Box-Behnken響應面法優化川佛手揮發油的超臨界CO2萃取工藝Δ

陳斯瑋，王　芳，章　卓，張　丹（西南醫科大學藥學院，四川瀘州　646000）

Box-Behnken響應面法優化川佛手揮發油的超臨界CO2萃取工藝Δ

陳斯瑋＊，王芳，章卓，張丹#（西南醫科大學藥學院，四川瀘州646000）

目的：優化川佛手揮發油成分超臨界CO2萃取的提取工藝。方法：以揮發油得率為指標，分別考察萃取溫度、萃取壓力、CO2流量、萃取時間、分離壓力和分離溫度等單因素對川佛手揮發油得率的影響。在此基礎上，選取影響顯著的萃取溫度、萃取壓力、CO2流量和萃取時間4個因素，采用Box-Behnken響應面法優化超臨界CO2萃取工藝參數。結果：在萃取溫度67、萃取壓力57 MPa、CO2流量22 L/h和萃取時間4 h時，川佛手揮發油超臨界CO2萃取得率最高，達到1.892%（n＝3），與預測值（1.937%）的相對誤差為2.32%。結論：優選的川佛手揮發油的超臨界CO2萃取工藝合理、可行。

Box-Behnken響應面法；川佛手；揮發油；超臨界CO2萃取

中藥佛手Citrisarcodactylis fructus始載于《本草綱目》，為蕓香科植物佛手Citrus Medica L.var sarcodactylis Swingle的干燥果實。佛手因產地不同有廣佛手、川佛手、金佛手之分。川佛手為四川道地中藥材，具有疏肝理氣、和胃止痛、燥濕化痰之功效[1]。揮發油為川佛手主要的藥效成分，具有抗腫瘤、抑制黑色素、抗菌、抗氧化、提高免疫力、止咳平喘等作用[2-4]。現代藥理研究發現，佛手揮發油對人肝癌Hep3B、Huh7，骨髓瘤SP20，肺癌A549，人胰腺癌PANC-28，黑色素瘤B16，人乳腺癌MDA-MB-435等瘤株均有不同程度的抗腫瘤活性[5-6]。如何有效提高川佛手萃取過程中的揮發油含量，一直是川佛手研究的熱點。因此，在本研究中筆者以川佛手揮發油的得率為考察指標，采用Box-Behnken響應面法對其超臨界CO2萃取工藝參數進行優化[7-8]，為改進川佛手揮發油生產工藝奠定基礎。

1　材料

1.1儀器

HA221-50-01超臨界流體萃取設備（江蘇南通華安超臨界萃取有限公司）；ZWH-2S機械粉碎機（河南天鴻機械廠）；DYYB-10系列臺式冷凍干燥機（上海德洋意邦儀器有限公司）；恒平HT12電子臺秤（無錫市恒平工業設備有限公司）。

1.2藥材與試劑

川佛手（瀘州天植中藥飲片有限公司，批號：20150405-009）經西南醫科大學生藥教研室莊元春副教授鑒定為蕓香科植物佛手Citrus Medica L.var sarcodactylis Swingle的干燥果實；CO2（瀘州客隆生物技術有限公司，純度：＞99.9%）。

2　方法與結果

2.1藥材的處理與揮發油得率的計算

將新鮮川佛手果經冷凍干燥后粉碎，過60目篩備用。每次精密稱定100 g川佛手粉末裝入超臨界萃取裝置，收集分離產物并計算揮發油得率。揮發油得率（%）＝揮發油質量（g）/川佛手生藥質量（g）×100%。

2.2單因素試驗考察

根據相關文獻及預試驗結果[9-12]，預先設定萃取溫度為80、萃取壓力為50 MPa、分離溫度為50、分離壓力為15 MPa、CO2流量為20 L/h、萃取時間為3 h。之后保持其他因素不變，依次改變萃取壓力為10、30、50、70、90 MPa，萃取溫度為50、65、80、95、110，CO2流量為10、20、30、40、50 L/h，分離壓力為10、15、20、25、30 MPa，分離溫度為25、35、45、55、65、75，萃取時間為1、2、3、4、5 h，考察上述因素對揮發油得率的影響。單因素試驗考察結果見圖1。

圖1　各因素對揮發油得率的影響a.萃取壓力；b.萃取溫度；c.CO2流量；d.分離壓力；e.分離溫度；f.萃取時間Fig 1　Effects of factors on the yield of volatile oila.extraction pressure；b.extraction temperature；c.CO2flow；d.separation pressure；e.separation temperature；f.extraction time

由圖1a可見，揮發油得率隨萃取壓力的升高逐漸增加，當萃取壓力達到50 MPa后增加趨勢逐漸變緩，故選擇萃取壓力為50 MPa。由圖1b可見，揮發油得率隨萃取溫度的上升逐漸增加，當萃取溫度達到65時得率最大，之后則逐漸降低，出現這一現象的原因可能是溫度過高，揮發油損耗增加，從而導致得率下降，故選擇萃取溫度為65。由圖1c可見，揮發油得率隨CO2流量的增大逐漸增加，當CO2流量達到20 L/h后增加趨勢逐漸變緩，故選擇CO2流量為20 L/h。由圖1d和圖1e可見，分離壓力和分離溫度對揮發油得率的影響較小。由圖1f可見，揮發油得率與萃取時間成正相關，且1～3 h內增加明顯，3 h后增加趨勢逐漸變緩，故選擇萃取時間為3h。

2.3Box-Behnken響應面法優化揮發油提取工藝

在單因素試驗結果基礎上，采用Box-Behnken響應面法設計試驗，以萃取壓力（A，MPa）、萃取溫度（B，）、CO2流量（C，L/ h）、萃取時間（D，h）4個因素為響應因子，以川佛手揮發油得率（%）為響應值進行試驗。因素與水平見表1，正交試驗設計與結果見表2，方差分析結果見表3。

