腦蛋白水解物的提取工藝優化

黃　潔，王孝功，單　敏，田福元（.西安市食品藥品檢驗所，西安　70054；.西安迪賽生物藥業有限責任公司，西安　7006；.陜西萬信醫藥采購供應站，陜西咸陽　70065）

腦蛋白水解物的提取工藝優化

黃潔1＊，王孝功2，單敏1，田福元3（1.西安市食品藥品檢驗所，西安710054；2.西安迪賽生物藥業有限責任公司，西安710016；3.陜西萬信醫藥采購供應站，陜西咸陽710065）

目的：優化腦蛋白水解物的提取工藝。方法：以pH約為9的堿性提取液進行提取；以總氮含量、與腦蛋白水解物（麗珠賽樂）肽圖的相似度的綜合評分為指標，通過L9（34）正交試驗優化豬腦（1 kg）水解工藝中胰蛋白酶的加入量、胃蛋白酶的加入量及水解時間，并進行工藝驗證試驗。結果：最優提取工藝為胰蛋白酶加入量8 g、胃蛋白酶加入量5 g、水解時間12 h；驗證試驗中所制腦蛋白水解物的總氮含量分別為5.20、5.18、5.20 mg/ml（RSD＝2.22%，n＝3），肽圖相似度分別為93%、94%、96%（RSD＝1.62%，n＝3），綜合評分分別為0.911、0.917、0.932（RSD＝1.18%，n＝3）。結論：優化的生產工藝合理、提取效率高，產物肽圖相似度高。

腦蛋白水解物；提取工藝；正交試驗；總氮含量；肽圖相似度

腦蛋白水解物注射液是一種豬腦蛋白水解提取物，為多種游離氨基酸和低分子肽的混合注射液，是一種神經保護劑。其具有神經營養和神經保護的類似神經生長因子的作用[1]，主要用于治療顱腦外傷及腦血管病等引起的記憶力減退及注意力集中障礙，輔助治療腦功能不全，也用于治療神經衰弱、蛋白質缺乏及蛋白質消化吸收障礙等[2]。本文以總氮含量和與腦蛋白水解物（麗珠賽樂）肽圖的相似度為指標，優化了從豬腦中提取腦蛋白水解物的工藝，以期建立一種重現性好、腦蛋白水解物活性更高的生產工藝。

1　材料

1.1儀器

1260型高效液相色譜儀（美國Agilent公司）；MK3型酶標儀（美國Thermo公司）；DK-S420型電熱恒溫水箱（上海慕航儀器設備有限公司）；Pall minimate超濾系統（美國Pall公司）；L-600型離心機（湘儀離心機儀器有限公司，離心半徑：16 cm）；DS-1型組織粉碎機（上海比朗儀器有限公司）。

1.2藥品與試劑

腦蛋白水解物注射液（商品名：麗珠賽樂，麗珠集團麗珠制藥廠，批號：20140809321，規格：5 ml/支）；胰蛋白酶（批號：141043，活性：＞2 500 U/mg）、胃蛋白酶（批號：140821，活性：＞3 800 U/mg）均購自四川德博爾制藥有限公司；乙腈為色譜純；乙醇、鹽酸、氫氧化鈉、三氟乙酸均為分析純。

1.3其他

豬腦（方欣肉聯廠）。

2　方法與結果

2.1滴定法測定總氮含量

參照注射用腦蛋白水解物征求意見稿[3]，取腦蛋白水解物，加水稀釋至適宜濃度，作為供試品溶液，依法測定[4]。精密量取供試品溶液約2 ml，置于燒瓶中，加入硫酸銅試液2滴，再加入濃硫酸5 ml，小火消化4 h，放冷。全部轉移至蒸餾瓶中，加入40%氫氧化鈉溶液10 ml。取2%硼酸溶液10 ml，置于100 ml錐形瓶中，加甲基紅-溴甲酚綠混合指示液5滴，將冷凝管尖端插入液面下，加熱，進行蒸汽蒸餾，至硼酸溶液開始由酒紅色變為藍綠色時起，繼續蒸餾約10 min后，將冷凝管尖端提出液面，使蒸汽繼續沖洗約1 min，用水淋洗尖端后停止蒸餾。餾出液用硫酸滴定液（0.005 mol/L）滴定至溶液由藍綠色變為灰紫色，并將滴定的結果用空白試驗校正。每1 ml硫酸滴定液（0.005mol/L）相當于0.1401mg的氮。

