葦蘑液體培養(yǎng)條件的優(yōu)化

趙安 王翟 班立桐 黃海東 楊陽(yáng) 黃亮

摘 要：通過(guò)葦蘑菌絲體液體培養(yǎng)的單因素試驗(yàn)，初步確定葦蘑的較適生長(zhǎng)條件：pH值為5～7；溫度 25 ℃；轉(zhuǎn)速 100～200 r·min-1；裝液量50～90 mL。再經(jīng)正交試驗(yàn)對(duì)培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化，得出葦蘑的最適制種工藝為：初始pH值為6；溫度恒定為25 ℃；轉(zhuǎn)速保持150 r·min-1；裝液量為90 mL/250 mL。在該培養(yǎng)條件下，葦蘑的菌絲干質(zhì)量可達(dá)到19.4 g·L-1。在通氣量為4.5 L·min-1條件下進(jìn)行葦蘑液體菌種的5 L發(fā)酵罐培養(yǎng)，在44 h即達(dá)峰值19.9 g·L-1。

關(guān)鍵詞：葦蘑；液體培養(yǎng)；菌絲干質(zhì)量

中圖分類號(hào)：Q93-335 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A DOI 編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2016.09.033

Abstract： The optimum growth condition of liquid culture for Weimo was studied by the way of single factor test， including pH， temperature， rotating speed and liquid volume. The results showed that the range of growth conditions of Weimo are as follows： pH 5～7， temperature 25 ℃， rotating speed 100～200 r·min-1 and liquid volume 50～90 mL. Then the optimal spawn-making for Weimo was concluded by three factors three levels orthogonal experiment， and they are pH 6， temperature 25 ℃， rotating speed 150 r·min-1 and liquid volume 90 mL. Under the optimal growth condition， the dry weight of Weimo could reach 19.4 g·L -1. And Weimo spawns grew to a peak value 19.9 g·L -1 after cultured by 5 L fermenter， 4.5 L·min-1 ventilation， 44 h.

Key words： Weimo；liquid culture；mycelium dry weight

葦蘑為蠟傘科（Hygrophoropsidaceae）、擬蠟傘屬（Hygrophoropsis）蘑菇[1]，產(chǎn)于天津市寧河縣七里海地區(qū)蘆葦?shù)亍ＬJ林葦海中多年敗葉腐草厚積成為獨(dú)特的葦蘑生長(zhǎng)基質(zhì)，在悶熱的夏季形成特定濕度、溫度和光照環(huán)境，葦蘑才破土而出。葦蘑味道極其鮮美，香味濃郁，遠(yuǎn)勝于其他蘑菇，當(dāng)?shù)厝藗儾杉篚r食或曬干食用。近些年來(lái)，由于自然生態(tài)環(huán)境的變化，蘆葦長(zhǎng)勢(shì)大不如前，葦?shù)乩镄尾怀申幇党睗竦沫h(huán)境，葦蘑等也就很少見到[2]。

目前國(guó)內(nèi)外關(guān)于葦蘑的研究報(bào)道較少，班立桐等[3]初步研究了葦蘑不同溶劑粗提物組分的抗氧化活性，發(fā)現(xiàn)總提取物的抗氧化力最好，除總提取物外，葦蘑的乙酸乙酯可溶性組分總抗氧化力最高，葦蘑的脂溶性組分對(duì)超氧陰離子（O2-）清除能力低于水溶性組分，而對(duì)羥自由基（·OH）的清除能力相差不多。為了更好地保護(hù)這一珍貴的蘑菇品種，本課題組在獲得葦蘑快速生長(zhǎng)的液體培養(yǎng)基后，進(jìn)一步研究葦蘑液體培養(yǎng)的最適生長(zhǎng)條件，為更好地開發(fā)利用葦蘑提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 菌 種