表1　因素與水平Tab 1　Factors and levels

表2　正交試驗設計與結果Tab 2　Design and results of test

利用Design-Expert 8.0.6軟件對表2試驗數據進行多元回歸擬合，設4個因素29個試驗，零點試驗重復5次。由表3方差分析結果可得出，影響揮發油得率的主次因素順序為：A＞D＞C＞B；A、C、D、BC、A2、C2、B2對揮發油得率的影響有統計學意義（P＜0.05）。揮發油得率的回歸方程Y＝1.86+0.82A+ 0.025B+0.064C－0.071D+0.073AB+0.030AC－0.066AD+ 0.042BC+0.028BD－0.018CD+0.33A2－0.17B2+0.054C2+ 0.037D2（R2＝0.896 8）。模型P＝0.000 1＜0.001，說明各響應值對該模型的影響是顯著的。失擬項P＝0.099 7＞0.05，為不顯著，說明回歸方程和試驗擬合情況好，試驗誤差小，未知因素對試驗結果影響較小，可應用該回歸方程對不同萃取條件下川佛手揮發油得率進行預測。通過回歸方程預測的揮發油萃取的最優工藝條件為：萃取壓力56.68 MPa、萃取溫度67.33、CO2流量22.14 L/h，萃取時間4 h。在此條件下，預測川佛手揮發油得率為1.937%。

表3　方差分析結果Tab 3　Results of variance analysis

當萃取壓力、萃取溫度、CO2流量和萃取時間中有2個因素為固定值時，繪制其他2個因素及其交互作用對揮發油得率影響的響應面及等高線圖。其中，以CO2流量與萃取溫度的交互作用較顯著，結果見圖2，其余因素交互作用不顯著（圖略）。

圖2　CO2流量與萃取溫度對揮發油得率影響的三維響應面圖和等高線圖Fig 2　Three-dimensional response surface and contour of the CO2flow and extraction temperature on the extraction rate of volatile oil

2.4驗證試驗

結合生產實際，最終確定川佛手揮發油的超臨界CO2萃取工藝條件為：萃取壓力57 MPa，萃取溫度67，CO2流量22 L/ h，萃取時間4 h。按此條件分別進行了3次驗證試驗，結果川佛手揮發油得率的平均值為1.892%（RSD＝0.68%，n＝3），與預測值（1.937%）相比，相對誤差為2.32%。實測值與預測值接近，說明模型可靠。

3　討論

中藥揮發油成分的萃取，目前主要有水蒸氣蒸餾、微波提取法、壓榨法、溶劑法以及超臨界萃取法，尤其是近年來興起的超臨界CO2萃取法，具有效率高、萃取速度快、工藝和操作簡單等優點，適合于一些對熱敏感、容易氧化分解破壞的成分的提取和分離。在最優工藝條件下，可以將所需成分幾乎完全提出，從而提高產品的回收率和資源的利用率[13-14]。同時，由于萃取工藝簡單、無污染，分離后的超臨界流體經精制可循環使用，故其在工業化生產中應用越來越廣泛。響應面法作為一種有效的試驗設計方法，可進行多因素多水平試驗研究，并可研究因素間的交互作用，根據綜合指標得到最優工藝，避免了常規正交設計試驗只能對單個因素水平進行分析以及無法給出直觀圖形的缺陷[15]。在揮發油萃取領域，超臨界CO2萃取技術與響應面法的結合在中藥生產研究中有著廣泛的應用。因此在本試驗中，筆者利用響應面法中Box-Behnken模式設計，以川佛手揮發油得率為指標，運用響應面法考察萃取壓力、萃取溫度、CO2流量和萃取時間4個主要因素對川佛手揮發油超臨界CO2萃取工藝的影響，并對提取工藝條件進行優化，取得了較好的結果。

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（編輯：劉明偉）

Optimization of SFE-CO2Extraction Technology of Volatile Oil from Citrisarcodactylis fructus by Box-Behnken-response Surface Methodology

CHEN Siwei，WANG Fang，ZHANG Zhuo，ZHANG Dan（College of Pharmacy，Southwest Medical University，Sichuan Luzhou 646000，China）

OBJECTIVE：To optimize SFE-CO2extraction technology of volatile oil from Citrisarcodactylis fructus.METHODS：Using the yield of volatile oil as index，the influences of extraction temperature，extraction pressure，CO2flow，extraction time，acquisition pressure and acquisition temperature on the yield of volatile oil were investigated.Moreover，4 significant factors，such as extraction temperature，extraction pressure，CO2flow and extraction time，were selected；the parameters of SFE-CO2extraction technology were optimized by Box-Behnken design-response surface methodology.RESULTS：The results showed that the highest extraction rate could be obtained with extraction temperature at 67，extraction pressure at 57 MPa，CO2flow at 22 L/h and extraction time for 4 h.The highest extraction rate was 1.892%（n＝3），and the relative error between it and predicted value（1.937%）was 2.32%.CONCLUSIONS：Optimized SFE-CO2extraction technology for volatile oil from C.fructus is reasonable and feasible.

Box-Behnken-response surface methodology；Citrisarcodactylis fructus；Volatile oil；SFE-CO2extraction

R284.2

A

1001-0408（2016）28-3973-03

10.6039/j.issn.1001-0408.2016.28.26

四川省教育廳科研項目（No.16ZB0205）

＊講師，碩士。研究方向：中藥新制劑、新工藝。電話：0830-3190325。E-mail：6746763@qq.com

副教授，博士。研究方向：中藥制劑與炮制。E-mail：393335427@qq.com

（2016-01-04

2016-08-16）