ITS序列分析法鑒定煙草病株分離出的兩種真菌

吳曉宗

摘 要：邵武地區(qū)煙草種植中出現(xiàn)新病害，利用ITS 基因序列對煙株病害部位分離出的兩種真菌進行分析鑒定。通過構建系統(tǒng)發(fā)育樹，結合菌落形態(tài)特征，鑒定這兩種真菌為九州鐮孢菌（F. kyushuense）和中國布拉氏霉菌（B. sinensise）。

關鍵詞：ITS；煙草；真菌；鑒定

中圖分類號：F768.29 文獻標識碼：A DOI 編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2016.09.032

Abstract： A new tobacco disease appeared in Shaowu area， ITS gene sequence analysis was used to identificated two fungus strains which isolated from the infected strain of tobacco. By constructing phylogenetic tree with the colony morphology characteristics， the two fungus strains were identificated which were F. kyushuense and B. sinensise.

Key words： ITS； tobacco； fungus； identification

煙草作為一種重要的經(jīng)濟作物，在我國的種植面積和產(chǎn)量均居世界前列，但每年煙草病害的發(fā)生比較嚴重，給煙農(nóng)和國家經(jīng)濟帶來巨大損失。我國煙草種植區(qū)域廣，病害種類、分布和危害情況因不同地域而有很大差異，全國 16個主產(chǎn)煙省（區(qū)）煙草侵染性病害有62種，其中真菌性病害30種[1]。福建省是我國煙草主產(chǎn)區(qū)，煙草侵染性病害發(fā)生種類有31種[2]，主要為煙草炭疽病、煙草赤星病、煙草黑脛病、煙草青枯病、煙草病毒病等5類[3]，在31種煙草侵染性病害中真菌性病害有10種，且新的侵染性病害不斷出現(xiàn)，如米根霉引起的煙葉霉爛病等[4]。

福建省邵武市煙農(nóng)在煙草種植中新發(fā)現(xiàn)一種病害，病株在莖部產(chǎn)生褐色水漬狀病斑，嚴重部位腐爛，在葉部產(chǎn)生枯萎圓形斑點。試驗室對發(fā)病株進行病原檢測，本試驗對其中的真菌進行了分離和鑒定。

由于病原真菌物種間形態(tài)差異較小，鑒定工作較困難，而真菌rDNA-ITS適用于不同分類水平的物種鑒定及系統(tǒng)發(fā)育研究[5]，能從分子水平為病原菌的準確分類、鑒定提供科學依據(jù)。本試驗選擇ITS序列分析從煙草病害發(fā)生部位中分離出的真菌進行分析，從而達到快速、有效地鑒定。

1 材料和方法

1.1 材 料

煙株：烤煙品種云32，邵武地區(qū)種植，發(fā)病后送檢。

孟加拉紅培養(yǎng)基：北京奧康星生物技術有限責任公司；PDA培養(yǎng)基：北京奧康星生物技術有限責任公司；真菌基因組DNA快速抽提試劑盒：生工生物工程（上海）股份有限公司。改良馬丁培養(yǎng)基配方（1 L）：蛋白胨5 g、酵母浸出粉2 g、葡萄糖20 g、磷酸氫二鉀1.0 g、硫酸鎂0.5 g， pH值 6.4，121 ℃滅菌20 min。

1.2 試驗方法

1.2.1 病原菌分離與純化 在送檢的各樣品中隨機選取莖部3處病變部位切片。將每個切片放入100 mL無菌水中，搖床上充分振蕩30 min，制成菌懸液，每瓶菌懸液取1 mL與一定量的孟加拉紅培養(yǎng)基混勻制成平板，每瓶菌懸液制3個重復平板，28 ℃培養(yǎng)3～5 d。

當培養(yǎng)出的菌落生長至直徑1 cm時，用接種針挑取菌絲尖端植入另一皿PDA培養(yǎng)基內培養(yǎng)；再重復上述操作2～3次即可作為純化菌種移入試管低溫保存。

1.2.2 真菌DNA提取 將試驗菌株接種于PDA液體培養(yǎng)基中，28 ℃、200 r·min-1振蕩培養(yǎng)2 d。過濾收集菌絲體，洗滌干燥，液氮研磨后轉移至EP管中，使用試劑盒提取基因組 DNA 作為PCR反應的模板。瓊脂糖凝膠電泳法檢測DNA。

1.2.3 ITS 序列擴增 真菌ITS區(qū)擴增通用引物為ITS-5（5-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3）和ITS-4（5-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3）。