葦蘑（Weimo）由天津農(nóng)學(xué)院農(nóng)學(xué)與資源環(huán)境學(xué)院生物技術(shù)系保藏。

1.2 培養(yǎng)基

（1）斜面培養(yǎng)基的制備[4-5]。取600 g草炭土，在一定量的清水中煮沸20～30 min，用4層紗布過(guò)濾，得濾液。向?yàn)V液中加入硫酸鎂、磷酸二氫鉀、蛋白胨、葡萄糖、瓊脂，待藥品溶化后，補(bǔ)足水分，分裝試管。

（2）液體培養(yǎng)基（g·L-1）：葡萄糖 15 g，乳糖 15 g，酵母膏 6 g，115 ℃滅菌20 min。

1.3 方 法

1.3.1 葦蘑培養(yǎng)條件的單因素試驗(yàn) （1）設(shè)置pH梯度為4、5、6、7、8、9，按照最適培養(yǎng)基的配方，每組配制6個(gè)搖瓶，每瓶裝液量為70 mL的培養(yǎng)基。接種完成后分別放入溫度為20，25，30 ℃的恒溫?fù)u床中震蕩培養(yǎng)，并觀察記錄。（2）將接種完成的三角瓶分別放入不同轉(zhuǎn)速（100，150，200 r·min-1）的恒溫?fù)u床中培養(yǎng)7 d。錐形瓶中長(zhǎng)出很多淡黃色的小菌球?yàn)樽罴裑3]。

1.3.2 葦蘑液體培養(yǎng)的正交試驗(yàn) 以葦蘑單因素試驗(yàn)結(jié)果為基礎(chǔ)設(shè)計(jì)了3因素3水平正交試驗(yàn)，以確定葦蘑的最適生長(zhǎng)條件。正交試驗(yàn)因素水平見表1[4]。

1.3.3 分析方法 待各試驗(yàn)組生長(zhǎng)出大量淡黃色小菌球時(shí)，取5 mL菌液稀釋檢測(cè)各組菌球數(shù)，并取等體積（50 mL）菌液測(cè)干質(zhì)量和多糖[6]。干質(zhì)量為離心后用蒸餾水沖洗菌絲3次置50 ℃烘箱中烘至恒質(zhì)量測(cè)得，多糖測(cè)定采用苯酚硫酸法。

2 結(jié)果與分析

2.1 培養(yǎng)溫度對(duì)葦蘑生長(zhǎng)的影響

通過(guò)在20，25，30 ℃ 3種不同溫度、150 r·min-1條件下培養(yǎng)葦蘑，7 d后各培養(yǎng)基中均長(zhǎng)出淡黃色的葦蘑菌球，檢測(cè)各組菌球數(shù)和干質(zhì)量，結(jié)果見圖1。

在不同溫度條件下的pH為6的試驗(yàn)組中菌絲干質(zhì)量分別為5，7.8，5.6 g·L-1，可以看出25 ℃下，菌絲干質(zhì)量最多。對(duì)比3個(gè)溫度環(huán)境下的各組試驗(yàn)，可知25 ℃有利于葦蘑生長(zhǎng)。

2.2 搖床轉(zhuǎn)速對(duì)葦蘑生長(zhǎng)的影響

葦蘑接種到在搖床轉(zhuǎn)速100，150，200 r·min-1條件下分別進(jìn)行培養(yǎng)7 d后，測(cè)得的菌絲干質(zhì)量見圖2。

對(duì)比不同轉(zhuǎn)速下的培養(yǎng)，可以推測(cè)出葦蘑的生長(zhǎng)需要一定的溶氧，轉(zhuǎn)速太低不利于葦蘑的生長(zhǎng)，150 r·min-1菌絲干質(zhì)量最高，而200 r·min-1比150 r·min-1條件下的菌絲干質(zhì)量略低，可見轉(zhuǎn)速太快不一定有利于葦蘑生長(zhǎng)。