2.2高效液相色譜法測定腦蛋白水解物的條件

參照注射用腦蛋白水解物征求意見稿[3]，精密取麗珠賽樂適量，加水溶解并稀釋制成每1 ml中約含總氮6 mg的溶液，作為對照品溶液。色譜條件：C18（250 mm×4 mm，5 μm），以0.1%三氟醋酸溶液為流動相A，0.085%三氟醋酸乙腈溶液-0.1%三氟醋酸溶液（80∶20）為流動相B，梯度洗脫，流速為0.8 ml/min，檢測波長為276 nm，進樣量為20 μl。精密量取供試品或對照品溶液各20 μl，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖，以中藥指紋圖譜相似度評價系統[4]考察其相似度。梯度洗脫程序見表1。

表1　梯度洗脫程序Tab 1　Conditions of gradient elution

2.3以總氮含量和肽圖相似度為指標篩選腦蛋白水解物提取試劑

按照豬腦-提取試劑1∶3的比例向豬腦中分別加入pH約為3～4的鹽酸溶液（酸性提取試劑）、pH近中性的純化水（中性提取試劑）及pH約為9的氫氧化鈉溶液（堿性提取試劑），于37水浴孵化30 min，4 000 r/min（離心半徑為16 cm）離心20 min，取上清液。

2.3.1總氮含量按“2.1”項下方法分別測定經酸性、中性、堿性提取試劑提取后的上清液中的總氮含量。結果分別為1.16、4.98、5.21 mg/ml，表明堿性提取試劑提取的上清液中總氮含量最高。

2.3.2肽圖相似度按“2.2”項下方法分別測定酸性、中性、堿性提取試劑提取后的上清液和麗珠賽樂的高效液相色譜圖，色譜圖見圖1。

圖1　高效液相色譜圖Fig 1　HPLC chromatograms

經中藥指紋圖譜相似度評價系統評價，酸性、中性、堿性提取試劑提取后的上清液與麗珠賽樂的相似度分別為8%、9%、13%，表明堿性條件下相似度最高。最終確定提取試劑為pH約為9的氫氧化鈉溶液。

2.4正交試驗優化腦蛋白水解物提取工藝

2.4.1因素與水平的確定為了進一步提高提取后上清液中總氮含量，將提取后上清液分別采用胰蛋白酶、胃蛋白酶水解一定時間。取提取后的上清液用氫氧化鈉溶液調pH為8.5～9.5，加入胰蛋白酶水解t1時間，再用稀鹽酸調節pH至1～2，加入胃蛋白酶水解t2時間。胰蛋白酶和胃蛋白酶水解總時間（t1+ t2）即水解時間，t1∶t2＝3∶1。采用L9（34）正交試驗優化豬腦（1 kg）水解工藝中胰蛋白酶的加入量（A，g）、胃蛋白酶的加入量（B，g）及水解時間（C，h），因素與水平見表2。

表2　因素與水平Tab 2　Factors and levels

2.4.2正交試驗設計與結果根據“2.4.1”項下因素與水平，以總氮含量與麗珠賽樂肽圖的相似度的綜合評分為指標優化提取工藝，其中總氮含量權重占30%，相似度權重占70%。將含總氮6 mg/ml作為1，測定出的總氮含量按此標準換算并乘以權重占有比例即為總氮的分值。將肽圖輸入中藥指紋圖譜相似度評價系統，給出的相似度作為肽圖的分值，乘以權重占有比例即為肽圖的分值。2項分值之和即為綜合評分結果。正交試驗設計與結果見表3，方差分析結果見表4。

表3　正交試驗設計與結果Tab 3　Orthogonal design and results

表4　方差分析結果Tab 4　Result of variance analysis

由表3和表4可知，3因素對綜合評分影響的強弱依次為A＞B＞C，其中A和B對綜合評分有顯著影響（P＜0.05）。綜合考慮，最優提取工藝為A3B2C3，即豬腦（1 kg）水解工藝中胰蛋白酶加入8g、胃蛋白酶加入5g、水解時間12h。