PCR反應體系為50 μL：DNA模板2 μL；10×緩沖液5 μL；d NTP（每種2.5 mmol·L-1）2 μL；引物（10 μmol·L-1）各2 μL；Taq DNA 聚合酶（5 U·μL-1）0.4 μL；無菌水補足至50 μL。PCR反應程序為：95 ℃預變性5 min，然后94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，35個循環(huán)，72 ℃延伸10 min。反應結束后取5 μL PCR產(chǎn)物加1 μL 6×溴酚藍上樣緩沖液，在2%瓊脂糖凝膠上110 V電泳35 min，凝膠成像儀拍照。

1.2.4 ITS序列分析 測序交由生工生物工程（上海）股份有限公司進行，對所得序列進行BLAST分析[6]，采用Maximum Likelihood（ML）法構建系統(tǒng)發(fā)育樹，Bootstrap 重復500 次檢驗各分支的置信度，最終確定菌株的分類地位。

2 結果與分析

2.1 菌株的分離純化

病原菌分離樣品在PDA 培養(yǎng)基中28 ℃培養(yǎng)4 d后，有兩種顏色大小和菌落形態(tài)特征上都存在差異的菌落，一種菌落在培養(yǎng)基上生長良好，初為白色菌落，后變?yōu)榧t棕色菌落，氣生菌絲放射狀生長；另一種形成底色黃、孢子多且黑的菌落。分別對這兩種菌落進行純化。

2.2 ITS擴增后產(chǎn)物電泳

提取這兩種菌的DNA，以ITS-4和ITS-5為引物，進行PCR擴增，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，都獲得了約600 bp的條帶，與真菌ITS序列堿基大小范圍一致。

2.3 BALST比對結果

兩分離菌株測序結果在Ncbi上進行BALST分析。1號菌株序列長度為542 bp，BLAST GeneBank數(shù)據(jù)庫的基因序列顯示，其與Fusarium kyushuense strain BBA78012（AF414971.1）和Fusarium kyushuense strain NRRL3509（U85544.1）同源性達99%，通過MEGA7的CLUSTALW進行多序列比對并構建ML系統(tǒng)發(fā)育樹，如圖2顯示，1號菌株與Fusarium kyushuense strain BBA78012、Fusarium kyushuense strain NRRL3509、Fusarium kyushuense strain NRRL5348聚類在一起。因此，可以確定1號菌株為鐮孢菌屬（Fusarium）下的九州鐮孢菌（Fusarium kyushuense）。

九州鐮孢菌（F.kyushuense）對溫度、濕度、pH值等適應范圍很廣，可在5～40 ℃、pH值2～11條件下生長，分生孢子可在10～35 ℃產(chǎn)生，在70%～100%濕度下萌發(fā)，具有很強的環(huán)境生存能力。汪漢成等[7]在貴州煙區(qū)苗床上發(fā)現(xiàn)九州鐮孢菌引起烤煙苗期莖腐病，被侵染煙株表現(xiàn)出萎蔫、黃化，根系發(fā)育受阻等癥狀，隨著病情發(fā)展，煙苗最終從發(fā)病部位折倒而萎蔫死亡。

2號菌株序列長度為626 bp，BLAST GeneBank數(shù)據(jù)庫的基因序列顯示，其與Blakeslea sinensis strain CBS 564.91（JN206230.1）同源性達99%，通過MEGA7的CLUSTALW進行多序列比對并構建ML系統(tǒng)發(fā)育樹，如圖3顯示，2號菌株與Blakeslea sinensis strain CBS 564.91聚類在一起，構成一個分支，可信度為96%。因此，可以確定2號菌株為中國布拉氏霉菌（Blakeslea sinensise）。中國布拉氏霉菌是1986年在我國發(fā)現(xiàn)的一種霉菌[8]，對其進行的研究很少，未發(fā)現(xiàn)與煙葉病害有關的報道。

3 結論與討論

通過轉接法從煙草病害部位分離真菌菌株，結合ITS擴增和序列分析，對其進行鑒定。結果表明從煙草中分離、鑒定出來的優(yōu)勢真菌菌株為九州鐮孢菌（F. kyushuense）和中國布拉氏霉菌（B. sinensise），據(jù)報道九州鐮孢菌與烤煙苗期莖腐病有關，而未發(fā)現(xiàn)中國布拉氏霉菌與煙草病害有關的研究。

ITS 基因序列分析法從基因水平明確種屬分類，基因序列分析以核酸為基礎，受到外界環(huán)境影響較小，不依賴于形態(tài)觀察，無個體差異，結果偏差比表型鑒定小，是一種相對準確的鑒定方法。但由于目前真菌的核酸序列分析數(shù)據(jù)庫不完善，相似序列多[9]，ITS 序列并不能鑒定所有真菌，對ITS 同源性十分接近的真菌，可能出現(xiàn)分類錯誤[10]，需要做進一步的生物特性研究。

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