2.3 初始pH對(duì)葦蘑生長(zhǎng)的影響

通過(guò)圖3可以看出，在同一溫度條件下pH值為6的試驗(yàn)組中菌球數(shù)、干質(zhì)量、多糖含量明顯高于其他試驗(yàn)組，并且各指標(biāo)變化趨勢(shì)基本相同。從圖3可以看出，pH趨于堿性時(shí)，葦蘑的干質(zhì)量逐漸減小，多糖含量及菌絲球數(shù)變化趨勢(shì)相同，可見葦蘑為一種酸性食用菌，但過(guò)酸和過(guò)堿均不利于菌體的生長(zhǎng)[7]。結(jié)果表明其最適生長(zhǎng)pH值在6左右，與羊肚菌液體發(fā)酵所需最適pH值相同[8]，而與適于樺褐孔菌液體發(fā)酵所需堿性pH值剛好相反[9]。

2.4 正交試驗(yàn)結(jié)果

2.4.1 極差分析 葦蘑經(jīng)過(guò)7 d的液體菌絲培養(yǎng)后進(jìn)行離心測(cè)菌體干質(zhì)量并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果見表2。經(jīng)單因素試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，菌絲球數(shù)及多糖含量與菌體干質(zhì)量正相關(guān)，故此處只列出各試驗(yàn)組的菌絲干質(zhì)量。

由表2中的極差R可以看出， 初始pH對(duì)葦蘑生長(zhǎng)的影響最大，其次為裝液量及轉(zhuǎn)速。從表中得出最優(yōu)組合為A2B3C2，即pH 6，裝液量 90 mL，轉(zhuǎn)速 150 r·min-1。這與試驗(yàn)組中的最大值6號(hào)組合A2B3C1不一致，有必要進(jìn)行一次驗(yàn)證試驗(yàn)，以確定葦蘑的最適生長(zhǎng)條件。

2.4.2 驗(yàn)證試驗(yàn) 將正交試驗(yàn)極差分析的最優(yōu)組合A2B3C2和試驗(yàn)組合A2B3C1進(jìn)行重復(fù)試驗(yàn)，每組接種4瓶，經(jīng)7 d培養(yǎng)后對(duì)菌絲干質(zhì)量進(jìn)行記錄、分析，結(jié)果見表3。

由表3可知，試驗(yàn)組合A2B3C2條件下的葦蘑菌絲干質(zhì)量均值高于試驗(yàn)組合A2B3C1，即A2B3C2條件更適合葦蘑生長(zhǎng)，葦蘑的最適液體培養(yǎng)條件是：pH 值為6、溫度 25 ℃、裝液量 90 mL、轉(zhuǎn)速150 r·min-1。

2.4 通氣量對(duì)葦蘑液體培養(yǎng)的影響

以10%的接種量進(jìn)行葦蘑液體菌種的5 L發(fā)酵罐通氣培養(yǎng)，設(shè)定通氣量為3，4.5，6 L·min-1進(jìn)行比較試驗(yàn)，過(guò)程曲線見圖4。

由圖4可見，葦蘑的發(fā)酵罐培養(yǎng)后的干質(zhì)量在44～48 h即達(dá)到峰值，時(shí)間遠(yuǎn)遠(yuǎn)短于搖瓶培養(yǎng)，可見發(fā)酵罐培養(yǎng)條件優(yōu)于搖瓶。不同的通氣量條件下，葦蘑的生長(zhǎng)情況差異比較大，通氣量由3 L·min-1增大至4.5 L·min-1后，菌體的干質(zhì)量得到了大幅度提升，而進(jìn)一步增大至6 L·min-1后，菌體干質(zhì)量反而出現(xiàn)下降趨勢(shì)。通氣量可控制發(fā)酵罐中的溶氧處于合適的范圍，進(jìn)而促進(jìn)菌體的快速增長(zhǎng)及生長(zhǎng)得率的增加[10]，葦蘑的液體菌種培養(yǎng)在適量的通氣量條件下生長(zhǎng)，于44 h可達(dá)峰值19.91 g·L -1，達(dá)峰值的時(shí)間遠(yuǎn)低于常見的珍稀食藥用菌如杏鮑菇、桑黃、荷葉離褶傘等的6～8 d[11-13]。

