置30 min，用流水小心沖去染色液，并吸干殘留水分，每孔加入脫色液100 μL，室溫放置3～5 min，用酶標儀以630 nm為參考波長，在波長570 nm處測定吸光度。按下式計算：

供試品生物學活性=Pr×[（Ds×Es）/（Dr×Er）]

式中，Pr為干擾素標準品生物學活性；Ds為供試品預稀釋倍數；Dr為干擾素標準品預稀釋倍數；Es為供試品相當于干擾素標準品半效量的稀釋倍數；Er為干擾素標準品半效稀釋倍數。endprint

1.3 試驗方法

采用多等溫度下加速試驗[2-4]。將樣品分為4組， 一組放在2～8 ℃下保存作為對照組， 每隔90 d取樣測定其效價，其余3組分別放在37，56，66 ℃恒溫孵箱內加熱， 溫差范圍均在±0. 5 ℃， 間隔一定時間取樣作效價測定。根據不同溫度下孵放后效價下降情況， 按一級反應方程log u= log u0-kt （ k為某一恒溫條件下的反應速度常數） 求出不同恒溫條件下的反應速度常數k， 再利用化學反應速度常數與反應溫度的關系， 即Arrhenius 方程log k= α-β/T （T為反應的絕對溫度） 推算出低溫下的k值， 預測低溫下樣品的效價， 從而預測低溫下樣品的穩定性。

2 結果與分析

2.1 樣品加溫降解試驗結果

取一批代表樣品在3種溫度下降解時，殘余效價的對數與加溫時間基本上呈直線關系（圖1和表1）。這說明雞a干擾素的降解服從一級反應式：

lg u = lg u0-kt （1）

式（1）中u0為原始效價，u為加溫t時間后的殘余效價，k為一定溫度下的降解速度常數。由圖1可以看出，不同溫服下降解速度顯著不同，66 ℃最快，56 ℃次之，37 ℃最慢。

2.2 計算各溫度條件下的降解反應速度常數

按公式（1），將表1的數據作直線回歸處理，可求得下列數值，見表2。再根據log k與降解溫度T（K）的關系式log k= α-β/T，將已經求出的66 ℃、56 ℃和37 ℃的k值對式log k= α-β/T作回歸分析，結果見表2與圖2，可求出在8 ℃，2 ℃時的k值（表2），分別為2.032×10-4·d-1和1.247×10-4·d-1。

以2 ℃時的k值代入（1）式，可以求出在2 ℃存放1年后的殘余效價為226 492 682單位，下降率為9.9%，與實測值228 000 957單位基本吻合；2年后的殘余效價為203 868 551單位，下降率為18.9%。即2 ℃保存2年后效價保持在80%以上。

3 結論與討論

根據上述結果，可以認為重組雞α干擾素在2～10 ℃條件下保存1年、2年、3年和10年其效價下降呈現相似的趨勢， 重組雞α干擾素在2年有效期內的效價下降率為18.9%。即2 ℃保存2年后效價保持在80%以上。

穩定性是生物制品的重要質量標準。高溫下加速降解試驗是一種常見的用于考察生物制品穩定性的方法，根據本試驗結果，采用這一方法對于預測制品穩定性具有一定的參考價值。

參考文獻：

[1] 中國生物制品規程[M]. 北京： 化學工業出版社， 2000：373-375.

[2] TYDMAN M S， KIRKWOOD T B. Design and analysis of accelerated degradation tests for t he stability of biological standards I， properties of maximum likelihood estimators[J]. J Biol Stand， 1984， 12（2） ： 195-206.

[3]KIRKWOOD T B.Design and analysis o f accelerated degradation tests for the stability of biological standards Ⅲ，principles of design[J].Journal of Biological Standardization，1984，12（2）：215-224.

[4]KUROKAWA M，ISHIDA S，MURATA R，et al.Accelerated degradation tests on some immunological products[J].Journal of Biological Standardization，1979，7（1）：31-41.endprint