2.4.3驗證試驗按照最優提取工藝提取豬腦蛋白水解物，重復試驗3次，分別測定提取液中總氮含量，比較與麗珠賽樂肽圖的相似度，計算綜合評分。結果平均總氮含量為5.19 mg/ml（RSD＝2.22%，n＝3），平均肽圖相似度為94.33%（RSD＝1.62%，n＝3），平均綜合評分為0.92（RSD＝1.18%，n＝3）。驗證試驗結果見表5。

2.5純化工藝

腦蛋白水解物提取液首先采用5 kDa超濾膜包超濾，收集透過液后進一步層析柱純化。首先采用反相色譜，C8柱（250 mm×21.2 mm，10 μm），以0.1%三氟醋酸溶液為流動相A，0.085%三氟醋酸乙醇溶液-0.1%三氟醋酸溶液（85∶15）為流動相B（先以B相流洗2個柱體積，再以A相平衡5個柱體積，上樣，A相流洗約2個柱體積，12%B洗脫約1.5個柱體積，洗脫峰丟棄，35%B相洗脫約2個柱體積，收集洗脫峰），流速為100 ml/min。收集的洗脫液繼續采用G25層析柱進行脫鹽，先用流動相注射用水平衡色譜柱約10個柱體積，上樣，繼續用注射用水流洗，收集色譜峰，即為腦蛋白水解物提取液樣品。測定其總氮含量并與麗珠賽樂肽圖進行比較，結果，總氮含量為10.52 mg/ml（RSD＝1.1%，n＝3），肽圖相似度均大于95%。

表5　驗證試驗結果Tab 5　Results of verification test

2.6腦蛋白水解物活力的比較

參照注射用腦蛋白水解物征求意見稿[3]進行測定。比較麗珠賽樂與按本文方法制備的3批腦蛋白水解物的活力，結果進行配對t檢驗。結果顯示，上述腦蛋白水解物的活力分別為（57.96±4.44）%、（95.77±7.09）%、（97.23±8.08）%、（92.51± 6.74）%，與麗珠賽樂比較的P均小于0.05，表明本文方法制備的腦蛋白水解物的活力更高。

3　討論

腦蛋白水解物注射液是以新鮮的豬腦為原料，經過提取、酶解、超濾等過程制成的無菌制劑，主要成分為腦神經肽、各種氨基酸，臨床上主要用于顱腦損傷、腦血管后遺癥狀的改善等，療效確切，臨床應用廣泛[5-6]。原國家食品藥品監督管理局于2008年12月15日發布的《關于加強腦蛋白水解物注射液監督檢查的通知》（國食藥監辦〔2008〕734號）[7]指出在全國開展的注射劑類藥品生產工藝和處方核查工作中發現，腦蛋白水解物注射劑在藥品標準和執行工藝處方等方面存在著較為突出的問題，主要是企業選用豬腦原料的質量標準不完善；企業之間現行生產工藝差別較大；豬腦水解所用的蛋白酶種類、酶量及水解溫度、時間等不一致，甚至有補加氨基酸的行為。這些行為大大降低了腦蛋白水解物注射液的療效，同時導致不良反應大大增加[8]。本研究以麗珠賽樂作為對照品，以肽圖相似度、總氮含量為指標，通過對提取試劑的選取、水解工藝的優化，結合層析工藝，生產出了比麗珠賽樂總氮含量更高、活力更強的腦蛋白水解物。連續3次的中試生產表明，本工藝穩定可控，可以用于腦蛋白水解物的生產。

與采用超濾工藝的常規腦蛋白水解物的生產工藝相比，本研究在超濾工藝的基礎上增加了層析工藝。層析工藝一般多用于基因工程產品，如蛋白質及多肽、疫苗等的純化，用于去除雜質、內毒素、病毒等，具有操作條件溫和、效率高、重現性好的特點。常用的層析工藝包括離子離子交換色譜（IEC）、反相液相色譜、親和色譜（Affinity chromatography）、凝膠過濾色譜（Gel filtration chromatography）等。生化藥大多來源于新鮮的動物臟器，有效成分復雜。根據生化藥的這個特點，結合腦蛋白注射液的質量研究標準征求意見稿，本研究優選采用反相液相色譜和凝膠過濾色譜。根據多肽、氨基酸等的疏水性，以C8（250 mm×21.2 mm，10 μm）制備色譜柱首先純化出具有生物活性的腦蛋白產品，然后進一步采用G25進行凝膠層析，不但可以去除反相液相色譜中引入的有機試劑，同時也去除了原料及前述操作過程中可能引入的內毒素等物質，進一步提升了產品的安全性。相比生化藥生產常用的超濾過程，本操作雖然具有使用成本高的缺點，但其生產的產品具有均一性好、各成分相對恒定的特點，為腦蛋白水解物的質量控制及有效性的進一步研究打下了堅實基礎，為規范腦蛋白水解物注射液的生產工藝奠定了基礎。