3 結(jié)論與討論

葦蘑為具有天津“肺葉”之稱的七里海濕地的特色資源，其產(chǎn)出不僅需要特定的地理環(huán)境，還需要獨(dú)特的氣候條件。野生葦蘑生長(zhǎng)于茂密的蘆葦根部，采集非常困難，采集者有時(shí)在密集的蘆葦叢中尋覓幾小時(shí)而不得一子實(shí)體，而且葦蘑不一定每年均有產(chǎn)出，氣候條件的變化導(dǎo)致幾年都采集不到是常有的事。葦蘑的稀少及獨(dú)特的味道促使這一野生資源2015年售價(jià)達(dá)4 000元·kg-1，而且往往價(jià)高而貨缺。

七里海是華北大地渤海之濱的一顆璀璨明珠，七里海因南北寬 7 華里而得名，又名七里淀，古屬神州九十九淀之一。古稱七里海為“七里煙波”，屬寧河八景之一。它在 20 世紀(jì) 60 年代以前曾有過(guò)幾千年輝煌的歷史，是津京唐三角地帶極其難得的一片綠洲，是天津?yàn)I海地區(qū)既大又美的后花園，是我國(guó)第一個(gè)也是唯一的古海岸與濕地同處一地的國(guó)家級(jí)自然保護(hù)區(qū)，還是世界著名三大古海岸之一[14]。從20 世紀(jì)70 年代開始，由于濕地生態(tài)系統(tǒng)的脆弱性，加上人們?cè)趯?duì)濕地資源的開發(fā)中存在著許多不合理，極大地影響了濕地生態(tài)環(huán)境，破壞了生態(tài)平衡。七里海濕地的面積不斷縮小，水源逐漸枯竭，植物群落嚴(yán)重衰頹。尤其是蘆葦，在充足的熱量和水分條件組合下，長(zhǎng)勢(shì)良好，植株高大，莖桿粗壯，生長(zhǎng)茂密，曾覆蓋了70%～80%的沼澤面積，形成綠色的蘆林葦海[15]。由于沼澤面積縮小、土質(zhì)退化和干旱無(wú)水，蘆葦?shù)拈L(zhǎng)勢(shì)也嚴(yán)重衰退，棲身蘆葦?shù)氐娜斈⒁仓鹉隃p少。此外，人為采集的增加，導(dǎo)致幼齡菇未完成生理成熟期即夭折，長(zhǎng)此以往，蘆葦?shù)赜捎谌狈θ斈㈡咦拥拇婕斈⒚媾R滅絕的危險(xiǎn)。

為延續(xù)葦蘑的資源再生，多年來(lái)很多學(xué)者一直在研究人工栽培葦蘑技術(shù)，目前未有成功。筆者所在研究室長(zhǎng)期研究葦蘑，以期通過(guò)液體發(fā)酵模式開發(fā)葦蘑產(chǎn)品，并對(duì)七里海地區(qū)的物種保護(hù)作一份貢獻(xiàn)。在不同pH值、溫度、轉(zhuǎn)速、裝液量下對(duì)葦蘑進(jìn)行搖瓶振蕩恒溫培養(yǎng)，通過(guò)正交試驗(yàn)對(duì)培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化，確定出葦蘑的最適合液體制種工藝。在該工藝條件下，葦蘑的菌絲干質(zhì)量達(dá)到最大值：19.4 g·L -1，是未優(yōu)化前的3.9倍。通氣量為4.5 L·min-1條件下進(jìn)行葦蘑液體菌種的5 L發(fā)酵罐培養(yǎng)，在44 h即達(dá)峰值，制種時(shí)間可大幅度縮短。

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