[1]于秀軍，楯林義孝，郭力.腦蛋白水解物注射液對NG2蛋白聚糖陽性神經祖細胞分化的影響[J].腦與神經疾病雜志，2010，18（1）：21.

[2]鄧鋒，梁蔚陽.氨基酸分析法測定腦蛋白水解物注射液中肽的含量[J].藥物分析雜志，2010，30（10）：2001.

[3]國家藥典委員會.關于注射用腦蛋白水解物國家標準的公示[ED/OL].（2015-11-26）[2016-01-04].http：//www. chp.org.cn/view/ff80808150c920700151427525de75ef?a= BZHXYP.

[4] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典：四部[S].2015年版.北京：中國醫藥科技出版社，2015：59-61，88-89.

[5]Ubhi K，Rockenstein E，Vazquez-roque R，et al.Cerebrolysin modulates pronerve growth factor/nerve growth factor ratio and ameliorates the cholinergic deficit in a transgenic model of Alzheimer’s disease[J].J Neurosci Res，2013，91（2）：167.

[6]Panisset M，Gauthie RS，Moessle RH，et al.Cerebrolysin in Alzheimer’s disease：a randomized，double-blind，placebocontrolled trial with a neurotrophic agent[J].J Neural Transm，2002，109（7/8）：1089.

[7]國家食品藥品監督管理局.關于加強腦蛋白水解物注射液監督檢查的通知[S].2008-12.

[8]楊彥彪，張志葉，魏春華.腦蛋白水解物制劑的質量標準及不良反應[J].中國藥房，2012，23（1）：82.

（編輯：鄒麗娟）

Optimization of the Extraction Technology of Cerebroprotein Hydrolyzate

HUANG Jie1，WANG Xiaogong2，SHAN Min1，TIAN Fuyuan3（1.Xi’an Institute for Food and Drug Control，Xi’an 710054，China；2.Xi’an Disai Biological Pharmaceutical Co.，Ltd.，Xi’an 710016，China；3.Shaanxi Wanxin Medicine Procurement and Supply Station，Shaanxi Xianyang 710065，China）

OBJECTIVE：To optimize the extraction technology of cerebroprotein hydrolyzate.METHODS：It was extracted by alkaline extraction solution with pH approximately 9；using the comprehensive score of similarities of total nitrogen content and peptide map of cerebroprotein hydrolyzate（cerebrolisin）as index，L9（34）orthogonal test was conducted to optimize the addition amounts of trypsin and pepsin，and hydrolysis time in pig brain（1 kg）hydrolysis technology，and the optimized technology was verified.RESULTS：Optimized extraction technology was as follows as trypsin adding 8 g，pepsin adding 5 g，hydrolysis time 12 h；the total nitrogen contents of obtained cerebroprotein hydrolyzate were 5.20，5.18，5.20 mg/ml（RSD＝2.22%，n＝3），peptide figure similarities were 93%，94%，96%（RSD＝1.62%，n＝3），comprehensive scores were 0.911，0.917，0.932（RSD＝1.18%，n＝3），respectively.CONCLUSIONS：The optimized technology is rational with high extraction rate and peptide map similarity.

Cerebroprotein hydrolyzate；Extraction technology；Orthogonal test；Total nitrogen content；Peptide map similarity

R977.4；R943

A

1001-0408（2016）28-3985-03

10.6039/j.issn.1001-0408.2016.28.30

＊主管藥師，碩士。研究方向：化學藥物分析。電話：029-85533639。E-mail：hj810726@126.com

（2016-02-06

2016-05-20）